全 文 ：22 卷 3 期
2006 年 5月
生　物　工　程　学　报
ChineseJournal of Biotechnology
Vol.22 　No.3
May　2006
　
Received:November 28 , 2005;Accepted:February 20, 2006.
＊ Corresponding author.Tel:91-4822-212316 , 17;Fax:91-4822-216313;E-mail:den_thuruthiyi l@yahoo.com
Abbreviations　ABA:abscisic acid;2, 4-D:2 , 4-Dichlorophenoxyacetic acid;GA3:gibberelli c acid;Kn:kinetin;MS:Murashige and Skoog.
＊＊本文英文原文请浏览本刊英文版:http: www.sciencedirect.com science journal 18722075
糖 、GA3及 ABA对印度娃儿藤(Tylophora indica (Burm.f.)Merrill)体
细胞胚发生的影响
Effect of Sugars , Gibberellic Acid and Abscisic Acid on
Somatic Embryogenesis in Tylophora indica (Burm.f.)
Merrill＊＊
T.Dennis Thomas＊　张玉霞　译
Postgraduate and Research Department of Botany , St.Thomas College , Pala , Arunapuram(P.O), Kottayam(Dt.), PIN- 686 574, Kerala , India
摘　要　从印度娃儿藤节间外植体获取愈伤组织 , 分析了糖 、赤霉素(GA3)及脱落酸(ABA)对愈伤组织形成体细胞的影响。实
验证明 ,含 4μmol L 2 , 4-二氯苯氧乙酸(2 , 4-D)的MS 培养基是获得具有成胚功能的愈伤组织的最佳培养基。在含有6μmol L
激动素(Kn)的 MS培养基上 ,高达 69%的愈伤组织分化为体细胞胚 ,平均单位外植体(每克愈伤组织)产胚 25 个。在 6μmol L
Kn存在的条件下 ,分析了蔗糖 、葡糖糖对胚产生的影响 ,不同的糖及不同糖浓度对体细胞胚的发生影响很大。6 μmol L Kn 与
200 mmol L蔗糖处理胚胎发生率最大(71%), 单位外植体生成 49个胚。然而葡萄糖与 Kn、或者葡糖糖 、蔗糖与 Kn三者加在一
起则降低成胚率及产胚数。一定浓度的 GA3和 ABA 能促进体细胞胚的产生。 在含 200 mmol L蔗糖的培养基中加 10 μmol L
GA3 胚的生成率为98%,单位外植体产胚 51个。在含 200 mmol L蔗糖的培养基中加 2μmol L ABA 能显著增加体细胞胚的量 ,
该培养基上每外植体平均生成 44 个胚 , 产率为 95%。本研究显示 , 含 200 mmol L蔗糖的培养基中分别加入 6 μmol L Kn、10
μmol L GA3或者 2 μmol L ABA能显著提高印度娃儿藤体细胞胚发生率 , 而单独的葡萄糖或葡糖糖和蔗糖则有抑制作用。得到
的胚均能正常发育并分化为植株。
关键词　ABA , GA3 ,体细胞胚 , 糖 ,印度娃儿藤
中图分类号Q813　　　文献标识码　A　　文章编号 1000-3061(2006)03-0465-07
Abstract　The effect of sugars , gibberellic acid (GA3)and abscisic acid (ABA)on somatic embryogenesis from internodal
explant-derived callus of Tylophora indica (Burm.f.)Merrill has been investigated.Embryogenic calli were produced from
internodal explants and the best resultwas achieved by using MS medium supplemented with 4μmol L 2 , 4-Dichlorophenoxyacetic
acid (2 , 4-D).Up to 69% of such embryogenic calli differentiated into somatic embryos with an average of 25 embryos per
explant (per gram of the calli)on Murashige and Skoog (MS)medium containing 6μmol L kinetin(Kn).The individual effect
of sucrose and glucose together with 6μmol L Kn was evaluated.There was a significant difference among concentrations of sugar
and among kinds of sugar tested in somatic embryogenesis.Sucrose at 200mmol L with 6μmol L Kn gave rise to a maximum
embryogenesis(71%)with an average of 49 embryos per explant.However , glucose together with 6μmol LKn or a combination
of glucose , sucrose and 6μmol L Kn reduced the percentage of embryogenesis culture and the number of embryos per explant.
The presence of GA3 and ABA at particular concentrations promoted somatic embryogenesis in T.indica.The addition of
10μmol L GA3 into the 200mmol L sucrose-containing medium gave a 98% embryogenesis response with an average of 51
DOI :10.13345/j.c jb.2006.03.022
embryos per explant.Somatic embryogenesis was significantly enhanced by the addition of 2μmol L ABA to 200mmol L sucrose-
containing medium.On this medium 95% embryogenesis with an average of 44 embryos per explant was observed.The study
reported here indicates that 200mmol L sucrose with 6μmol L Kn , 200mmol L sucrose with 10μmol L GA3 and 200mmol L
sucrose with 2μmol LABA significantly improved somatic embryogenesis in T.indica whereas glucose alone or in combination
with sucrose had an inhibitory role.The embryos obtained developed normally and were easily converted into plants.
