全 文 ：苦玄参 HL PC 指纹图谱研究
邹节明 , 吴敏菊 , 王力生 (桂林三金药业股份有限公司 ,广西 桂林 541 溯 )
摘要 : 目的 研究苦玄参的高效液相色谱指纹图谱 , 为科学评价及有效控制其质量提供可靠方法 。 方法 采用 H P I龙一 D AI ) 分
析法 , 梯度洗脱 , 测定 了 10 批苦玄参样品 。 色谱条件为 : YM c J` vhs er o D-s M 80 (4 . 6 ~ 火 巧。 ~ , 4 脚 )分析柱 , 柱温为 35 ℃ ;
流动相 A 为 乙睛 ;流动相 B 为 l% 醋酸水溶液 。 流动相 A 梯度洗脱 ( 15 % 一 45 % 乙睛 ) , 分析时间为 65 而 n , 时间为 O , 5 , 10 , 印 ,
65 而 n , A ( % )为 巧 , 巧 , 20 , 45 , 5 , 流速为 1 . O rnL ·而 n 一 ’ , 检测波长为 254 nm 。 结果 10 批苦玄参样品得到的指纹图谱有 8 个共
有峰 ,通过与时照品的保留时间及紫外光谱比较 , 1 , 2 , 6 , 7 , 8 号峰分别鉴定为顺式 阿克普 、 阿克芬 、 苦玄参替 IB 、 苦玄参等 W和
苦玄参谷 I A 。 结论 建立的 H p L( : 才旨纹图谱分析法能较好地反映苦玄参中三枯和苯 乙醇苍两大药效部位 , 可 用于苦玄参的质
量控制 。
关键词 :苦玄参 ;指纹图谱 ;三花 ; 苯乙醇普
中图分类号 : 2R 84 . l 文献标识码 : A 文章编号 : 10 卜 2 494 ( 2X(j 5 )伪州万抖 一 03
H r L C 伪吧e pr inr t of P趾对远户吞勿” 恤`
ZOU J ie
一而 n g , V用 M i n 一 ju , W AN G h 一 s h e n g ( 。 ` zin s njZ in 尸丙d 了刀砚袱 )以应飞汉 oC . 砚 , 俪 il n 5 4 1似 , hC i na )
川昭 T R A C T : O旧. IE C T n飞 oT es abt lj hs a ~ 证ve an d
s卿访 c H P LC me d l侧」for 面 qu ial yt c on lD I of l饺’l公Z fel -艺巴刀 2友 尹物。 . 州便汀H O D6
H既兀 me th侧 1~
a耐记 d for het qU a】iyt as se ~ nt of P ic r反之-fel et 们仪2￡ L 〕u r
.
r
f l
l e p此 p a r a t ion of ~ 禅e
,
ht
e
H P忧 c ol ~
, 训山il e p h a s e ,
e
lut i
o n 111侧」e ( iocs 曲 e a l l ( l g r a山 e nt ) a l l` l脚 d ie n t l〕m gr an . we re otP iim ze d i n o n le r ot Ob t a in ih gh 明al i ty Hp LC p iorf le . r r h e Hp L C 叮 st e m o o n -
is tde of
a
W ate 、 2 69 5 p l l ll l l〕 a l l d a , 拓 p lol tde i侧如卜 田 T a y de cet otr ( DA )D
.
1)a ta we er ac 卿 er d adn l〕 n 洲二 e s刻 iwt h the E l l l l洲 〕we r W O r k s at i(’n .
