全 文 ：383植物生理与分子生物学学报, Journal of Plant Physiology and Molecular Biology 2005, 31 (4): 383-388
2 0 0 4 -1 2 -0 2 收到，2 0 0 5 -0 5 -1 2 接受。
国家自然科学基金项目(No. 301700 60)资助。
*通讯作者(E-mail: hqtian@jingxian.xmu.edu.cn; Tel: 0592-2186486)。
蓝猪耳卵细胞和合子的分离
陈素红 1，扬延红 2，廖景平 1，田惠桥 2*
(1中国科学院华南植物园，广州 510650；2厦门大学生命科学学院，教育部细胞生物学与肿瘤细胞工程重点实验室，厦门 361005)
摘要：蓝猪耳(Torenia fournieri)胚囊部分裸露出胚珠，
在光学显微镜下能清楚观察到卵细胞和助细胞的形态结
构。用解剖和酶解-解剖两种方法都能分离出生活卵细
胞。用前种方法机械分离出的卵细胞数量较少(5%)，但
避免了酶对配子识别研究的干扰。在后种方法中加入
0.1%纤维素酶和 0.1%果胶酶既能使分离更加容易操
作，又对卵细胞没有致命伤害，能在短时间内分离出较
多的卵细胞(18%)。用酶解 -解剖方法也可分离出授粉
14 h后的合子细胞。
关键词：卵细胞；合子；蓝猪耳
中图分类号：Q945
高等植物的雌配子体生长在雌蕊体细胞组织
的深处，这使得对高等植物受精机理的认识还很
肤浅。采用分离的精、卵细胞体外人工受精并诱
导长成植株的离体受精方法可在没有其他组织影响
的单细胞水平上研究高等植物的受精机理问题，
为探索配子识别和合子激活等问题提供有效手段
(田惠桥 2003)。卵细胞的分离是高等植物进行离
体受精研究的前提之一。胡适宜等(1985)成功地
从烟草中分离出第一例高等植物生活卵细胞。接
着，Kranz和Lörz (1993)等应用分离的玉米精、卵
细胞体外诱导融合并成功地再生出可育植株。然
而，卵细胞深藏在胚囊中，而后者又被层层体细
胞包裹，分离卵细胞并不容易。全世界许多科学
家近二十年来的努力也只在不到十种植物中分离出
了活的卵细胞。建立高等植物离体受精体系首先
要克服分离卵细胞的障碍。
蓝猪耳(Torenia fournieri)是玄参科蓝猪耳属植
物，其胚囊珠孔端部分伸出胚珠，在光学显微镜
下可清楚地从剥离的胚珠观察到卵细胞和助细胞的
结构轮廓。蓝猪耳胚囊部分裸露的特征有助于原
位观察卵细胞在受精前后的变化状态，被认为是
研究被子植物体内受精机理的一种模式植物。近
年来，用蓝猪耳做实验材料研究受精生物学问题
已有大量报告(Huang等1999; Higashiyama等2000,
2001; Wallwork和Sedgley 2000; Fu等 2000; Han等
2000, 2002; Yuan等2002; Higashiyama 2002; Vági等
2004)。蓝猪耳胚囊部分裸露的特征也有利于克服
对其卵细胞和合子分离的困难，减小了操作上的
主要技术障碍，因而也吸引了一些学者对其生殖
细胞的分离进行探索(Mól 1986; Keijzer等 1988;
Kristóf和 Imre 1996; Imre和Kristóf 1999; 房克风等
2003)。我们在成功地分离出蓝猪耳成熟精细胞的
基础上(陈素红等 2004)，又建立了蓝猪耳卵细胞
和合子的分离技术，为深入研究高等植物受精机
理和早期胚胎发生问题提供了条件，现报告如下：
1　材料与方法
蓝猪耳种子三月中旬在厦门大学植物园播
种，五月下旬植株开花。它自花、异花授粉都
能受精、结实。对即将开花的蓝猪耳先去雄套
袋，在人工授粉后对开花当天、开花后 2 d、开花
后 3 d的花取材，迅速从子房中剥取胚珠置于分离
液中。分离液的基本成分为：CaCl2 5 mmol/L，
KH2PO4 5 mmol/L，2-N-吗啡啉乙磺酸(MES) 0.7
mmol/L，3%~9% (W/V)的甘露醇。在基本分离液
中， 分别加入 0.1%果胶酶(Serva)+0.1%纤维素酶
(Onozyka R-10)和0.2%果胶酶+0.2%纤维素酶(W/V)
配成含酶的分离液(pH 5.8)。然后将不同时期、不
同处理的材料置于微振荡仪上室温酶解 0.5 h。之
后在倒置显微镜(Leica DM IRB)下，用自制的解
剖针分离蓝猪耳卵细胞。对分离出的卵细胞用 0.5
mg/mL 的荧光素二醋酸酯(FDA)母液稀释100倍染
色处理后，用 Leica DC-180显微操作仪将其转移
至载玻片上，在荧光显微镜(Leica DM R-60)下观
察、拍照。分离液的渗透压用自动冰点渗透压仪
OSMOMAT 030测量。
蓝猪耳的子房内有上百个胚珠，通常授粉后
384 31卷 植物生理与分子生物学学报
9~12 h受精就已进行了(Yuan等 2002)。本实验中
采摘授粉后约 14 h的花剥取胚珠，选择完整且能
观察到有花粉管伸入一个助细胞的胚珠分离合子。
分离合子所用的分离液及操作过程和分离卵细胞的
相同。同时选择授粉后 18 h的材料观察合子发育
到开始分裂的时期，以证实分离合子的可靠性。
2　结果
蓝猪耳的开花习性比较特殊。在厦门地区的
生长条件下，开花当天的花并不发生传粉作用，
通常在开花后第二天柱头的两裂片才展开并有效地
接受花粉粒，这种接受花粉粒的能力可保持到开
