全 文 ：— 37 —现代中药研究与实践2015年第29卷第3期Chin. Med. J. Res. Prac., 2015 Vol. 29 No.3
基金项目：2011 年北京市教委共建项目：中药干预胰岛素抵抗技术平台建设与方药筛选研究；2011 年北京中医药大学创新团队项目（NO. 2011-CXTD-19）
作者简介：李娟娥（1980-），女，医学博士，主治医师，研究方向：中医药对糖尿病及其并发症的防治。E-mail: lizhuan_1980@126.com
通讯作者：刘铜华（1963-），男，教授，博士生导师，研究方向：中医药对糖尿病及其并发症的防治。E-mail: thliu@tom.com
匙羹藤对 2型糖尿病 db/db 小鼠骨骼肌葡萄糖转运信号通
路的影响
李娟娥 1，王　磊 2，孙　文 2，秦灵灵 2，刘铜华 2*
（1. 陕西省人民医院，陕西 西安 710068 ；2. 北京中医药大学，北京 100029）
摘　要：目的　观察匙羹藤（Gymnema sylvestre (Retz.) Schult. 对自发性 db/db 小鼠胰岛素抵抗及骨骼
肌葡萄糖转运信号通络中关键蛋白表达的影响。方法　将 SPF 级 27 只 db/db 小鼠随机分 3组（n=9）：模型
组、匙羹藤提取物组、吡格列酮组；并选 8只 db/+ m 鼠为正常组。连续灌胃给药 4周后检测 FBG、Fins、
血脂、FFA，采用Western blot 对骨骼肌葡萄糖转运信号通路中的关键蛋白和基因进行了研究。结果　模型
组和治疗组的体重、FBG、Fins、TG、CHOL、LDL、FFA 水平明显高于正常组，而 ISI 指数低于正常组；
与模型组相比，匙羹藤组 db/db 小鼠的 FBG、Fins、TC、LDL-C水平降低，提高 ISI 指数，上调骨骼肌组
织中 PI3-K/Akt 途径中磷酸化 Akt（Ser473）蛋白表达和GLUT mRNA表达水平。结论　匙羹藤可改善糖
脂代谢紊乱，增加胰岛素的敏感性，其改善胰岛素抵抗的机制可能与胰岛素信号转导的“经典途径”PI3-K/
Akt 通路有关，通过调节靶蛋白或基因的表达及活性以增加葡萄糖的转运。
关键词：匙羹藤；糖尿病；胰岛素抵抗；骨骼肌；胰岛素信号通路；db/db mice
中图分类号：R282.6 文献标识码：A 文章编号：1673-6427(2015)03-37-04
doi:10.13728/j.1673-6427.2015.03.013
Effects of Gymnema sylvestre on Insulin Resisitance and Insulin Signaling Pathway of
Skeletal Muscle in db/db Mice
LI Juan-e1, WANG Lei2, SUN wen2, QIN Ling-ling2, LIU Tong-hua2*
(1. Shaanxi Provincial People’s Hospital, Xian, 710068, China; 2. Beijing University of CM, Beijing 100029, China)
Abstract: Objective To study the effects and mechanisms of Gymnema sylvestre (Retz.) Schult (GS)on
insulin resistance and insulin signaling pathway of skeletal muscle in db/db mice. Methods 27 db/db mice were
divided randomly according to body weight into Models ( DM ), Gymnema sylvestre group (GS) and Pioglitazone
group(PIO)(n = 9). 8 normal db/+m mice was named normal control group ( NC). Fasting plasma glucose( FPG)
of all mice were tested at every weekend, and at the end of the experiment all animals were tested FPG, Fasting
insulin level( Fins) for evaluating Insulin Sensitivity Index ( ISI ). The expressions of the proteins of insulin
signaling pathway were determined by Western blot and Real-time PCR. Results Compare to model group, the
levels of FBG, Fins, TC、LDL-C are decreased in GS group and Pioglitazone group. The protein expression of
p-Akt(Ser473) was increased in GS treated mice, however, no effect on total Akt, total AMPKα and p-AMPKα.