Hp LC
a n a ly s i s
aws 详` 爪 1祀 d o n a Y M C J
, s
heP
o o璐 M so ( 4 . 6 m 火 1 5 o mxn , 4 脚 ) 初 ht 阮 m ix ture of ac e ot in 示 le ( A ) 出】d l % ac e t ie
ac id a 甲le o us os lut io n ( B ) as hte m o b ile p崛 e in g r a击e nt 111仪 Ie . ” l e e o cn e l l`m t ion s of os lve n t A we , 15% , 15 % , 功% , 4 5 % an d 好% a r
o
,
5
,
10
, 印 耐 砧 而n , 馏卿 t iv e ly . 仆 e e ol unm t e ln详 r a呱 was se t at 3 5℃ , het now art e w as 1 . o mL ·而 n 一 l , an d ht e d e t e e t io n w a v e -
le l嚼11 was at 254 nl
.侧路U日旧 hT e H P LC if l l g e pr n nt of l饭咸王-fel et ~
, s卜附 ing 8 e h a r a c et ir ist c l℃a k s , w as es tab il hs de fn 〕111 or l(,t s of
产饭元口 ~fle ~
. 场 c o n l l诏 n son of ht e er ent it on it me an ( } het o -n h ne VU s lx , 二加 of c he 而 C滋 s t a n d a rd s , pe ak l , 2 , 6 , 7 and 8 w e er ide int 价d
as C i -s 二 eot s id e , ac teos ide , p ie fe lt a n 习 e in n I B , iP e fe l t~
in n IV a rl d p i
e
fe lt
a ll习 e in n l人 , er s l犯 c it v e ly
.
C O N (工 U S】O N hT e 11PIC if卿甲 n nt
of 浅ha fe -l et ~ iw ht hi hg s lM , :讯 ic yt c an 玩 u渊 1 ot co 咖 I池 ( p l a li yt .
K E Y W ( ) R刃居 : 于公了 id fe -l et ~ 助 ur
.
; 田 , LC if哪甲 ir nt ; itr e r’pe on1 d ; 油 en vle 山an io d 蜘 c os id e
苦玄参为玄参科 ( cs or p hu ialr ac eae )植物苦玄参
( icP iar fe l
一
et
~ 肠 ur
.
)的干燥全草 ,味苦 ,性寒 ,具有
清热解毒 、 消肿止痛 的功能 ,用于风热感冒 ,咽喉肿
痛 ,痒腮 , 胃热腹痛 ,痢疾 ,跌打损伤 ,疖痈 ,毒蛇咬伤
等川 ,在我国主要分布于广西 、 广东和云南的南部 。
广西科技工作者对苦玄参开展 了大量的研究工作 ,
先是规模化种植获得成功川 ,接着通过药理实验证
明苦玄参提取物具有抗肿瘤〔3 3 、抗蛇毒 [’] 的作用 ,从
中分离鉴定了一系列葫芦苦素类三菇成分〔’ 〕 , 并研
制成功数个以苦玄参为主要成分的中成药困 。 但
是 , 苦玄参的有效成分尚不明确 7}[ 。
为更好地开发利用苦玄参这味具有广西地方特
色的药材 ,我们以三菇为指标 ,对苦玄参提取物开展
了超滤法 t s〕和大孔树脂法卜 ’ 0] 纯化研究 , 以及化学
成分研究〔川 ,首次发现了苦玄参中存在大量的苯乙
醇营类化合物 ,该类化合物的分离鉴定将另文报道 。
本实验采用 R P ~班飞C 开展苦玄参的指纹图谱研究 ,
并对不 同产地和不同批次的药材指纹图谱进行了分
析比较 。
1 仪器与试药
1
.
1 仪器
W a te sr 2 69 5 一 9 6 系统〔含在线氮气脱气 , 低压
四元梯度泵 , 自动进样器 , 柱温箱 ,二级管阵列检测
器 (孤 D ) j , E n l l刃w e r 色谱工作站 , M i ll i即er D i , e t一 Q『 Mr
纯水仪 。
1
.
2 试剂
作者简介 :邹节明 ,男 ,教授 ,博士生导师 eT l : ( 07 7 3) 5 84 25 8 E一。 l : Sanj in @ 91 . 罗 . o ionf , en t
6 4
·
hC in 产丫. 又m z J , 2众万 之婉 , , Vol . 40 oN . 夕 中国药学杂志 2侧巧 年 5 月第 40 卷第 9 期
乙睛 (色谱纯 , M e cr k 公 司 ) ;超纯水 ; 甲醇和冰
醋酸 (分析纯 ) 。
1
.
