全 文 ：转化 pCAMBIA1301载体蓝猪耳 F1代
植株的花粉育性研究
孙姝兰
(华南师范大学生命科学学院 , 广东 广州　510630)
　　摘要:通过自花和异花授粉 、电镜扫描 、花粉活力测定等方法 ,对转 pCAMBIA1301 基因蓝猪耳的 9 个转基因
株系的 F1代植株的育性进行了研究.结果表明:蓝猪耳不存在自交不亲和现象但其转基因植株出现花粉败育;对 9
个转基因株系进行测定 ,发现其花粉活力与对照(77.3 %)差异显著 , 仅为 9.8 %～ 30.6 %, 表明转基因蓝猪耳花
粉败育不是由于基因的插入引起的 ,普通培养基组培瓶蓝猪耳花药活力与在土壤中萌发的蓝猪耳花粉活力均为
75 %左右 ,表明组培环境也不是引起花粉败育的原因 , 因此继代培养基是引起花粉不育的唯一原因.
　　关键词:蓝猪耳;转基因;花粉败育
　　中图分类号:S 682.39:S 603.2　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1003-4315(2008)03-0089-04
A study on fertility of Torenia f ournieri F1 plants with
t ransgenic vector pCAMBIA1301
SUN Shu-lan
(Co llege of Life Science , South China No rmal Univ ersity , Guang zhou 510630 , China)
　　Abstract:The fert ili ty of F 1 plants from 9 transgenic plant lines of Torenia fournieri w ith transgenic
vector pCAMBIA1301 w ere studied by art ificial pollina tion experiments ,SEM observation and po llen vig-
our test.The resul ts show ed that no self-incompat ibility appeared in art ificial self po llinat ion of Torenia
f ournieri plants ,but pol len abo rtion had occurred in its t ransgenic plants.Acco rding to pollen vigour test ,
po llen vigor of 9 transgenic plant line s ranged be tw een 9.8 % and 30.6 %, significant ly lowe r than that
(reached 77.3 %)of the contro l ,which indicated pol len sterility w as not the resul t of inserted genes.In ad-
dition ,pollen vig or of plants bo th cultured in general media o f the po ts and o rig inated f rom seed germina-
tion in the soi l of g reenhouse reached about 75 %, and i t w as pro ved that the reason of po llen abo rtion of
t ransgenic plants of Torenia f ournieri was actually not the tissue culture media , but w as the subculture
media.
　　Key words:Torenia fournieri ;transgene;po llen abort ion
　　蓝猪耳作为热带 、亚热带花卉植物 ,生长周期
短 ,盛花期比较长 ,而且具备裸露的胚囊 ,因此不仅
是夏季花卉中的重要栽培品种 ,而且还是研究植物
花器官发育和授粉受精过程的理想模式植物[ 1] .无
作者简介:孙姝兰(1975-),女 ,广东广州人 ,博士 ,研究方向为植物
生理与分子遗传学.E-m ail:sunsl@scnu.edu.cn
资助基金:广东省自然科学基金(530074).
收稿日期:2008-03-08
论对于以适应市场需求为目标的新品种选育和品种
改良 ,还是对于基因功能研究来说 ,遗传转化是必不
可少的.目前蓝猪耳再生及遗传转化系统在国内外
的一些实验室已经比较完善[ 2 , 3] .但是植物转基因
常常可能带来各种非预期的后果 ,比如转基因沉
默[ 4] ,转基因植株形态学上的改变或者对生物非生
物抗性改变等[ 5] .在转基因诱导产生的这些变异中
包括雄性不育.范树国等[ 6]将 10个水稻材料的幼穗
2008 年 6月
第 3期 89 ～ 92
甘　肃　农　业　大　学　学　报
JOURNAL OF GANS U AGRICULTURAL UNIVERSITY
第 4 3 卷
双 月 刊
在不同的培养基上培养 ,结果在 5个材料中共获得
了 29例雄性不育变异株 ,其中 R1代有 24株 , R2代
有 5株 ,出现不育株系的频率分别为 2.22 %和
1.89 %.
　　转基因非预期后果出现的原因主要有两类.第
一 ,插入效应 ,即整合基因对宿主基因组的影响;第
二 ,转基因过程中各种继代再生手段的影响 ,即体细
胞无性系变异.继代重生手段中主要的影响因素分
为继代培养基中激素的使用和继代过程组培瓶中湿
热环境的影响[ 7] .
　　本试验旨在通过对蓝猪耳转基因不育现象研
究 ,进而探讨造成转基因蓝猪耳不育现象的本质 ,为
转基因过程尽量避免非预期结果提供依据和参考.
1　材料与方法
1.1　植物材料与培养
　　蓝猪耳(Torenia fournieri Lind)种子由华南
师范大学生命科学学院宾金华教授惠赠.转基因株
系是利用携带 pCAMBIA1301 载体的农杆菌介导
转化法得到的 9个单独分化出来的转基因株系.转
基因株系 F 1代用于授粉处理和花粉活力测定 ,每个
株系移栽 10株于培养盆中单独培养 ,每株取两朵花
用于花粉活力测定.