Conclusion GS effectively decrease blood glucose and body weight, partially improve dyslipidemia and might
ameliorate insulin sensitivity in db/db mice. The mechanism is mainly related to PI3-K/Akt insulin signaling
pathway.
Key words: Gymnema sylvestre (Retz.) Schult; diabetes mellitus; insulin Resistance; insulin signaling
pathway; db/db mice
匙羹藤为萝摩科匙羹藤属植物，又称武靴藤、羊
角藤、金刚藤。印度民间用于糖尿病、哮喘等症。我
国分布广泛，藏量大，但还未受到我国学者的广泛关
注。近年来研究发现其具有降血糖和降血脂的作用，
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但目前大多数研究都停留在药效学方面，缺少对其作
用机制的研究。本研究通过观察 GS 提取物对自发性
2型糖尿病 db/db 小鼠胰岛素抵抗的作用，并从胰岛
素信号传导通路为研究切入点对 GS 改善胰岛素敏感
性的可能分子生物学机制进行探讨。
1　材料
1.1　实验动物
SPF 级 自 发 性 2 型 糖 尿 病 db/db（BKS.Cg-m
+/+ LePrdb/J）肥胖小鼠 27 只（周龄 6 ~ 8 w)，体重
40±10 g ；对照组为同周龄同系别野生型 BKS.Cg-m
（+/+）/J 小鼠 10 只，体重 20±5 g ；均为雄性。购
自南京大学模式动物研究所。质量合格证号：SC×K
（苏）2005-0002。
实验动物均单笼喂养于 SPF 级动物实验中心。
饲养温度：(23±2)℃，湿度：(55±10)%，每日 12 h
光照维持。动物自由饮水进食，饲料由中国医学科学
院协和动物研究所提供。
1.2　药物与试剂
匙羹藤提取物由北京中医药大学药学院提供，方
法为加水煎煮 3次，加水量分别为 10、10、8 倍量，
煎煮时间分别为 1.5、1.5、1 h，滤过，合并，浓缩
至稠膏，70℃真空干燥，粉碎，过 80 目筛。得率为
6.06%。盐酸吡格列酮片：北京太洋药业有限公司，
H20040267。
血脂四项、FFA、胰岛素（放免）试剂盒：
尚柏生物医学技术有限公司（北京）；抗磷酸
化 Akt（Ser473） 抗 体、抗 Akt 抗 体、 抗 磷酸化
AMPKα(Thr172) 抗体、抗 AMPKα抗体：CST 公司，
#4060、#4691、#2535、#2603。
1.3　仪器
西安核仪厂 xh6080 放免仪；酶标仪multiskan mk3
型（Labsystems dragon）；全自动生化分析仪 40FR；德
国罗康全血糖仪及配套试纸。Line-gene 荧光定量 PCR
检测系统：杭州博日科技有限公司；台式高速冷冻离
心机TGL-16 ；转膜仪：J-MAX，# ST-2。
2　方法
2.1　给药方法
给药剂量：吡格列酮组 5.85 mg · kg-1 · d-1（按
成人最大剂量 45 mg · kg-1 · d-1 换算）；GS 组（15 g
· kg-1 · d-1），中药剂量以生药计。正常组和模型组予
同体积生理盐水。各组均按 1 ml · 100 g-1 · d-1（但不
超过 5 ml）的体积给药。给药方式：灌服中药混悬液。
给药时间：每日 4 pm 给药。为期 4周。
2.2　取材
末次给药后禁食不禁水 12 h，随机选取小鼠并按
10 ml · kg-1 体重腹腔注射 1%戊巴比妥钠麻醉，腹主
动脉取血，静置3 h后 3 000转 · min-1 分离血清，-20℃
保存。迅速剥离股四头肌，投入液氮，进行相关检测。
2.3　观察指标及检测方法
2.3.1　血清指标　　FBG 用德国罗康全血糖仪及配
套试纸测定，血清胰岛素用放免法测定，血脂四项
（TC、TG、LDL-C、HDL-C）及 FFA 全自动生化仪
测定，严格按照试剂盒说明书步骤测定。