3 对照 品 、 药材
对照品 : 苦玄参昔 IA 、苦玄参昔 IB 、苦玄参昔 W 、
J顷式阿 克 昔 、 阿 克 昔 (作者 自制 , 其纯 度分别为
9 8
.
7%
,
97
.
4%
,
9 6
.
7%
,
9 1
.
4 %
,
94
.
60 % )
。
药材 : 各药材样品来源见表 1 , 经桂林三金药业
股份有限公司钟小清硕士鉴定为玄参科植物苦玄参
( icP iar fe Z
一
et
~ 助 u
r
.
)的干燥全草 。
表 1 苦玄参药材来源
T a b 1 O ir g srL Of sam p l
e s
样品编号 购人 、 采集地点
广西南 `犷
广西梧州 T
广西梧州 n
广 西防城港
广西龙州 工
广西龙州 n
云南
商品 0 305 m
商品 0引〕80 1
商品 03 10 1
时间
2 (洲)3 . 8
2 (旧3 . 8
2《汉月 . 5
2 1义抖 . 5
2 (们 3 . 8
2 (X抖 . 5
2〕〕3 . 8
ZJ ) 2
.
9
2 (洲〕3 . 5
2〕 又 . 6
2 方法与结果
2
.
1 对照品溶液的制备
精密称取苦玄参昔 IA 、 苦 玄参昔 IB 、苦玄参昔
W
、顺式阿克昔 、 阿克昔对照品各适量 , 以甲醇溶解 ,
分别制成每 l nrL 含苦玄参普 IA 、 苦玄参昔 IB 、苦玄
参昔W 、 顺式阿克昔 、 阿克昔 0 . s gfn 的对照品溶液 。
2
.
2 供试 品溶液的制备
取苦玄参 l 以 x〕 g ,粉碎成细粉 ,称取药粉 1 9 ,用
50 % 的甲醇 20 nrL 超声处理 30 而 n , 滤过 , 取续滤液
用 0 . 45 拜m 微孔滤膜滤过 ,作为供试品溶液 。
色谱条件 : 色谱柱 : YM e J , s p h e er OD S一 M S O ( 4 . 6
~
x 巧。 ~
,
4 脚 ) ;柱温 : 35 ℃ ;流动相 : 按表 2 的
条件进行梯度洗脱 ;检测波长 : 254 nm ; 流速 : 1 . 0 m L
·
m i n
一 ’ :进样量 : 10 拌L 。
表 2 流动相梯度条件
T a l〕 2 C o n id ti o ns of gar id
e nt e l
u t io n
t/ m j
n
(A 乙睛 ) / % (B 1% 醋酸水溶液 )/ %
0 15 85
7
,峰 8 与各 自前面 的峰分别为 3 . 84 , 3 . 05 , 1 . 89 ,
2
.
04
。
.2 .3 2 精密度实验 精密吸取苦玄参药材 (批号
0 3 0 50 1 )供试品溶液 10 拜L , 连续进 样 5 次 , 按 “ 2 . 2 ”
项下色谱条件测定 ,结果表明 ,指纹图谱中规定标定
峰的绝对保留时间 、 相对保留时间和峰面积的比值
基本一致 ( RS D 分别为 0 . 26 % 一 0 . 90 % , 0 .以% -
0
.
63 %
,
0
.
45 % 一 2
.
86 % )
, 符合指纹 图谱的检测要
求 。
2
.
3
.
3 稳定性实验 精密 吸取苦玄参药材 (批号
0 30 5 0 1 )供试品溶液 10 拌L ,分别于 。 , 2 , 4 , 8 , 12 , 2 4 h
进样 ,按 “ 2 . 2 ” 项下色谱条件测定 ,结果表明 ,指纹图
谱中规定标定峰的绝对保留时间 、 相对保留时间和
峰面 积 的 比值基 本一致 ( SR D 分别为 0 . 84 % -
1
.
