全 文 ：Science of Sericulture 蚕业科学
收稿日期:2014 － 10 － 11 接受日期:2014 － 11 － 02
资助项目:国家高技术研究发展计划“863”项目(No． 2013AA10060-
5)，商务部市场运行司茧丝绸产业公共服务体系建设项
目(No． 3)。
第一作者信息:轩亚辉(1989 －)，男，硕士研究生。
E-mail:xuanyahui123@ 126． com
通信作者信息:何宁佳，教授，博士生导师。
Tel:023-68250797，E-mail:hejia@ swu． edu． cn
* Corresponding author． E-mail:hejia@ swu． edu． cn
2014，40(6) :0957 － 0960
ISSN 0257 － 4799;CN 32 － 1115 /S
E-mail:CYKE@ chinajournal． net． cn
川桑的种子萌发及染色体核型鉴定
轩亚辉 李 杨 王 圣 向仲怀 何宁佳
(家蚕基因组生物学国家重点实验室，西南大学，重庆 400715)
摘 要 野生桑树种质资源川桑(Morus notabilis Schneid)作为桑树基因组测序的桑种，是研究桑树染色体和功能基因的重要
材料。将从四川省雅安市采集的野生川桑种子人工去皮后在 MS培养基上进行培养，实现了野生川桑种子室内培养条件下的
萌发，种子萌发率高达 85. 7%。分别以萌发幼苗的叶片和根尖为材料，采用去壁低渗法制备染色体标本进行核型鉴定，结果
显示川桑幼苗组织体细胞有 14 条染色体，并组成 7 对，即 2n = 2x = 14。川桑种子的室内萌发解决了进行川桑功能基因组研究
时受材料限制的难题;染色体核型鉴定的结果验证了桑树染色体基数为 7(x = 7)的推论。
关键词 川桑;种子萌发;种皮剥除;染色体核型
中图分类号 S888. 3;S330. 3 + 9;Q343. 2 + 2 文献标识码 A 文章编号 0257 － 4799(2014)06 － 0957 － 04
Seed Germination ofMorus notabilis Schneid and Identification of Its Karyotype
XUAN Ya-Hui LI Yang WANG Sheng XIANG Zhong-Huai HE Ning-Jia*
(State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology，Southwest University，Chongqing 400715，China)
Abstract As DNA resources of mulberry genome sequencing，wild mulberry germplasm resource Morus notabilis
Schneid is an important material for studies on mulberry chromosomes and functional genes． In present study，M． nota-
bilis seeds collected from Yaan City，Sichuan Province，were cultured on MS medium after manually peeling the seed
coats． The germination rate of M． notabilis seeds was up to 85. 7% under laboratory culture condition． The leaves and
root tips from the germinated seedlings were used as material to prepare chromosome samples using wall removal and
hypotonic treatment for karyotypic analysis． The result showed that the chromosome number of somatic cells of M． nota-
bilis seedling was 14 and these 14 chromosomes were grouped into 7 pairs (2n =2x =14)． Indoor germination of M． no-
tabilis seeds have resolved the difficulty that the studies of mulberry genomic function was restricted by unavailability of