花后 3 d。去雄花保持 3 d后，胚囊中的助细胞显
示出退化迹象。
蓝猪耳即将开放的花经人工去雄后，不同时
期的胚囊中卵细胞显示出对分离液的渗透压反应敏
感(表 1)。当把胚珠分别置于含 3%和 9%甘露醇
的分离液中，不同时期的卵细胞在胚囊中都显示
出膨胀或收缩现象，表明分离液的渗透压过低或
过高了。在这两种溶液中人工解剖分离出的卵细
胞原生质体很快破裂或变畸形。当把胚珠置于含
5%甘露醇分离液中，在开花当天和开花后 2 d的
胚珠中能分离出生活状况良好的卵细胞，但开花
后 3 d的就很难分离出卵细胞。当把胚珠置于含
7%甘露醇的分离液中后，开花当天的难于分离出
卵细胞，而从开花后 2 d的胚珠中最易分离出卵
细胞，开花后 3 d的次之。分离出的卵细胞在适
宜的分离液中放置约 4 h仍具有生活力。从以上
结果来看，7%甘露醇分离液的渗透压较适合卵细
胞分离和保存。
在分离液中加入少量果胶酶和纤维素酶可明
显提高卵细胞的分离效率。在不加酶的条件下，
虽在含 5%和 7%甘露醇的分离液中都能分离出状
况良好的卵细胞，但 2 h内分离率平均只有 5%(在
50个完整胚珠中可分离出 2~3个卵细胞)。当将
0.1%果胶酶+0.1%纤维素酶加入到含5%和7%甘
露醇的分离液中，卵细胞的分离率都有很大程度
的提高，在含7%甘露醇的分离液中卵细胞的分离
率 2 h内可增加到 18%(在 50个完整胚珠中可分离
出 8~10个卵细胞)，且卵细胞的生活状况良好。
当酶浓度提高到 0.2%果胶酶 +0.2%纤维素酶时，
由于酶的作用增强，虽解剖操作比较容易，但卵
细胞常发生变形。另外，较高的酶液还容易离析
出大量珠被细胞，分离时间稍长时卵细胞原生质
体与珠被细胞原生质体很容易混淆。在含7%甘露
醇的分离液中加入 0.1%果胶酶+0.1%纤维素酶比
较适合分离数量较多同时形态较好的卵细胞。
开花后 2 d的胚囊中卵器三细胞的结构完整，
轮廓清晰。胚珠经 0.5 h酶解，卵细胞呈球形的
原生质体，助细胞也逐渐变圆(图版 I-1、2)。用
自制的解剖针从胚囊中部划破胚囊壁，轻轻挤
压，卵细胞便从中溢出(图版 I-3)。分离的卵细胞
经 FDA染色后荧光反应强烈，证明都具有较强的
生活力(图版 I-4)。分离出的卵细胞用显微操作器
可进一步收集、清洗(图版 I-5)。在剥取出的完整
的胚珠中，常可看到胚囊的裸露部分内的次生核
结构(图版 I-2)。表明在胚囊发育到一定时期时，
次生核就有向珠孔端迁移的趋势，为双受精过程
做好准备。
授粉后 14 h的花中大多数卵细胞已表现出了
受精的迹象：裸露的胚囊珠孔端明显增大，其中
在细胞质变浓密的合子旁的一个助细胞已退化(图
版 I-6)。有时还可看到已分裂的胚乳核。在授粉
后 18 h的花中，合子细胞明显变长，细胞核移向
合点端，核仁变大，合子开始分裂(图版 I-7)。在
授粉 14 h的胚珠酶解 0.5 h后，合子变成圆形。
将已受精的胚珠放入含 0.1%果胶酶+0.1%纤维素
表 1　不同渗透压对不同时期胚珠中卵细胞分离和保存的影响
Table 1　Effects of different osmolalities of isolation media on isolating and conserving egg cells at different stages
Stages Concentration of mannitol
3% 5% 7% 9%
(197 mOsmol/kg) (298 mOsmol/kg) (399 mOsmol/kg) (500 mOsmol/kg)
Anthesis Ruptured Could be isolated in good state Difficult to isolate Shrinken
2 d after anthesis Ruptured Could be isolated in good state Easy isolated in good state Shrinken
3 d after anthesis Ruptured Difficult to isolate Could be isolated Shrinken
385陈素红等: 蓝猪耳卵细胞和合子的分离4期
图版 I　分离的蓝猪耳卵细胞和合子
Plate I　Egg cells and zygotes isolated from Torenia fournieri
1, 5 and 10 were enlarged 430 times and others 1 070 times. 1: In an ovule, a naked embryo sac partly protruding from micropylar and
an egg cell (E) and two synergids (S) could be seen clearly; 2: The secondary nucleus (SN) with a large nucleolus moving towards the
386 31卷 植物生理与分子生物学学报
酶、7% 甘露醇的分离液中，采用与分离卵细胞
相同的方法，用解剖针划破胚囊中部的壁，轻微
挤压后，合子溢出(图版 I-8)。经 FDA染色，合
子发出了与卵细胞不同的荧光，合子的荧光主要
集中在细胞核周围，表明分离出的合子生活状态
