全 文 :基金项目:国家自然科学基金(81273873)
作者简介:朱 明(1960-),女,硕士,高级实验师,研究方向:感染免疫。
通信作者:田树革,博士,教授,博士生导师,研究方向:中药资源化学与质量标准,E-mail:tsgyz@sina.com。
·基础医学研究·
破布木果提取物对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用
朱 明1,欧亮苗2,何巧丽2,哈木拉提·吾甫尔2,田树革2
(新疆医科大学1基础医学院,2中医学院,乌鲁木齐 830011)
摘要:目的 研究破布木果提取物对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用。方法 不同浓度的破布木果提取物对
刀豆蛋白A(concanavalin A,ConA)、脂多糖试剂(LPS)体外处理的小鼠脾淋巴细胞的作用;采用 MTT法测定淋巴
细胞的增殖能力。结果 破布木果提取液在2.69~86mg/mL范围内,均与ConA、LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞
的增殖在体外具有协同作用;破布木果多糖在21.50~86mg/mL范围内,与ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞的增殖
在体外具有协同作用;在10.75~86mg/mL范围内,与LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞的增殖在体外具有协同作用;
迷迭香酸标准品作为药物的阳性对照,均与ConA、LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞的增殖在体外具有协同作用。结
论 初步明确破布木果提取液、破布木果多糖、迷迭香酸标准品具有一定的免疫调节作用。
关健词:破布木果;提取物;免疫调节
中图分类号:R961 文献标识码:A 文章编号:1009-5551(2015)01-0035-04
doi:10.3969/j.issn.1009-5551.2015.01.008
Proliferative effects of extracts fromCordia dichotoma seeds on
spleen lymphocytes in mice
ZHU Ming1,OU Liangmiao2,HE Qiaoli 2,Halmuart Upur2,TIAN Shuge2
(1 College of Preclinical Medicine,2 College of Traditional Chinese Medicine,
Xinjiang Medical University,Urumqi 830011,China)
Abstract:Objective To investigate the proliferative effects of extracts fromCordia dichotoma seeds on
spleen lymphocytes of mice.Methods Detect the effects of the extracts with different concentrations from
Cordia dichotomaseeds on mouse spleen lymphocytes by concanavalin A (ConA)and lipopolysaccharide
(LPS)in vitro treatment;Detect the proliferation ability of lymphocyte by MTT assay.Results The ex-
tracts of Cordia dichotomaseeds in the range of 2.69-86mg/mL had a synergistic effect in vitro on the
mouse spleen lymphocytes proliferation induced by ConA and LPS;polysaccharides of Cordia dichotoma
seeds in the range of 21.50-86mg/mL had synergistic effects in vitro on the spleen lymphocyte prolifera-
tion induced by ConA;polysaccharides in the range of 10.75-86mg/mL had synergistic effects in vitro on
the spleen lymphocyte proliferation induced by LPS;rosmarinic acid standard,used as the positive control
drug,had a synergistic effect in vitro on the mouse spleen lymphocytes proliferation induced by ConA and
LPS.Conclusion This primary study showed that the extracts fromCordia dichotomaseeds,polysaccha-
rides of Cordia dichotomaseeds and rosmarinic acid standards had some immunomodulatory effects.
Key words:Cordia dichotoma seeds;extract;immunomodulatory