40 %
,
0
.
46 %
一 2 . 41 %
,
1
.
76 % 一 2
.
34 % )
, 表 明样
品在 24 h 内稳定 。
2
.
3
.
4 重复性实验 取苦玄参药材 (批号 03 05 01 ) 5
份 ,精密称定 , 按 “ 2 . 2 ” 中的方法制备成供试品溶液
并测定 , 结果表明 ,指纹图谱中规定标定峰的绝对保
留时间 、 相 对保留时 间和峰面积 的 比值基本 一致
( RS D 分 别 为 0 . 8 9 % 一 2 . 5 1% , 0 . 0 1% 一 1 . 7 7% ,
1
.
38 % 一 2
.
7 % )
,表明方法重复性良好 。
2
.
4 指纹图谱的建立
2
.
4
.
1 指纹图谱的制备方法 分别精密吸取对照
品溶液和供试品溶液各 10 拜L 注入液相色谱仪 , 分
别按 “ 2 . 2’ 色谱条件测定 ,记录 65 而 n 的色谱图 , 结
果见图 l 。
. , 。
J
.2 3 方法学考察
2
.
3
.
1 系统适应性实验 理论板数以峰 6( 苦玄参
昔 IB )计 , 不低于 20 仪x ) 。 相邻峰之间的分离度数
值 : 峰 1和峰 2 为 5 . 28 ;峰 4 和峰 5 为 5 . 26 ;峰 3 , 峰
7 与各自后面的峰分别为 2 . 麟 和 3 . 1 ;6 峰 4 ,峰 6 , 峰
中国药学杂志 2以巧 年 5 月第 40 卷第 9 期
! 0 2 0 3 0 4 0 5 0 60
t / m In
图 1 苦玄参 H PL(: 指纹 图谱
n g 1 PH CL 6
l l g e 甲 ir nt of 产从了 6z j毛l~ 八 , 八理e
.2 .4 2 共有峰的确定 取表 1中的 10 批苦玄参药
材 ,分别按 ` ,2 . 2’ 中的方法制备供试品溶液 , 比较其色
谱图 , 以苦玄参昔 IB的色谱峰为参照物峰 (相对保留
时间为 1 ) ,标示了 8 个共有峰 ,各共有峰的相对峰面
积和相对保留时间的比值见表 3 。
2
.
4
.
3 指纹图谱的相似度计算 参照文献 [ ’ 2」的相
似度计算方法 ,以 10 个批次苦玄参药材的相对峰面
积的均值作为对照模板 , 根据峰匹配的结果用 xE ce l
20 2 对上述的 10 个批次的产品进行相似度计算 ,样
85即巧204545510团65
品讯 2丫la 7nr J , 2记涅又, 麒 2了 , 翻 . 40 VoI . 9 · 6 5
表 3 不同批次苦玄参药材各共有峰的相对峰面积和相对保留时间
T a b 3 R
e
l
a t iv e t。 (aer
a
) of r!
