全 文 ：［收稿日期］ 20121121(609)
［基金项目］ 广西科技厅攻关项目(桂科攻 0235022-4) ;国家中
医药管理局民族项目(04-05ZM01) ;广西教育厅
课题［桂教科研( ［2003］22 号］
［第一作者］ 丘琴，博士，从事药学和中药学的教学和科研工
作，Tel:0771-3124407，E-mail:12031983@ 163. com
［通讯作者］ * 甄汉深，教授，博士生导师，从事药学和中药学
的教学和科研工作，Tel:0771-2918239，E-mail:
8zhen@ 163. com
不同生产期苦玄参叶 HPLC指纹图谱
丘琴，苏春妹，甄汉深*
( 广西中医药大学，南宁 530001)
［摘要］ 目的:建立广西产不同生长期苦玄参叶的 HPLC 指纹图谱。方法:采用高效液相色谱法(HPLC) ，C18柱
(4. 6 mm × 250 mm，5 μm，Japan Shimadzu)分离分析，以乙腈-0. 1%冰醋酸溶液为流动相，梯度洗脱，检测波长 264 nm，柱温 25
℃，流速 1 mL·min －1，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2004A)软件进行分析。结果:10 批苦玄参叶的 HPLC指纹
图谱共标定 17 个共有峰，相似度均 ＞ 0. 9。结论:建立苦玄参叶质量控制方法，指导苦玄参药材的采收加工和规范化种植提供
实验数据。
［关键词］ 苦玄参叶;指纹图谱;高效液相色谱法
［中图分类号］ R284. 1 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2013)09-0104-04
［doi］ 10． 11653 /syfj2013090104
HPLC Fingerprint of Leaf of Picria fel-tarrae
in Different Growth Periods
QIU Qin，SU Chun-mei，ZHEN Han-Shen*
(Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530001，China)
［Abstract］ Objective:To study the HPLC fingerprint of leaf of Picria fel-tarrae in different growth
periods． Method:High performance of liquid chromatography (HPLC) was adopted， the separation was
performed on C18 (4. 6 mm × 250 mm，5 μm)column with acetonitrile-0. 1% aqueous acetic acid solution as
mobile phase using a gradient elution;the detection wavelength was set at 264 nm，the column temperature was set
at 25 ℃ and the flow rate was 1 mL·min －1;the data calculation was performed with similarity evaluation system for
chromatographic fingerprint of TCM (Version 2004A)． Result:In the fingerprint，17 common peaks were
confirmed and the similarity of 10 batches of leaf of Picria fel-tarrae． were above 0. 9. Conclusion:The experiment
result could provide experimental data for the quality control method of the leaf of Picria fel-tarrae． and for optimum
collection time and actualizing standard planting of Picria fel-tarrae．
［Key words］ leaf of Picria fel-tarrae Lour．;fingerprint;HPLC
苦玄参又名苦草、苦胆草、鱼胆草、蛇总管，主要
分布于广西、广东、贵州及云南等地，印度、菲律宾亦
有分布［1］。苦玄参作为广西道地药材，在广西民间
的药用历史悠久。传统中医认为其性寒味苦，具有
清热解毒、凉血消肿的功效，可用于风热感冒、咽喉
肿痛、胃痛、消化不良、痢疾、毒蛇咬伤、跌打损伤、淋
巴结炎等［2］。目前对苦玄参的质量研究，主要集中
在对不同产地的苦玄参全草的指纹图谱［3-5］，以及
对苦玄参全草中苦玄参苷类成分含量动态积累的研
究［6-7］，对苦玄参叶的研究未见有公开报道。为探
索不同生产期的苦玄参叶化学成分的变化，建立苦
玄叶的质量控制方法，本文对广西产的不同生产期
的苦玄参叶进行指纹图谱研究，为指导苦玄参药材
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2013 年 5 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 9
May，2013