M． notabilis as experimental materials． In addition，the data provided in this research validate our proposal again that the
cardinal chromosome number of mulberry species is 7 (x =7)．
Key words Morus notabilis Schneid;Seed germination;Seed coat peeling;Karyotype
川桑(Morus notabilis Schneid)为桑科(Moraceae)
桑属(Morus L．)的野生桑树种质资源，分布在
我国四川省、云南省海拔 1 300 ～ 2 800 m 的山
区［1 － 2］。川桑是已发现的体细胞内染色体数目最少
的桑树种质资源，基因组杂合度低，因此被选作桑
树基因组测序的桑种，其全基因组的测序结果已于
2013 年发表，与此同时，川桑还成为首次鉴定体细
胞染色体基数为 7(x = 7)的桑树种质资源［3］。基于
其基因组序列信息，川桑已成为桑树功能基因研究
的重要材料，已完成细胞色素 P450、促分裂原活化
蛋白激酶(MAPK)和茉莉酸合成相关基因等基因家
族的鉴定及功能分析［4 － 6］。另外，以川桑基因组序
列信息为参考，对桑品种粤椹大 10、珍珠白的花青素
DOI:10.13441/j.cnki.cykx.2014.06.003
958 蚕 业 科 学 2014;40 (6)
合成相关基因和湖桑 32号的乙烯合成相关基因进行
了克隆、表达及功能研究［7 － 8］。然而，川桑的无性繁
殖非常困难，嫁接成活率极低，通过愈伤组织在实验
室诱导发芽的成活率也较低［9］，以川桑为研究材料往
往需要到其自然分布的原始森林区取材，这在很大程
度上限制了对川桑的研究。我们在解剖观察川桑种
子的形态结构基础上，采用人工剖除种皮和在 MS 培
养基上培养的方法促进种子萌发，对萌发幼苗进行染
色体核型鉴定，希望能建立川桑人工培苗的方法，以
满足川桑越来越多地被作为桑树重要研究材料所需，
并进一步验证川桑的染色体核型。
1 材料与方法
1. 1 植物材料
实验用川桑种子于 2014 年 8 月采自四川省雅
安市荥经县海拔 1 400 ～ 1 500 m的原始森林区。将
收集的川桑成熟桑果用手揉搓出种子，清水冲洗干
净，晾干，30 ℃过夜烘干，然后置于 4 ℃冰箱保存。
1. 2 种子的形态观察和主要形态性状指标测定
在 Stemi2000C解剖镜(卡尔蔡司公司)下观察川
桑种子的颜色、外形和表皮，并拍照记录。测量 30 粒
种子的长、宽和厚度，计算平均值;随机选择 100 粒种
子称量，重复 3次，计算平均千粒种子质量［10］。
1. 3 种子萌发试验
参照文献［11］的方法并稍加改动。取川桑种
子在无菌水浸种 48 h(24 h换水 1 次)后，将种子置
于 1. 5 mL EP管中。加入 1 mL 25 g /L次氯酸钠于
EP管中，9 000 r /min离心 1 min;弃液体，加入 1 mL
70%乙醇，9 000 r /min 离心 1 min;弃液体，加入 1
mL无菌水，9 000 r /min 离心 1 min，重复 4 次。在
解剖镜下用镊子和刀片无菌操作将川桑种皮完全
剖除。将剖除种皮的种子放置在 MS 培养基(2. 2
g /L MS + 30 g /L蔗糖 + 6. 8 g /L琼脂，pH 5. 7 ～ 5. 8)
中，或放置在湿润的滤纸上，25 ℃下 16 h 光照、8 h
黑暗培养。种子萌发出真叶后移栽到盆中，置于 25
℃培养箱中培养(16 h 光照，8 h 黑暗)。另将未剖
除种皮的种子浸种后播种于 MS 培养基上作为
对照。
1. 4 染色体核型分析
1. 4. 1 制片方法 取 10 株川桑种子萌发幼苗的幼
嫩叶片和根尖，采用低渗去壁法［12 － 13］制片。幼叶染
色体制片:取幼苗嫩叶于 0. 002 mol /L 8-羟基喹啉
溶液中避光预处理 2 h;水洗后用卡诺固定液(甲醇
与冰醋酸的体积比为 3∶ 1)于 4 ℃下固定 24 h，转入
0. 067 mol /L KCl溶液中在室温条件下前低渗处理
30 min;再用混合酶液(2. 5%纤维素酶和果胶酶，其
中纤维素酶活力为 2 900 U /g，果胶酶活力≥1 000
U / g)30 ℃酶解 3. 5 h;转入蒸馏水中后低渗处理 30
min;吸干蒸馏水后将材料捣碎，加入固定液用悬滴
法制片;干燥后用 Giemsa 染液染色过夜后洗片、封
片，然后在 Leica DM2500 显微镜(徕卡显微镜系统
贸易有限公司)下进行拍照记录。根尖染色体制
片:取 0. 5 cm幼嫩根尖用于染色体制片，30 ℃酶解
30 min，其他步骤同上。
1. 4. 2 核型分析 选取分散良好，形态清楚的染色
体图，参照文献［14］的方法进行染色体分类，用