第38卷 第1期 新 疆 医 科 大 学 学 报 Vol.38 No.1
2015年1月 Journal of Xinjiang Medical University Jan.2015
破布木果为紫草科植物破布木(Cordia dicho-
toma Forst.f)的干燥成熟果实。经预试验有黏液
质、糖类、有机酸、氰类、甾醇等反应[1]。维药名赛尔
皮斯堂,别名赛皮斯堂、来合苏热。维吾尔医认为破
布木果具有生湿生热、润肺润喉、止咳化痰、清音止
渴、通便利尿的功效,主治干寒性或黑胆质性疾
病[2]。破布木果是维药祖卡木颗粒、异常黑胆质成
熟剂[3]组成药材之一。近年来研究者们采用超声波
辅助萃取法和高效液相色谱串联质谱法从破布木果
中分离并确定含有迷迭香酸[4]。刘枫等[5]报道采用
超声提取技术测定破布木果总多酚含量,但对其化
学成分与药理作用的研究目前报道较少。本实验采
用迷迭香酸为阳性对照,探讨破布木果提取液、破布
木果多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响,初步
了解其免疫调节作用,现报道如下。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂 仪器:311CO2培养箱(Thermo
Fisher公司),SpectraMax190酶标仪(美国),旋转
蒸发仪R-1001N(郑州长城科工贸有限公司),DZF-
6021型真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司),
722S可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公
司),AL-204电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公
司)。试剂:SH40007-13改良型RPMI-1640培养基
(赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司),
SH40007-13PBS溶液(赛默飞世尔生物化学制品
(北京)有限公司),SH30401.01胎牛血清(Hyclone
公司),C2631刀豆蛋白(Sigma),L2880LPS(Sig-
ma),AR1160-500细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒
Cel Counting Kit-8(日 本 同 仁 化 学 研 究 所),
DKW33-R0100小鼠淋巴细胞分离液(达科为),
CFAE-536954-5G迷迭香酸标准品(Sigma)。
1.2 动物与原料 BALB/c小鼠(纯系小鼠),由新
疆医科大学实验动物中心提供。破布木果(新疆麦
迪森维药有限责任公司饮片厂,批号:20100501),经
新疆医科大学中医学院李永和主任药师鉴定为紫草
科植物破布木(Cordia dichotoma Forst.f)的干燥成
熟果实。
1.3 实验方法
1.3.1 原料预处理 将破布木果粉粹,过1号筛得
粉末以备用。
1.3.2 破布木果提取液的制备 破布木果粉和水
以1∶8的比例浸泡0.5h,用回流提取法提取4h,
过滤后得滤液和滤渣,再用水在相同条件下将滤渣
反复浸提3~5次,最后合并滤液进行减压浓缩,浓
缩至15mL,取其中的2mL以备用。
1.3.3 破布木果多糖的制备 取过40目筛的破布
木果粉400g,加入5倍量的石油醚回流3h(去脂
肪)[6];再加入5倍量的95%乙醇回流2次,每次回
流3h(去除单糖或部分醇溶性杂质)[7];过滤后滤渣
经热水浸提6h,上清液浓缩,sevage法除蛋白(正
丁醇:氯仿=1∶5)[8],上层是水,中层是蛋白质,下
层是有机层,分离出上层用95%乙醇醇析(1∶10),
放置12h,过滤用真空干燥箱烘干,刮取得粗多糖,
称量得10g,称量其中的172.7mg,用2mL PBS
溶液进行溶解以备用。
1.3.4 迷迭香酸标准品 称取迷迭香酸标准品
172.7mg,用2mLPBS溶液进行溶解以备用。
1.3.5 标准曲线的绘制
1.3.5.1 葡萄糖标准品溶液的制备 精密称取
105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品100mg,置于100
mL的容量瓶中,以蒸馏水定容至刻度,配成1g/L
的储备液,摇匀以备用。
1.3.5.2 硫酸蒽酮溶液的制备[9] 精密称取蒽酮
0.1g,置于50mL的容量瓶中,加浓硫酸(加浓硫酸
时,勿沿壁加入,应将移液管口悬于试管口,使浓硫酸
溶解垂直冲入液面)并稀释至刻度,摇匀以备用。
1.3.5.3 标准曲线的绘制 精密量取葡萄糖标准
溶液0、1、2、3、4、5、6mL,分别加入到100mL容量
瓶中定容,分别吸取1mL于试管中,加4mL的蒽
酮-硫酸试剂,摇匀后迅速浸入冰水中冷却5min,各
管加完后一起浸入沸水浴中,管口加塞,以防蒸发。
自水浴重新煮沸起,准确煮沸10min取出,用自来
水冷却;室温放置10min,于620nm处用分光光度
计测其吸光度。以吸光度值为纵坐标,葡萄糖质量
浓度为横坐标,绘制标准曲线,计算得回归方程:Y
=55.571 4 X-0.031,r=0.999 7。
1.3.6 破布木果总糖含量的测定
1.3.6.1 样品溶液的制备 精密称取样品粉末
10mg和水以1∶8的比例浸泡0.5h,用回流提取
法提取4h,过滤后得滤液和滤渣,再用水在相同条
件下将滤渣反复浸提3~5次,最后合并滤液进行减
压浓缩,浓缩至15mL,取其中的2mL用蒸馏水溶
解后于100mL容量瓶中定容,制得样品溶液。
1.3.6.2 破布木果总糖含量测定 精密吸取“1.3.
6.1”项下所得样品溶液1mL于具塞试管中,按“1.3.