的采收加工和规范化种植提供实验数据。
1 材料
Agilent 1100 型高效液相色谱仪(美国安捷伦科
技公司) ，在线真空脱气机(G-1322A) ，高压四元梯
度泵(G-1311A) ，可变波长检测器(G-1314A) ，二极
管阵列检测器，标准自动进样器(G-1313A) ，智能化
柱温箱(G-1316A) ，Agilent1100 series 色谱工作站
(美国安捷伦科技公司) ;CG-16W 型高速微量离心
机(北京医用离心机厂) ;SB3200-T型超声波提取器
(上海能信超声有限公司) ;Millipore Simplicity-185
型超纯水装置(美国密里博公司) ;BP211D 型电子
分析天平(德国赛多利斯)
苦玄参药材采自广西中医药大学药用植物园，
采收时间从 2006 年 7 月至 2007 年 4 月，每隔 1 个
月采集 1 次，每次采集苦玄参植株，经广西一心药业
马利飞副主任药师鉴定为玄参科植物苦玄参 Picria
fel-tarrae Lour．的干燥全草，将全草洗净，分取叶，于
烘箱 50 ℃烘干，粉碎，过 50 目筛，可得到苦玄参叶
粗粉。苦玄参苷 IA 由广西桂林植物研究所植化室
提供，含量 ＞ 98. 0%。甲醇、乙腈、冰醋酸(天津市
四友生物医学技术有限公司，色谱纯)、甲醇(北京
化工厂，优级纯) ，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2. 1 对照品溶液的制备 取苦玄参苷 IA 对照品适
量，精密称定，置 10 mL 量瓶中，用适量甲醇溶解并
定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为 2. 070 g·L －1的
对照品溶液。
2. 2 供试品溶液的制备 取苦玄参叶干燥粗粉
1. 5 g，精密称定，精密加入 75%甲醇 50 mL，称重，
超声提取 30 min，放冷，称重，补足损失质量，滤过，
取滤液，滤液于微型离心管中以 10 000 r·min －1离心
10 min，取上清液，以微孔滤膜(0. 45 μm)滤过，
即得。
表 1 流动相洗脱程序
t /min 乙腈 /% 0. 1%冰醋酸 /%
0 15 85
30 35 65
50 40 60
55 45 55
65 85 15
80 90 10
2. 3 色谱条件 C18色谱柱 (4. 6 mm × 250 mm，
5 μm，Japan Shimadzu GL science Inerstil) ，检测波长
264 nm，流速 1 mL·min －1，柱温 25 ℃，进样量 10
μL，流动相乙腈-0. 1%冰醋酸溶液，梯度洗脱，洗脱
程序见表 1。
2. 4 方法学考察
2. 4. 1 精密度试验 取苦玄参叶供试品溶液(编
号为 S1) ，在 2. 3 项下的色谱条件连续测定 5 次，结
果表明，各色谱峰的相对保留时间的 RSD 0. 05% ～
1. 77%，峰面积占总峰面积 5%以上的各峰相对峰
面积的 RSD 0. 01% ～0. 21%，符合指纹图谱的检测
要求。
2. 4. 2 稳定性试验 取苦玄参叶供试品(编号为
S1) ，按 2. 3 项下确定-的色谱条件测定，分别在 0，
2，4，8，12，24 h记录指纹图谱，结果表明，各色谱峰
的相对保留时间的 RSD 0. 06% ～ 2. 63%，峰面积占
总峰面积 5%以上的各峰相对峰面积的 RSD 0. 01%
～0. 23%，表明供试品溶液在 24 h内稳定。
2. 4. 3 重复性试验 取编号为 S1 的苦玄参叶粗粉
5 份，精密称定，按 2. 2 项下方法制备，按 2. 3 项下
确定的色谱条件测定，记录指纹图谱。结果表明，5
份样品的 HPLC指纹图谱中各色谱峰相对保留时间
的 RSD 0. 05% ～ 1. 79%，峰面积占总峰面积 5%以
上的各峰相对峰面积的 RSD 0. 01% ～ 0. 21%，表明
重复性良好。
3 指纹图谱的建立及技术参数
3. 1 苦玄参叶指纹图谱的采集 记录 120 min 的
色谱图，由图可知 80 min 后无色谱峰出现，从而确
定指纹图谱的采集时间为 80 min。10 批不同生长
期苦玄参叶的 HPLC指纹图谱的叠加图见图 1。
图 1 10 批苦玄参叶 HPLC叠加色谱
3. 2 参照色谱峰的建立 苦玄参苷 IA(15 号峰)是
苦玄参药材的主要成分之一，且该化合物稳定，保留
时间适合，峰面积占总峰面积比例适合，故选苦玄参
苷 IA 峰作为参照物峰，标记为 S，苦玄参苷 IA 对照品
溶液和苦玄参叶供试液的 HPLC图谱见图 2。
3. 3 共有峰的标定 采用国家药典委员会颁布的
《中药色谱指纹图谱相似度评价系统 A版》软件，对
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丘琴，等:不同生产期苦玄参叶 HPLC指纹图谱
A．对照品;B．样品;a. 苦玄参苷 IA
图 2 苦玄参叶 HPLC
10 批不同不同生长期苦玄参叶指纹图谱的相关参
数进行自动匹配，共标定 17 个色谱峰为共有峰，峰
面积占总峰面积 5%以上的共有峰有 5，6，7，9，11，
12，13，15，16，17 号。选择编号为 S1 苦玄参叶的
HPLC 指纹图谱为参照图谱，以中位数法作为对照
指纹图谱的生成方法，设定时间窗宽度为 0. 30 min，
提取苦玄参叶的共有模式建立对照指纹图谱，见图
3。以参照物峰的保留时间和峰面积作为 1，分别计
算共有峰的相对保留时间和相对峰面积，表 3，4 的