Adobe Photoshop软件分析染色体核型和配对。
2 结果与分析
2. 1 种子的形态特征
川桑种子在自然光下呈褐色，肾形，质地坚硬，
表面有针状凸起和凹陷(图 1)。种子平均长 2. 01
mm ±0. 01 mm，宽 1. 06 mm ± 0. 11 mm，厚 1. 19 mm
±0. 15 mm，千粒质量为 1. 425 g ± 0. 017 g。种皮
完全剖除后的种子形态见图 1。
图 1 川桑种子的形态
Fig. 1 The morphology of Morus notabilis seed
第 6 期 轩亚辉等:川桑的种子萌发及染色体核型鉴定 959
2. 2 种子的萌发率
剖除种皮后的川桑种子在 MS 培养基中培养
3 ～ 5 d，萌发率最高达到 85. 7%(表 1) ，幼苗的萌发
状态也比较一致。幼苗于萌发后 15 d 移栽到装有
土壤基质的花盆，移栽幼苗的生长状态如图 2 所示。
2. 3 幼苗组织的染色体核型
染色体核型鉴定结果表明，10 株供试川桑幼苗
的根尖和幼叶的体细胞均由 14 条染色体组成 7 对，
即 2n = 2x = 14(图 3)，相对长度组成为 2n = 14 = 2L
+ 4M2 +2M1 +6S。
表 1 川桑种子不同处理及环境下的萌发状况比较
Table 1 Germination comparation of Morus notabilis seeds under different treatments and conditions
种子处理和萌发环境
Treatment and
seed germination condition
供试种子数量 / 粒
Number of
seeds for test
种子萌发数量 / 粒
Number of
germinated seeds
萌发率 / %
Germination
rate
开始萌发所需时间 / d
Time needed to
initiate germination
完成萌发的时间 / d
Time needed to
complete germination
种皮剖除，MS培养基
Coat-removed，MS medium 21 18 85. 7 3 5
种皮剖除，湿滤纸
Coat-removed，wet filter paper 9 4 44. 4 5 14
种皮未剖除，MS培养基(CK)
Coat-unremoved，MS medium 18 0 0
A．萌发 20 d的幼苗 B．移栽 7 d的幼苗 C．移栽 30 d的幼苗
A． The seedling at 20 d after germination B． The seedlings at 7 d after transplanting C． The seedlings at 30 d after transplanting
图 2 川桑种子萌发及移栽的幼苗
Fig. 2 Germination of Morus notabilis seeds and transplanted seedlings
图 3 川桑种子萌发幼苗根尖(A)与幼叶(B)染色体的数目及核型(2n = 2x = 14)
F ig. 3 The chromosome number and karyotype of root tips (A)and young leaves (B)from Morus notabilis seedlings (2n = 2x = 14)
960 蚕 业 科 学 2014;40 (6)
3 讨论
硬实种子有坚厚的种皮、果皮，或附有致密的
蜡质和角质层，这类种子由于外壳的限制，阻止了
种子内部的胚对水分和氧气的吸收，进而影响到种
子的萌发［15］。本研究小组曾经采用不同浓度的稀
盐酸处理川桑种子，或通过机械压裂种子以及将种
子给鹌鹑喂食消化处理等方法，均未能得到川桑种
子萌发的幼苗。本研究采用人工剖除种皮的方法
使川桑种子可以萌发，且在 MS 培养基上的萌发率
高达 85. 7%，为大量得到川桑组织材料用于功能基
因组研究创造了基本条件。分析认为，川桑种子坚
硬的种皮是其萌发的主要限制因子，因此常规的浸
种不能使川桑的种子萌发。另结合前期试验中压
裂种子在 MS 培养基上也不能萌发的特点，推测抑
制川桑种子萌发除种皮的机械限制外，还可能存在
其他因素。将川桑种子人工剖除种皮后在培养基
上播种有很高的萌发率，但对操作人员的技术要求
较高，整个操作过程耗时较多，而且在剖除种皮时
容易感染细菌，因此今后仍需研究操作更为简便、
高效的促进川桑种子萌发的方法。
植物在授粉期受到冷冻刺激，可能会通过孤雌
生殖低频率产生单倍体植株，通常单倍体植株较矮
小，生长缓慢，抗性低，高度不育。川桑在很长一个
时期被报道为单倍体桑树［16］。自对川桑基因组测
序的报道中推测桑树的染色体基数为 7［3］后，本试
验又对川桑种子萌发的 10 株幼苗进行染色体核型