2.3.2　胰岛素敏感指数 (ISI)　　采用李光伟法 [1]，
ISI=1/ 空腹血糖 (FBG)× 空腹血清胰岛素 (Fins)，取
自然对数。
2.3.3　Western Blot　　样品制备：取冷冻组织称量
约 20 mg，加入蛋白裂解液于冰上匀浆，4℃ 12 000
rpm 离心 10 min，上清液 -20℃冻存。蛋白浓度检测：
按照 BCA 蛋白定量试剂盒使用说明操作。电泳：配
SDS-APGE 胶，取 50 ~ 100 μg 总蛋白加样。转膜：
PVDF 膜先在甲醇中浸润，然后放置转膜缓冲液中
至完全浸透，按照一定顺序放好膜与滤纸，接通电
源，转膜约 45 ~ 90 min ；转膜完毕，放入 TBS-1 中 5
min。
封闭：一抗孵育，将封闭液按照 1：500 稀释，
4℃过夜，TBS-T 洗 3 次，每次 5 min ；二抗孵育，用
封闭液按照 1 : 3000 稀释 HRP 标记二抗，孵育 2 h，
TBS-T 洗 3 次，每次 5 min。
显影与分析：用 ECL 试剂盒反应，X光片压片、
显影、定影，并用LabWorks软件对图像进行灰度分析。
2.3.4　Real-time PCR　　按 RNA 提取试剂盒说明提
取骨骼肌细胞 RNA。基因引物序列为：GAPDH：
Sense ：TGGA GAAACCTGCCAAGT，Anti-sense ：
GTTGCTGTTGAAGTCGCA，产物长度 122 bp；GLUT4：
Sense ：CGAGCCCCAGATACCTCTACATCAT，Anti-
sense：AGCTAGTGCGTCAGACA CATCAG，产物长度 100
bp；反应条件：95℃预变性120 s 后，进行95℃变性20
s，58℃退火25 s，72℃延伸30 s，4℃终止，共45个循
环。根据样品各目的基因扩增过程中发光底物信号强
度达到临界闭值所需要的循环数 (thresholdcycle，Ct) 来
比较样品目的基因mRNA表达的丰度。
2.4　统计学分析
应用 SPSS13.0 统计软件包分析。数据采用 X±s
表示，组间比较采用单因素方差分析。
3　结果
3.1　对 db/db 小鼠 FBG 的影响
表 1 说明，模型组小鼠 FBG明显高于正常组（P
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＜ 0.001）；与模型组相比，吡格列酮组治疗 3周后可
降低 db/db 小鼠的 FBG（P ＜ 0.05），4周后最为显著（P
＜ 0.01），匙羹藤组在治疗 3周后即有统计学意义（P
＜ 0.05）。
表 1空腹血糖水平
Tab.1 The levels of fasting plasma glucose
组别 第 0周 第 1周 第 2周 第 3周 第 4周
db/+ 7.06±0.77 8.33±0.60 8.04±0.69 7.66±0.63 8.42±0.33
模型组 23.40±2.28** 22.71±3.61** 26.09±2.99** 26.31±2.50** 28.61±2.90**
吡格列
酮 22.04±2.71
** 19.24±2.85** 21.81±2.91** 21.48±3.24** + 20.79±4.05**++
匙羹藤 22.53±2.79** 20.38±2.60** 22.79±2.65** 23.04±2.19** + 22.65±3.32**+
注：与 db/+ 相比 **P ＜ 0.01，与模型组相比 +P ＜ 0.05， ++P ＜ 0.01（X +
S ，n = 8）。
3.2　对 db/db 小鼠 Fins、ISI 的影响
表 2 说明，各组 db/db 小鼠空腹血清 Ins 水平比
正常组显著升高，ISI 指数显著降低；与模型组相比，
匙羹藤组没有变化，但能提高 db/db 小鼠 ISI 指数（P
＜ 0.01）。
表 2空腹血清 Ins 和 ISI 水平
Tab.2 The levels of serum Ins and ISI
组别 Ins ISI
db/+ 0.90±0.08 -2.01±0.12
模型组 1.44±0.29** -3.70±0.26**