结果显示，不同批次苦玄参叶的共有峰相对保留时
间 RSD ＜ 3. 0%，而相对峰面积 RSD 较大，由此表
明，10 批不同生长期苦玄参叶指纹图谱色谱行为基
本一致，但不同批次的苦玄参叶主要化学成分的含
量相差较大。
图 3 苦玄参叶的对照指纹图谱
表 3 样品共有峰相对保留时间
峰号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 RSD%
1 0. 042 0. 043 0. 043 0. 042 0. 042 0. 042 0. 042 0. 042 0. 043 0. 041 1. 50
2 0. 047 0. 047 0. 048 0. 047 0. 047 0. 047 0. 048 0. 047 0. 048 0. 047 1. 02
3 0. 060 0. 058 0. 057 0. 060 0. 060 0. 060 0. 056 0. 059 0. 060 0. 060 2. 53
4 0. 062 0. 061 0. 062 0. 061 0. 061 0. 062 0. 061 0. 061 0. 062 0. 062 0. 86
5 0. 305 0. 303 0. 302 0. 304 0. 304 0. 301 0. 304 0. 302 0. 303 0. 303 0. 39
6 0. 328 0. 329 0. 327 0. 329 0. 329 0. 327 0. 329 0. 327 0. 328 0. 328 0. 27
7 0. 351 0. 350 0. 352 0. 351 0. 351 0. 348 0. 351 0. 349 0. 350 0. 349 0. 35
8 0. 373 0. 372 0. 373 0. 373 0. 373 0. 371 0. 373 0. 371 0. 373 0. 372 0. 23
9 0. 400 0. 401 0. 400 0. 400 0. 400 0. 399 0. 400 0. 398 0. 400 0. 399 0. 21
10 0. 603 0. 603 0. 602 0. 603 0. 603 0. 602 0. 602 0. 601 0. 603 0. 602 0. 12
11 0. 629 0. 630 0. 630 0. 631 0. 631 0. 628 0. 628 0. 628 0. 628 0. 629 0. 20
12 0. 761 0. 760 0. 762 0. 763 0. 762 0. 759 0. 760 0. 760 0. 761 0. 760 0. 16
13 0. 843 0. 843 0. 843 0. 843 0. 843 0. 843 0. 842 0. 842 0. 841 0. 843 0. 08
14 0. 929 0. 929 0. 930 0. 929 0. 929 0. 929 0. 929 0. 930 0. 929 0. 929 0. 05
15 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0
16 1. 250 1. 251 1. 250 1. 251 1. 251 1. 250 1. 250 1. 249 1. 250 1. 250 0. 05
17 1. 555 1. 555 1. 556 1. 556 1. 556 1. 557 1. 556 1. 557 1. 556 1. 556 0. 04
3. 4 苦玄参叶相似度评价 采用《中药色谱指纹
图谱相似度评价系统 A 版》对苦玄参叶 HPLC 指纹
图谱相似度计算，结果见表 5，10 批不同生长期苦玄
参叶样品的 HPLC指纹图谱与对照指纹图谱的相似
度均 ＞ 0. 9，表明各批次苦玄参叶样品的指纹图谱与
对照指纹图谱具有较好的一致性，可用于苦玄参叶
的整体质量评价。
4 讨论
分别考察了甲醇-水，甲醇-0. 1%冰醋酸，乙腈-
水，乙腈-0. 1%冰醋酸等流动相系统，结果发现采用
乙腈-0. 1%冰醋酸为流动相，各峰分离度和峰形较
好;比较了等度洗脱和梯度洗脱，后者出峰较多，各
峰间分离度良好，分析时间适合，故采用梯度洗脱。
曾对苦玄参叶供试液的制备方法进行考察，提
取溶剂比较了甲醇，50%甲醇，75%甲醇，乙醇，水等
溶剂，提取方法对超声、回流、冷浸、索氏和冷浸后超
声等方法进行筛选，结果发现采用 75%甲醇超声提
取效果优于其他几种方法。
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中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 9
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表 4 样品共有峰相对峰面积
峰号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 RSD /%
1 0. 290 0. 317 0. 318 0. 455 0. 455 0. 514 0. 662 0. 596 0. 589 0. 439 27. 74
2 0. 079 0. 175 0. 158 0. 307 0. 307 0. 170 0. 436 0. 306 0. 303 0. 112 47. 76
3 0. 159 0. 081 0. 048 0. 281 0. 281 0. 306 0. 308 0. 269 0. 306 0. 155 45. 38