l e o
om
n 伴 ksa o f 10 lo ts
各批次药材相对峰 面积 /相对保留时问峰号 — — ——1 2 3 4 5 6 7 81 0 . 7 /0 . 28 0 t叫 /0 . 28 0 . 0 9 / 0 . 92 0肠 /0 . 28 0 , (片0/ . 29 0 . 24 0/ . 28 0 . 31 0/ . 27 0 . 】90/ 呀2 1 26 0/ . 31 1 41 0/ 刃 0 `图 / 0 . 31 0 . 10 0/ . 30 住 05 0/ 刃 以 67 0/ ` 30 0 】9 0/ . 30 0 . 28 / 0 . 劝3 0 83 / ( ) . 35 l . 0’7 / 0 . 科 0 一 43 0/ . 32 0 . ] 30/ . 33 0 . 10 0/ 34 0 . 16 /习 . 34 0 . 3 2 0/ . 33 0 . 38 / () 3 54 0 . 3 20/ . 4 1 0 3 80/ 4 1 0 . 370/ ` 4 ] 0 _ 4 0/ . 4 1 0 4 0/ 4 1 0 . 又 们 t 4 】 0 . 3 10/ 4 1 0 30 0/ 4 15 1 . 46 0/ 4 5 1 . 6 20/ 科 1 . 68 0/ t 45 1 2 20/ . 45 1 1 50/ . 4 1 . 35 0/ . 45 1 以0/ t 45 1 . 31 0/ 4 56 1 0 / 1 0 1 0 l/ . 0 1 .仅) / 1 . 0 1 田 / 1 . 0 1 田 / ! . 0 1 0 I/ . 0 1 . 田月 . 0 1 (U I/ ` o7 0 15 / I t 的 0 . 14/ 1 . 10 0 . 1 2 / 1 . 10 0 14 / 1 10 0 璐 / 1 . 图 0 . 15 / 1 . 10 0 14 / 1 . 10 0 . 1 1 / 1 108 1 . 2 4 1 . 14 1 . 33 / ] . 14 1 . 18 / 1 14 1 46 / 1 14 1 .4 / 1 . 13 2 . 0 1 / 1 14 1 . 33 / 1 . ] 4 1 31 / 1 14注 : 以苦玄参什 坛峰峰面积为分母 ,各样品各个色谱峰峰面积为分子 ,求得该色谱峰的相对峰 面积值Not :e 以 e 既 ~ of lP d e l l ”` 1习心工 n in l 路 击 l(I 价 11卫 d or , ta ke hte 一 of $ ” 111俪 as ~ m加 . 出 ld 罗 t tl 1’? re la Vtl e ~ 9 100 . 4 / 0 . 29 0 42 / 0 . 2 80 , 9 10/ . 31 0 92 / ( ) 300 . 40 0/ . 35 0 370/ . 34( ) . 3 50/ . 4 1 0 . 28 0/ . 4 11 . 4 0/ ` 45 1 02 0/ 451 . (幻 , .田 1 . 《汉〕 / 1田0 . 1 1 / 1 10 0 . 1 () / 1 101 56 / 1 . 14 1 .粼 ) / 1 . 14品 l 一 10 的相 似度 分别 为 0 . 7 9 7 , 0 . 7 28 , 0 . 9 25 ,0 . 94 0 , 0 . 94 5 , 0 . 9 5 4 , 0 . 9 6 1 , 0 . 98 7 , 0 . 96 8 , 0 . 9 16 。 其中 ,样品 l 和样品 2 的相似度较差 , 主要是其 1号和2 号峰的峰面积偏大所致 。2 . 5 共有峰的归属取苦玄参营 IA ,苦玄参昔 IB , 苦玄参昔 W ,顺式阿克昔 ,阿克昔等对照品溶液各 5 拌L ,分别按 “ 2 . 2 ”中的色谱条件测定 , 对比相对保留时间和相应时间位置上的色谱峰的紫外光谱图 , 确定指纹谱中的 1号峰为顺式阿克昔 , 2 号峰为阿克昔 , 6 号峰为苦玄
参昔 1 , , 7号峰为苦玄参昔W , 8 号峰为苦玄参昔 IA 。
3 讨 论
3
.
1 比较了多种不同的流动相进行等度洗脱与不
同比例流动相进行梯度洗脱对苦玄参指纹图谱的影
响 ,发现等度洗脱得到的色谱峰较少 ;而采用梯度洗
脱 ,能比较全面地反映苦玄参中三砧和苯乙醇昔这
两大药效部位 。 因此本实验建立的色谱条件采用梯
度洗脱 。
3
.