吡格列酮 1.09±0.16**++ -3.10±0.28**++
匙羹藤 1.21±0.29** -3.26±0.34**++
注 ：与 db/+ 相比 **P ＜ 0.01，与模型组相比 +P ＜ 0.05， ++P ＜ 0.01（X
+ S , n = 8）。
3.3　对 db/db 小鼠小鼠血脂及 FFA 的影响
表 3 血脂及 FFA水平
Tab.3 The levels of blood lipid and HDL
组别 TC TG LDL HDL FFA
db/+ 2.06±0.18 1.06±0.28 1.25±0.11 1.22±0.32 53.55±10.37
模型组 3.16±0.49** 2.42±0.25** 1.91±0.32** 0.68±0.12** 96.36±15.54**
吡格列酮 2.59±0.28** 1.74±0.41**+ 1.76±0.18** 0.95±0.23** 75.25±5.48**++
匙羹藤组 2.50±0.58** 2.29±0.44** 1.65±0.35** + 0.86±0.22** 83.62±8.80**
注：与 db/+ 相比 **P ＜ 0.01，与模型组相比 +P ＜ 0.05， ++P ＜ 0.01（X
+ S ，n = 8）。
与正常组相比，db/db 小鼠血脂中 TC、TG、LDL
水平和血清 FFA 显著升高，而 HDL 水平降低（P
＜ 0.01）；治疗 4周后，与模型组相比，吡格列酮组
TG、FFA 水平明显下降（P ＜ 0.01，P ＜ 0.05），匙
羹藤组 TC、LDL-C 水平降低（P ＜ 0.05），匙羹藤
组血清 FFA 水平仅有下降趋势，没有统计学差异（P
＞ 0.05）。见表 3。
3.4　 对骨骼肌组织 Akt 和 AMPK 蛋白及 GLUT4
mRNA 表达的影响
Western blot 结果显示（见表4和图1），模型组db/
db小鼠骨骼肌组织中p-Akt（Ser473）和 T-Akt 蛋白表
达水平比健康组 db/+ 小鼠均有明显降低（P ＜ 0.01，
P ＜ 0.05），治疗组中，吡格列酮、匙羹藤 p-Akt
（Ser473）蛋白表达与模型组相比升高（P ＜ 0.05）；对
p-AMPKα(Thr172) 的蛋白表达有增高趋势，但无统计
学意义。db/db小鼠骨骼肌组织中GLUT4 mRNA表达水
平显著低于健康的db/+小鼠（P ＜ 0.01）；匙羹藤可以
提高GLUT4 mRNA表达（P ＜ 0.01、P ＜ 0.05）。
表 4 骨骼肌组织 Akt 和 AMPKα蛋白表达水平
Tab. 4 The protein expressions of Akt and AMPKα in skeletal muscle
组别 p-Akt(Ser473) T-Akt p-AMPKα(Thr172) T-AMPKα
db/+ 1.38±0.06 1.25±0.08 0.54±0.04 0.79±0.02
模型组 0.85±0.17** 0.98±0.06* 0.28±0.08* 0.67±0.15
吡格列酮 1.31±0.11 + 1.20±0.08 0.43±0.04 0.75±0.03
匙羹藤 1.27±0.17 + 0.98±0.05* 0.41±0.07 0.65±0.15
注：与 db/+ 相比 *P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，与模型组相比 +P ＜ 0.05， ++P
＜ 0.01（X + S，n = 5）。
图 1 骨骼肌组织中 Akt 和 AMPKα蛋白表达
Fig.1 The protein expressions of Akt and AMPKα in skeletal muscle
表 5 骨骼肌组织GLUT4 mRNA表达水平
Tab.5 The mRNA expression of GLUT4 in skeletal muscle
组别 GLUT4
db/+ 0.86±0.11
模型组 0.39±0.09**
吡格列酮 0.78±0.08 ++
匙羹藤组 0.56±0.11*+