5.3”项下的方法测定吸收度,由回归方程计算供试
液中葡萄糖质量浓度,按下式计算样品中多糖的含
量:样品中多糖的含量%=(C×50×15/100×W)
×100%(式中C为样品溶液中葡萄糖质量浓度,W
为样品重量)。
1.3.7 脾淋巴细胞的制备[10] 小鼠颈椎脱臼法处
死,放入装有70%乙醇的烧杯中浸泡3~5min消
毒,无菌取脾脏置于无菌培养皿中(淋巴细胞分离
液),把脾脏放入滤膜里,用研磨脾脏,得到脾细胞悬
63 新 疆 医 科 大 学 学 报 第38卷
液,将 脾 细 胞 收 集 到 离 心 管 中 进 行 分 离,
2 200r/min离心20min,取淋巴细胞分离层,加红
细胞裂解液,观察液体红色变浅,再加洗液进行洗
涤,再次离心,1 500r/min离心5min,倾去上清,用
RPMI-1640培养液悬浮细胞,得到脾细胞悬浮液并
进行计数,细胞数为每孔4×104 个。
1.3.8 破布木果提取液对ConA和LPS诱导小鼠
脾淋巴细胞增殖能力的影响 于96孔细胞培养板
的周边加入150μL的PBS缓冲溶液,其余的每孔
分别加入100μL的小鼠脾细胞悬浮液,加入经倍比
稀释后破布木果提取液的5个浓度,每个浓度设5
个复孔,并设ConA对照孔(20mg/L)、LPS对照孔
(1g/L)和空白对照孔,每个浓度均设5个复孔,混
合均匀后放置CO2 培养箱培养48h,培养结束后每
孔分别加入10μL的CCK-8溶液,放入CO2 培养箱
继续培养2h,充分混匀后于酶标仪在450nm处测
OD值。
1.3.9 破布木果多糖对ConA和LPS诱导小鼠脾
淋巴细胞增殖能力的影响 于96孔细胞培养板的
周边加入150μL的PBS缓冲溶液,其余的每孔分
别加入100μL的小鼠脾细胞悬浮液,加入经倍比稀
释后破布木果多糖的5个浓度,每个浓度设5个复
孔,并设ConA对照孔(20mg/L)、LPS对照孔(1g/
L)和空白对照孔,每个浓度均设5个复孔,混合均
匀后放置CO2 培养箱培养48h,培养结束后每孔分
别加入10μL的CCK-8溶液,放入CO2 培养箱继续
培养2h,充分混匀后于酶标仪在450nm 处测
OD值。
1.3.10 迷迭香酸标准品对ConA和LPS诱导小
鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响 于96孔细胞培养
板的周边加入150μL的PBS缓冲溶液,其余的每
孔分别加入100μL的小鼠脾细胞悬浮液,加入经倍
比稀释后迷迭香酸标准品的5个浓度,每个浓度设
5个复孔,并设ConA对照孔(20mg/L)、LPS对照
孔(1g/L)和空白对照孔,每个浓度均设5个复孔,
混合均匀后放置CO2 培养箱培养48h,培养结束后
每孔分别加入10μL的CCK-8溶液,放入CO2 培养
箱继续培养2h,充分混匀后于酶标仪在450nm处
测OD值。
2 结果
2.1 破布木果多糖的得率 400g干燥的破布木
果粉末按“1.3.3”项下方法制得破布木果多糖(无定
型粉末)10g,得率为2.50%。
2.2 破布木果提取液总糖含量的测定 测定样品
吸光度后,破布木果提取液中总糖的含量为3.29%。
2.3 破布木果提取液、破布木果多糖、迷迭香酸标
准品对ConA和LPS诱导小鼠脾淋巴细胞增殖能力
的影响 破布木果提取液在2.69~86mg/mL范围
内,均与ConA、LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞的增殖
在体外具有协同作用。破布木果多糖在21.50~86
mg/mL范围内,与ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞的
增殖在体外具有协同作用;在10.75~86mg/mL范
围内,与LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞的增殖在体外
具有协同作用。迷迭香酸标准品作为药物的阳性对
照,均与ConA、LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞的增殖
在体外具有协同作用,见表1。
表1 OD值统计表
原液 1∶1 1∶2 1∶4 1∶8 1∶16 ConA LPS 对照
破布木果提取液 1.895 1.385 0.894 0.791 0.470 0.426 0.418 0.386 0.365
破布木果多糖 0.964 0.555 0.456 0.409 0.383 0.400 0.418 0.386 0.365
迷迭香酸标准品 1.472 1.037 0.825 0.630 0.523 0.518 0.418 0.386 0.365
3 讨论
目前多糖含量的测定方法尚无统一标准,广泛
应用的是蒽酮-硫酸比色法,该方法具有操作简便、
重复性好、回收率高的优点,是一种快速检测多糖含
量的方法[11]。
采用超声波辅助萃取法和高效液相色谱串联质
谱法从破布木果中分离并确定含有迷迭香酸[4]。本
实验使用迷迭香酸标准品作为药物的阳性对照,对
0.2g/LConA和1g/L LPS在体外诱导的小鼠脾
淋巴细胞的增殖均有协同作用。并进行了一系列破
布木果多糖样品溶液的稳定性试验、重复性试验、加
样回收率试验,其试验结果均良好。
多糖类物质具有提高机体的免疫调节功能,并
且能促进T细胞、B细胞等免疫细胞的功能[12]。本
实验结果表明破布木果提取液、破布木果多糖、迷迭
香酸标准品在一定浓度范围内,对小鼠脾淋巴细胞
的增殖具有协同作用。但随着质量浓度的降低,刺
激指数具有下降的趋势。
本实验是将中药化学与免疫学紧密结合,来研
究破布木果对机体是否有免疫调节作用。本研究初
步明确了破布木果提取液具有免疫调节作用,但对
免疫系统具有调节作用的有效成分还需更深入的
研究。
(下转43页)
73 第1期 朱 明,等:破布木果提取物对小鼠脾淋巴细胞的增殖作用
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(本文编辑 杨晨晨
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(上接37页)
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[收稿日期:2014-03-06]
(本文编辑 施洋)
34 第1期 胡雪梅,等:维吾尔族静脉血栓栓塞症与凝血酶原G20210A和凝血因子V Leiden突变的相关性研究