　　种子播种在含有培养土(购自广东省顺德市翠
筠有限公司)的小花盆中 ,培养室光周期为 16 h/d ,
湿度 70 %～ 80 %,温度(23±1)℃,光照强度 60
mol/(m2 · s).播种 2周内每天浇水 1次;2周后 ,把
幼苗单株移栽至含有混合土((蛭石+培养土)的花
盆中 ,放在组培室中继续种植 ,每 2 ～ 3 d浇水 1次.
1.2　授粉处理
　　为了检测蓝猪耳植株自花授粉及异花授粉的结
实效果 ,在光照培养室内 ,对所研究的蓝猪耳植株在
花期内设立如下几个处理进行人工授粉试验:1)自
然对照:不作任何处理 ,挂牌直至结实;2)花开前套
袋 ,直至凋谢;3)花开前套袋 ,花开后人工异花(异
株)授粉 ,分别进行二长雄蕊和二短雄蕊的授粉 ,套
袋;4)花开前套袋 ,花开后人工自花(同株)授粉 ,分
别进行二长雄蕊和二短雄蕊的授粉 ,套袋 75%.检
测和统计各处理的结实率.对光照培养室中的蓝猪
耳的 5种处理进行结实率的统计 ,计算各处理的结
实率.结实率(%)=(结实花朵/开花花朵).
1.3　扫描电镜观察
　　在中科院华南植物园电镜室进行 ,电镜型号为
JSM-6360LV.将蓝猪耳的对照以及转基因的花粉
用戊二醛 、锇酸双固定 ,经乙醇逐级脱水 ,临界点干
燥和喷金后 ,用扫描电镜观察并照相.
1.4　花粉活性测定
　　在开花后第 1天将花粉浸入含有 MT T 反应液
(100 mg MT T 溶于5 %蔗糖溶液中)的凹面载玻片
中 ,同时用火加热杀死的花粉作对照.使花粉和
MT T 充分混匀 ,让其风干后再重复置一滴 MTT 溶
液 ,干后在显微镜下观察并统计着色花粉粒和未着
色的花粉粒数目(每片花粉数>500 粒).若花粉变
红紫色则表明有活性 ,若无变化或黄褐色则为无活
性[ 8] .
1.5　拟转基因植株 PCR检测
　　CTAB 法提取蓝猪耳基因组 DNA.扩增片段为
T-DNA 区域潮霉素抗性基因的一段长 375 bp 的片
段 ,引物序列为:Hph1:5′-GCT GGG GCG TCG
GT T TCC ACT A TC GG-3′;Hph2:5 CGC A TA
ACA GCG CTC AT T GAC TGG AGC-3′.
2　结果与分析
2.1　不同授粉处理方式对蓝猪耳结实率的影响
　　转基因蓝猪耳不育可能是自交不亲和不育或者
是雄性不育或雌性不育 ,因此要对不育的本质进行
探究.对室内蓝猪耳不同授粉处理实验发现 ,自然对
照下 、不授粉套袋处理下均未出现结实现象 ,说明在
室内自然条件下蓝猪耳是不能结实的;而人工自交
授粉结实率基本可达到 100 %,说明蓝猪耳不存在
自交不亲和现象.而且无论是二长雄蕊花粉以及二
短雄蕊的花粉进行自交或者异交授粉 ,其结实率都
非常高 ,说明室内蓝猪耳可以人工进行自交和异交
授粉.
2.2　转基因蓝猪耳雄性和雌性器官可育性的分析
　　通过授粉实验可以得知蓝猪耳在室内自然条件
下无法结实 ,人工自交授粉可以结实 ,但是对转基因
蓝猪耳 9个株系共 36 朵花进行授粉发现无法得到
果实 ,因此进行了测交试验 ,即用对照花粉授粉于转
基因花的柱头 ,可以结实 ,得到杂合的种子;取转基
90　　　　　　　　　　　　　　　　甘 肃 农 业 大 学 学 报　　　　　　　　　　　　　　 　2008 年
因的花粉人工授粉于 20朵对照花的柱头 ,只有一朵
得到 3粒种子 ,其余均未出现结实.因此认为转基因
花的柱头仍有活力 ,转基因后代无法结实的原因可
能是花粉的发育过程出现了问题.通过电镜扫描发
现转基因蓝猪耳的花粉大多数出现形态异常 ,如花
粉粒皱缩 、扁瘪 、花粉外壁严重内陷 ,不含内容物 ,且
有时多个花粉互相粘连堆积在一起 ,出现了花粉败
育的特征(图 1).