发生了变化(图版 I-9)。通常在 2 h内可分离出 5~6
个合子，用显微操作器可将分离的合子集中收集
(图版 I-10)。授粉 22 h后，合子已分裂形成二胞
原胚。
3　讨论
本实验结果表明，分离卵细胞的两种方法各
有利弊。针对蓝猪耳这种具特殊胚囊结构的植
物，采用解剖法和酶解 -解剖法都能分离出活的卵
细胞，只是分离难度和分离率略有差异。酶对分
离的细胞生长发育有不利影响(Leduc等 1995)。房
克风等(2003)用含有 2%纤维素酶、0.5%离析酶、
1%半纤维素酶、0.05%果胶酶和附加 13%甘露醇
的分离液分离出了蓝猪耳合子分裂后形成的二胞原
胚及多细胞原胚。而在我们的实验中，当纤维素
酶和果胶酶的浓度从0.1%增加到0.2%时就会有许
多珠被细胞被分离下来，与卵细胞和合子易混
淆，增加了分离的困难。况且，采用不含酶液
的解剖法可使参与离体受精的卵细胞更接近于在体
内的状况，有利于受精机理的探索，尤其在研究
雌、雄配子识别机理的探索中要比用酶解分离的
卵细胞更有利。蓝猪耳卵细胞和合子的成功分
离，为研究卵细胞受精前后生物学特性及合子激
活的生殖生物学问题和建立蓝猪耳离体受精体系创
造了条件。
分离出的卵细胞除了用于离体受精研究外，
也可对其进行分子生物学的研究，但需要较多的
数量。Dresselhaus等(1994)用 RT-PCR做了 128个
玉米卵细胞的 cDNA文库，与体细胞 cDNA文库
比较后利用差异筛选法首次分离出卵细胞中特异表
达的基因。之后，他们又用相同的方法取 104个
离体受精 18 h的合子构建 cDNA文库，从中筛选
出一种位于细胞内质网中的储钙蛋白基因
(Dresselhaus等 1996)。在蓝猪耳生活卵细胞和合
子分离中，采用0.1%果胶酶+0.1%纤维素酶和7%
甘露醇的分离液，可明显提高分离数量，在 2 h
内可分离出约 8~10个卵细胞，若一天做 3批，每
天平均可分离 25个卵细胞和15个合子。这样就可
能收集到一定数量的卵细胞和合子以便进行分子生
物学研究。
从卵细胞受精到形成合子是植物世代交替过
程中的最重要的环节，卵细胞受精前后的变化是
受精生物学研究中最吸引人的研究热点。过去对
卵细胞受精前后做了大量的超微结构观察，从卵
细胞的结构变化特征获得一些有关高等植物受精方
面的信息。但通过切片进行超微结构观察所得结
论具有一定的滞后性和片面性。例如，上世纪 80
年代用超微结构观察方法在多种植物中都发现受精
后合子有一个收缩的过程，但也有人怀疑这种现
象是在制样的脱水过程中人工造成的假象。后
来，用分离的卵细胞和离体受精方法对小麦
(Kumlehn等 1998)、玉米(Kranz和 Lörz 1993;
Antoine等2000)卵细胞受精后的人工合子定点追踪
观察证实了合子收缩现象是真实的。在本实验
中，蓝猪耳的胚囊裸露，能清楚看到合子比卵细
胞体积稍小(图版 I-3、8)，分离出的合子也较卵
细胞小，这也证实受精后合子收缩是一种自然现
象。在卵细胞中大液泡的数目较多，细胞质大部
分聚集在位于细胞中央的细胞核周围(图版 I-5) ;
而在受精后的合子中大液泡明显减小，细胞质分
布较均匀、浓厚(图版Ⅰ -10)，很可能是卵细胞受
精后大液泡的消失引起了合子的收缩。随着受精
后时间延长，合子的体积又开始增大。由此可推
断在合子的发育过程中，由液泡消失引起合子体
egg cell (E), and two synergids (S) also located in the micropylar end of the embryo sac in an ovule 2 d after anthesis; 3: An egg cell isolated
from an embryo sac 2 d after anthesis; 4: The viability of isolated egg cell was evaluated with FDA reaction; 5: Five egg cells collected;
6: In a fertilized ovule 14 h after pollination, egg cell had been fertilized and formed a zygote (Z). A synergid (S) beside the zygote and
a pollen tube (PT) residue could also be seen; 7: The zygote (Z) had changed its shape and began to elongate 18 h after pollination. The
nucleus moved toward the chalazal end, which made polarity stronger than before; 8: A zygote isolated from an ovule 14 h after
pollination; 9: The viability of isolated zygote was shown by FDA reaction; 10: Four zygotes collected. E: Egg cell; PT: Pollen tube;