注 ：与 db/+ 相比 *P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，与模型组相比 +P ＜ 0.05， ++P
＜ 0.01（X + S，n = 5）。
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4　讨论
胰岛素抵抗（Insulin Resistance，IR）贯穿于
T2DM发生发展的始终，而骨骼肌是体内葡萄糖利用
的主要场所 [2]。胰岛素信号转导是胰岛素与靶组织细
胞表面胰岛素受体结合后，经过信号传递使葡萄糖转
运体 -4（Glucose transporter 4，GLUT4）转位到细胞
膜摄取葡萄糖，包括胰岛素受体底物 (Insulin receptor
substrate-1，IRS)- 磷酯酰肌醇 -3- 激酶 (PI3-K) 途径
和 Ras-MAPK 途径 [3]。胰岛素介导 PI3-K/Akt 信号通
路是胰岛素代谢功能的主要途径。在胰岛素刺激下，
PI3-K 首先与胰岛素受体酪氨酸激酶磷酸化的胰岛
素受体底物 (Insulin receptor substrate，IRS) 结合并活
化，通过激活磷酸肌醇依赖的蛋白激酶 1(PDKI)，最
终激活丝 / 苏氨酸蛋白激酶 Akt/PKB[4, 5]。大量实验证
明，Akt/PKB 的激活可以引起 GLUT4 向细胞膜的移
位 [6]。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP- activated protein
kinase，AMPK）是一种高度保守的丝氨酸 / 苏氨酸蛋
白激酶，是细胞能量感受和代谢稳态的调节器，被认
为是“真核生物的细胞能量调节器”。当体内能量缺
乏时，伴随着AMP/ATP、肌酸 /磷酸肌酸比值的升高，
AMPK 被磷酸化和激活，从而打开 ATP 生成途径，
关闭 ATP 消耗途径，然后通过一些未知的途径作用
于细胞内，使细胞内的 GLUT4 转位至细胞膜上，增
加骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取和利用，以弥补细胞内
ATP 的不足。
db/db 小鼠是由于 db 基因突变导致瘦素受体缺
失的自发性肥胖 2 型糖尿病小鼠，表现为严重的胰
岛素抵抗和进行性的胰岛素缺乏 [7]，该小鼠多年来作
为预防肥胖、高血糖和 IR 的干预治疗模型。在本次
研究中，db/db 小鼠股四头肌组织 p-Akt（Ser473）、
总 Akt 和 p-AMPK（Thr172）蛋白表达及 GLUT4 的
mRNA 表达水平显著低于健康的 db/+ 小鼠，与相关
研究结果相符 [8-10]。
匙羹藤目前是临床报道及实验研究证实具有治
疗糖尿病的单味中药，降血糖的活性成分主要是一
系列的三萜皂甙类化合物—匙羹藤酸（Gymnemic
acid，GA），在叶中的含量为 3.9 ~ 9.6%[11]、牛弥菜
醇 A（Conduritol A）[12] 等。GS 及其有效成分防治糖
尿病的可能机制主要有 [13]：（1）促进胰岛素的分泌；
（2）保护胰岛β细胞；（3）增加葡萄糖的利用，增
加胰岛素介导葡萄糖摄取；（4）抑制肠道葡萄糖的吸
收，等。在我国，GS 广泛分布于南方各省区，藏量大，
但还未受到我国学者的广泛关注。对 GS 降血糖的研
究大多停留在药效学的水平上，其降糖机制和活性成
分还不是十分透彻，尤其是对于胰岛素抵抗方面的研
究却很少。
本实验利用分子生物学方法，从胰岛素信号传导
通路为研究切入点对 GS 改善胰岛素敏感性的作用机
制进行研究。结果表明，匙羹藤能明显降低自发性 2
型糖尿病 db/db 小鼠体重、FBG、TG 和 LDL 水平，
提高了 ISI 指数，证实了匙羹藤具有改善 2型糖尿病
糖脂代谢紊乱的作用，并通过上调该基因 Ser473 位
点的磷酸化蛋白表达水平，在一定程度上可能上调其
下游底物及 GLUT4 的转位，通过改善受损的胰岛素
信号转导增加外周组织胰岛素的敏感性。
参考文献
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收稿日期：2015-02-01
（编辑　王　宁）