2 比较了波长在 21 0 一 4《{幻 nlI 所测得的 HP L〔: 图
谱 ( DAD 检测器检测 ) , 结果表 明 , 检测波长在 2 54
nJ 时 , 其 H l〕L〔: 图谱中可观察到较多 的色谱峰 , 同
时各色谱峰分离效果较 好 , 故检测波长选择 2 54
n 】】1 `,
3
。
3 考察了水 、 甲醇 、 乙醇 、 70 % 乙醇和 50 % 甲醇等
多种提取溶剂 ,结果表明 , 50 % 甲醇超声处理对苦玄
参中的化学成分提取效果最好 , 处理方法也 比较简
单 。
.3 4 不同产地的苦玄参指纹图谱中 , 主要色谱峰
的整体图貌基本一致 , 但各成分的含量的相对 比值
有较大的差别 。 一份采 自广西宾阳的样 品 , 经鉴定
为唇形科植物 ,外形与苦玄参非常相似 ,但其指纹图
谱与其他苦玄参样品差异很大 , 基本判定该样品不
宜作为苦玄参使用 。
参考文献
「1 ] 厂一西中药材标准仁S〕. 19 2 : 62 一 63 .
仁2 1 黄正福 . 苦草引种栽培研究简报 〔J ] . 植物研究通讯 , 1978 ,
(4 )
: 4
.
「3〕 钟树权 , 张本能 ,黄福祥 . 抗肿瘤草药— 苦草仁J」. 中草药通讯 , 197 9 , 3 : 46 .
14 〕 洪庚辛 , 滕忠 ,韦宝伟 ,等 . 27 种 中草药的蛇毒作用观察 〔J ) .
中草药 , r9 83 , 14 ( 4 ) : 加 ,
攀5 ] “ 出 1 1关 , Che n YQ , hZ ou 哪 , 以 a l . s tud i、 on t ir te卿 n in d s , 记
het
, r gl y
e
os ide o lh刀】1 Ch i
n e
se M浦 e i耐 h e ht 尸优 r衣王 . fel 一 t a .ar I , r〔 J〕 . 毖 du 。 讥 口卿切众 汤`件刀“ t叮 , 19 86 , 26 (l ) : 95 ·
〔` 〕 陈勇 . 几种含苦玄参的中成药定性定量研究 〔J 〕. 中国现代应
用药学 , 2以幻 , 17 ( 2) : l伪 .
[ 7〕 陈仲良 ,赵佩珍 . 民间药苦草 (炎间宁 ) 的研究概况 [ J〕. 中成
药研究 , 1986 , 6 : 3 .
「8] 邹节明 ,阮征 ,李建华 , 等 超滤技术分离中药有效成分的实
验研究 [ J〕. 中国医学学报 . 2。 〕3 , 18 ( 2) : 76 .
〔, ] 邹节明 ,陆浩 , 何斌 ,等 . 苦玄参 、黄岑与黄柏 的大孔树脂提取
方法 [ J] . 中草药 , 2 0 3 , 34 ( 3 ) : 2 2 .
110 〕 于 力生 ,邹节明 ,郭亚健 . 大孔树脂纯化苦玄参总皂昔的研究
「J ] . 中草药 , 2川玛 , 35 ( 5 ) : 一4 .
[ n l 王力牛 , 马学敏 ,郭亚健 , 等 . 苦玄参的化学成分研究「J ] 中
国中药杂志 , Z J又 , 29 ( 2) : 149 .
上U ] 苗爱东 ,孙殿甲 . xE el Z《x )2 在指纹图谱相似度计算中的应用
仁J 3 . 药学进展 , 2〕 〕3 , 2 7 ( l ) : 5一
(收稿 日期 二2侧碎一07 一 25)
《中国药学杂志》等在第三届国家期刊奖评选中获奖
国家新闻出版部署组织的第三届国家期刊奖现已揭晓 , 中国药学会主办的期刊共有 3 种杂志在此次评选中获奖 ,其中《中
国药学杂志》荣获第三届国家期刊奖 (共计 印种 ) , 《中草药》荣获第三届国家期刊奖提名奖 (共计 1印 种 ) , 《中国中药杂志》荣
获第三届国家期刊奖百种重点期刊奖 (共计 197 种 ) 。
6 6
·
hC 讯 了叭。 nrT J , 2亡刀S M妙 , 价1. 40 肠 . 9 中国药学杂志 2以巧年 5 月第 40 卷第 9 期