S: Synergid; SN: Secondary nucleus; Z: Zygote.
387陈素红等: 蓝猪耳卵细胞和合子的分离4期
积变小只是一个短暂现象，可能是合子激活过程
中细胞质重组的一种表现。
参 考 文 献
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388 31卷 植物生理与分子生物学学报
Isolation of Egg Cells and Zygotes from Torenia fournieri
CHEN Su-Hong1, YANG Yan-Hong2, LIAO Jing-Ping1, TIAN Hui-Qiao2*
(1South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650, China; 2The Key Laboratory of Education Ministry
for Cell Biology and Tumor Cell Engineering, School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361005, China)
Abstract: Torenia fournieri is a special plant with
embryo sac partly protruding through the micropyle
of ovule, and its egg cell, two synergids and part of
the central cell can be clearly observed using light
microscope (Plate I-1, 2). The feature of embryo
sac of T. fournieri makes it easy to isolate egg cell
and zygote, especially for physiologically mature and
vigorous egg cell to study its fertilization mechanism.
Egg cells of T. fournieri were isolated from em-
bryo sacs 2 d after anthesis using enzymatic diges-
tion or mechanical dissection after mild osmotic
shock (Plate I-3, 4). About 5% egg cells (2–3 from
50 ovules) could be mechanically dissected within
2 h. When 0.1% cellulase and 0.1% pectinase were
added into the solution, about 18% egg cells (8–10
from 50 ovules) could be isolated within 2 h (Plate
I-5). Although egg cells could be isolated by me-
chanical dissection, they can be used in in vitro fer-
tilization to probe fertilization mechanism without
deleterious effect of enzymatic action on the surface
of egg cell. But it is easier to isolate egg cells by
using enzymatic digestion, and more egg cells can
be obtained for the research of molecular biology.
Using enzymatic digestion method, the zygote of
Torenia fournieri was also isolated from the polli-
nated ovules (Plate I-7–10). Basing on our success-
ful isolation of mature sperm cells, the isolation of
egg cells of T. fournieri will make in vitro fertiliza-
tion possible for the first time in a dicot plant.
Key words: egg cell; zygote; Torenia fournieri
This work was supported by National Natural Science Foundation
of China (No. 30170060).
*Corresponding author (hqtian@jingxian.xmu.edu.cn; Tel: 86-592-
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