鉴定，结果证明其体细胞全部为 14 条染色体并组成
7 对，和母体染色体数目一致，是二倍体而非自然单
倍体，并说明川桑结实不是因体细胞自动加倍育性
恢复的结果［17］。继滇桑(Morus yunnanensis)体细胞
仅有 14 条(7 对)染色体的报道之后［12］，本试验结
果也是进一步确证桑树染色体基数的依据之一。
参考文献 (Ｒeferences)
［1］ 张秀实，吴征镒，曹子余．中国植物志(第二十三卷第一分册)
［M］．北京:科学出版社，1998:16 － 17
［2］ 龚固堂． 四川桑科植物研究［J］． 四川林业科技，1994，15
(3) :1 － 10
［3］ He N J，Zhang C，Qi X W，et al． Draft genome sequence of the mul-
berry tree Morus notabilis［J /OL］． Nat Commun，2013，4:3445
［2014 － 10 － 10］． www． nature． com /ncomms /2013 /130919 /
ncomms3445 / full /ncomms3445． html
［4］ Ma B，Luo Y W，Jia L，et al． Genome-wide identification and ex-
pression analyses of cytochrome P450 genes in mulberry (Morus
notabilis) ［J］． J Integr Plant Biol，2014，56(9) :887 － 901
［5］ Wei C J，Liu X Q，Long D P，et al． Molecular cloning and expres-
sion analysis of mulberry MAPK gene family［J］． Plant Physiol
Biochem，2014，77:108 － 116
［6］ Wang Q，Ma B，Qi X W，et al． Identification and characterization
of genes involved in the jasmonate biosynthetic and signaling path-
ways in mulberry (Morus notabilis) ［J］． J Integr Plant Biol，2014，
56(7) :663 － 672
［7］ Qi X W，Shuai Q，Chen H，et al． Cloning and expression analyses
of the anthocyanin biosynthetic genes in mulberry plants［J］． Mol
Genet Genomics，2014，289(5) :783 － 793
［8］ Shang J Z，Song P H，Ma B，et al． Identification of the mulberry
genes involved in ethylene biosynthesis and signaling pathways and
the expression of MaEＲF-B2-1 and MaEＲF-B2-2 in the response
to flooding stress［J］． Funct Integr Genomics，2014，14(4) :767 －
777
［9］ 王茜龄，余亚圣，何宁佳，等． 单倍体川桑(M． notablis Schneid)
愈伤组织诱导及丛生芽分化培养［J］．西南大学学报:自然科
学版，2013，35(10) :50 － 55
［10］ 郭学民，肖啸，梁丽松，等． 白刺花种子硬实与萌发特性研究
［J］．种子，2010，29(12) :38 － 42
［11］ 师秋菊，李群．棱果芥种子萌发特性及其与油菜种子萌发对比
的研究［J］．种子，2014，33(5) :31 － 35
［12］ 李杨，轩亚辉，王圣，等． 滇桑(Morus yunnanensis)的染色体核
型分析［J］．蚕业科学，2014，40(2) :187 － 190
［13］ 陈瑞阳．植物有丝分裂染色体标本制作的新方法［J］． 植物学
报，1979，20(3) :297 － 298
［14］ 李懋学，陈瑞阳．关于植物核型分析的标准化问题［J］．武汉植
物学研究，1985，3(4) :297 － 302
［15］ 杨期和，尹小娟，叶万辉． 硬实种子休眠的机制和解除方法
［J］．植物学通报，2006，23(1) :108 － 118
［16］ 余茂德，向仲怀，冯丽春，等． 自然单倍体川桑的发现与研究
［J］．蚕业科学，1996，22(2) :67 － 71
［17］ 魏俊杰，陈梅香．玉米单倍体育性自然恢复的初步研究［J］．玉
米科学，2006，14(2) :24 － 26