4 0. 163 0. 290 0. 182 0. 220 0. 220 0. 251 0. 251 0. 255 0. 240 0. 249 16. 07
5 0. 618 0. 933 1. 035 1. 223 1. 223 0. 599 0. 486 0. 294 2. 135 0. 662 57. 40
6 8. 701 11. 147 12. 103 12. 760 12. 760 8. 402 11. 793 15. 505 19. 339 11. 585 25. 54
7 0. 295 0. 593 0. 610 0. 618 0. 618 0. 322 0. 724 0. 799 0. 899 0. 607 30. 74
8 0. 372 0. 337 0. 349 0. 395 0. 395 0. 416 0. 971 0. 636 0. 723 0. 731 40. 94
9 0. 289 0. 466 0. 442 0. 406 0. 406 0. 479 0. 515 0. 676 0. 613 0. 379 24. 19
10 0. 098 0. 178 0. 169 0. 198 0. 198 0. 172 0. 327 0. 310 0. 295 0. 110 38. 96
11 0. 708 1. 281 1. 434 1. 698 1. 698 1. 301 2. 317 2. 099 2. 483 1. 731 31. 70
12 1. 617 2. 202 2. 347 2. 398 2. 398 1. 985 2. 678 2. 192 2. 542 1. 974 13. 93
13 0. 810 0. 875 0. 934 1. 048 1. 048 1. 103 1. 122 1. 144 1. 099 1. 125 11. 33
14 0. 327 0. 254 0. 273 0. 310 0. 310 0. 411 0. 370 0. 282 0. 327 0. 534 24. 22
15 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0
16 0. 914 1. 239 1. 351 1. 479 1. 479 1. 637 1. 931 1. 672 1. 740 1. 529 18. 99
17 1. 241 0. 398 0. 341 1. 311 1. 311 1. 825 2. 143 1. 694 1. 837 1. 809 43. 82
表 5 苦玄参叶 HPLC指纹图谱相似度计算
S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 对照指纹图谱
S1 1 0. 978 0. 987 0. 985 0. 986 0. 980 0. 930 0. 978 0. 981 0. 989 0. 988
S2 0. 978 1 0. 994 0. 994 0. 992 0. 974 0. 942 0. 989 0. 992 0. 983 0. 993
S3 0. 987 0. 994 1 0. 999 0. 999 0. 990 0. 953 0. 993 0. 996 0. 995 0. 999
S4 0. 985 0. 994 0. 999 1 0. 999 0. 987 0. 955 0. 995 0. 997 0. 994 0. 999
S5 0. 986 0. 992 0. 999 0. 999 1 0. 991 0. 956 0. 994 0. 996 0. 995 0. 999
S6 0. 98 0. 974 0. 990 0. 987 0. 991 1 0. 949 0. 979 0. 979 0. 993 0. 989
S7 0. 93 0. 942 0. 953 0. 955 0. 956 0. 949 1 0. 974 0. 955 0. 944 0. 963
S8 0. 978 0. 989 0. 993 0. 995 0. 994 0. 979 0. 974 1 0. 996 0. 987 0. 997
S9 0. 981 0. 992 0. 996 0. 997 0. 996 0. 979 0. 955 0. 996 1 0. 99 0. 997
S10 0. 989 0. 983 0. 995 0. 994 0. 995 0. 993 0. 944 0. 987 0. 99 1 0. 995
对照指纹图谱 0. 988 0. 993 0. 999 0. 999 0. 999 0. 989 0. 963 0. 997 0. 997 0. 995 1
建立的 10 批苦玄参叶的 HPLC 指纹图谱，相似
度均 ＞ 0. 9，说明不同生产期的苦玄参叶的色谱行为
基本一致;共有峰相对峰面积 RSD 较大，说明不同
生产期的苦玄参叶的化学成分含量相差较大;在 10
批苦玄参叶的 HPLC 指纹图谱中，其中 7 月份采收
的苦玄参叶的 17 个共有峰的峰面积较大，说明主要
化学成分的含量较大，因此，苦玄参叶的采收期应为
7 月份，为进一步研究不同生产期苦玄参叶化学成
分的变化，确定苦玄参叶的最佳采收期，应采集更多
产地的不同生产期的苦玄参叶进一步研究。
［参考文献］
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［责任编辑 顾雪竹］
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