表 1　不同授粉处理的结实率比较
Tab.1　Fruit se t com parison of different pollination treatments
处理 自然对照 不授粉套袋 二长花粉异交 二短花粉异交 二长花粉自交 二短花粉自交
处理花苞数/个 55 56 15 15 15 10
结实数目/个　 0 0 15 13 15 10
结实百分率/ % 0 0 100 72.2 100 100
A 、C.对照野生型花粉　　B 、D.转基因花粉
图 1　野生型和转基因花粉粒的形态结构
F ig.1　The morphology of ma tur e po llens of w ild
type and transgenic plants
2.3　转基因蓝猪耳花粉败育与转入基因关系的分
析
　　为了检验是否由于转入特定能够致使不育的基
因的原因导致转基因蓝猪耳出现不育现象 ,对 9 种
不同转基因株系蓝猪耳进行转基因分子鉴定和花粉
活力测定.图 2中 9个转基因株系 PCR检测均显示
注:M .1kb DNA ladder Marker CK:非转基因植株 1-9:
转基因蓝猪耳抗性植株 01:pCAMBIA1301载体
图 2　转基因蓝猪耳抗性植株 PCR检测
F ig.2　PCR de tection of tr ansgenic resistant
plants o f torenia
外源基因已转入 ,并且表 2中转基因蓝猪耳二长和
二短的花粉活力都明显低于对照 ,表明转基因蓝猪
耳花粉败育不是由于插入的基因引起的.
2.4　组培瓶培养环境对花粉活力的影响
　　为了明确蓝猪耳转基因植株花粉不育的原因 ,
在组培瓶培养环境中进行原代培养以确认组培环境
对花粉活力是否有影响.如表 3所示 ,在组培瓶中以
及土壤中萌发生长的蓝猪耳其花粉活力没有显著差
异 ,说明组培瓶的培养环境对蓝猪耳花粉活力没有
影响 ,因此继代培养是影响花粉活力的唯一原因.
表 2　不同转基因株系花粉活力的测定
Tab.2　Pollen vig o r of different transgenic Torenia plants
株系 二长花粉活力/ % 二短花粉活力/ %
CK 77.3±3.5 75.6±3.4
T5 9.8±3.6 16.3±4.7
T20 22.4±5.8 24.1±3.5
T26 30.6±5.8 28.9±4.2
L59 21.0±5.5 14.3±3.9
L38 27.8+2.3 24.4±4.5
KPJ03 13.7±3.0 17.9±4.9
KPJ07 14.7±3.0 15.9±3.4
KPJ08 11.5±3.6 13.8±2.4
KPJ09 14.4±3.6 18.3±4.4
表 3　不同培养条件下蓝猪耳花粉活力的测定
Tab.3　Pollen vigo r of Torenia plants
under different cultural conditions
培养方法 二长花粉活力/ % 二短花粉活力/ %
组培瓶中培养 73.1±3.6 74.9±4.4
土壤培养 77.3±3.5 75.6±3.4
3　讨论
　　蓝猪耳是一种重要的花卉栽培品种 ,同时也是
研究植物花器官发育和授粉受精过程的模式植物.
蓝猪耳的分子育种以及基因功能的研究都需要对蓝
91第 3 期　　　　　　　　　　　孙姝兰:转化 pCAM BIA1301 载体蓝猪耳 F 1代植株的花粉育性研究　　　　　　　　　
猪耳进行遗传转化.而在本实验中发现蓝猪耳转基
因会出现不育这种非预期性结果.虽然有一些报道
表明转基因或者组织培养会诱导产生雄性不育的变
异 ,但是其变异频率比较低[ 6] ,而在蓝猪耳中转基因
株系雄性的育性普遍降低 ,这是一种从未报道过的
现象.
　　虽然有些研究表明雄性不育与某些基因的功能
有关[ 9] ,但本研究发现 9种不同转基因蓝猪耳花粉
活力都明显降低 ,根据概率 ,每个转基因植株都是因
为插入的基因引起不育的可能性极低 ,因此转基因
蓝猪耳花粉败育不是由于插入的基因引起的.转基
因株系的花粉活力降低可能由于组培环境或者继代
过程引起的 ,而在组培瓶中直接播种长大的植株 ,发
现其花粉活力正常.因此是组培继代过程影响了花
粉的生长和发育.Labra等[ 10] 人比较了采用浸花法
(不需经过组织培养再生阶段)或愈伤培养再生得到
的转基因拟南芥的基因组变异 ,通过追踪超过 650
个 AFLP 和 RAMP 分析得到的标签带 ,清楚地显
示了愈伤培养是诱导 DNA 产生变异的唯一重大因
素.愈伤培养诱导的变异包括染色体修饰造成的基
因表达差异 、点突变以及可转移因子的剪切和插入
或者染色体断裂[ 11] .早在 1983年 , Fukui就发现连
续数次进行组培继代能够积累组织培养诱导的变
异[ 12] .在玉米中 ,组织培养诱导产生 DNA 甲基化模
式及水平的变异 ,其频率远高于序列的变异 ,足以产
生表型上的变化 ,而且其甲基化变异可以稳定遗传
给后代[ 13] .因此在转基因过程中应尽量减少继代次
数以及尽量减少继代时诱芽的时间是降低非预期性
结果出现频率的重要因素.而对于不同组培继代次
数的蓝猪耳花粉活力的测定以及组培继代对于基因
组变异和甲基化模式和水平的变异的影响进行研究
将能对转基因蓝猪耳为什么会出现如此高频率的不
育现象做出一定的解释.
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