Key words　abscisic acid , gibberellic acid , somatic embryos , sugar , Tylophora indica
　　用生物技术方法能克服许多传统植物育种的不
足。体细胞胚是植物基因工程和体外人工育种中最
重要和最简便的系统 。它能减少植物繁殖的时间 ,
降低种子遗传突变频率。因此许多研究致力于一些
植物的体细胞胚发生 ,也有专门研究生理及生化因
子对诱导和形成一些作物的体细胞胚发生影响的报
道[ 1 ,2] 。
印度娃儿藤是一种有毒的医药用藤本植物 ,该
植物的叶和根都含有具有很高药理学活性的娃儿藤
生物碱和娃儿藤次碱 ,研究发现该植物还具有治疗
支气管哮喘 、通便 、促使发汗和祛痰的作用[ 3] 。由于
不合理的过度开发利用 ,该植物的野生种数量在以
惊人的速度下降。印度娃儿藤一般是以种子繁殖 ,
由于异花授粉 ,该植物品种严重杂合。由于种子成
活力和萌发率非常低 ,使得该植物不易以种子进行
扩大繁殖 ,因此 ,利用可靠的无性繁殖体系代替种子
繁殖 ,可以很好的满足药用需求 ,并且可以保存这种
珍贵的药用植物资源 。体外无性繁殖对保存和繁殖
娃儿藤生物碱和娃儿藤次碱含量高的基因型非常有
利。植物组织培养为以后的遗传操作和提取特异的
植物次生代谢产物奠定了基础 。印度娃儿藤芽培
养[ 4] 、愈伤组织培养和原生质体培养等已有多篇报
道[ 5-10] ,体细胞胚发生的研究也已有报道[ 11 , 12] 。但
这些都是初步的探索研究 ,大量获得体细胞胚还需
进行更 深入的 研究 和更 完善 的技 术 体系 。
Chaudhuri
[ 12]等人的研究为获得该植物大量体细胞
胚的可能性提供了有力的依据。许多研究表明糖 、
GA3 和ABA在不同的组织培养系统中对胚芽的生
长起到了积极的作用[ 13-16] 。但是不同浓度的糖 、
GA3 和 ABA 对体细胞胚的形成还没有研究报道 。
因此 ,在本研究中我们报道了糖 、GA3 和 ABA对印
度娃儿藤体细胞胚的形成的影响。
1　材料与方法
1.1　材料处理
从校园附近的田里选取健壮植株的节间部分 ,
用 1%Savlon溶液(含溴棕三甲铵 ,一种洗涤剂和消
毒剂;Johnson and Johnson ,美国)充分洗涤 10min 后
用无菌双蒸水彻底冲洗干净。节间部分 0.1%
(V V)升汞表面消毒 5min后 ,用无菌双蒸水漂洗 3
次。
1.2　实验方法
处理好的节间部分切成 1cm 左右的小段放于
加有 4μmol L 2 , 4-D 的 无 菌 Murashige Skoog
(1962)[ 17] 培养基(MS 培养基)以诱生具有成胚功能
的愈伤组织 。MS 培养基添加 0.8%(W V)的琼脂
(Qualigens , Mumbai India)用于培养实验 。生长调节
因子添加到培养基中用 1mol L NaOH 调节 pH 到
5.8。所有培养基都在 121℃、103kPa 条件下灭菌
20min。GA3和 ABA过滤除菌后加至灭过菌的培养
基中 。所有培养均在 24℃ ,光照 16h 8h (白天 夜
间)的条件下进行 ,光源为冷白色荧光灯(Philips ,
India)。实验为完全随机设计 ,每种处理 24个培养 ,
所有试验重复 3 次。每支试管装 15mL 培养基及
1mg 愈伤组织进行胚发生实验 ,在立体显微镜下计
数每管生成的体细胞胚 。
生长于含有 4 μmol L 2 , 4-D的 MS 培养基上的
愈伤组织转接于不同浓度的 6-苄基腺膘呤(2 、4 、6 、
8μmol L)和 Kn(2 、4 、 6 、8 μmol L)的培养基上进行
体细胞胚的发生并计算体细胞胚的发生率和单位外
植体(例如 ,1g愈伤组织)产生的体细胞胚数。
为比较蔗糖和葡萄糖各自浓度对体细胞胚发生
的影响 ,约 1mg 愈伤组织分别移到含有 6 μmol L Kn
和 0 、 50 、100 、 200 、300 mmol L 的蔗糖及 6 μmol L
Kn 和 0 、50 、100 、 200 、300 mmol L 葡萄糖的培养基
上。
为比较不同浓度蔗糖与葡萄糖 、GA3 或 ABA 诱
导体细胞胚发生的影响 ,添加 0 、 50 、 100 、 200 和
300mmol L 蔗糖与 0 、50 、100 、200 、300mmol L葡萄
糖 +Kn(6μmol L)或 0 、50 、100 、200 、 300mmol L 蔗
糖 与0 、 2 、5 、10 、 20μmol L GA3 或 0 、50 、100 、200 、
300mmol L蔗糖与 0 、 0.5 、 1 、 2 、 5μmol L ABA 于诱
466 Chinese Journal of Biotechnology　生物工程学报　2006 , Vol.22 , No.3
导培养基 ,培养 45d后计体细胞胚的数目。
2　结果与讨论
2.1　最佳愈伤组织培养条件
含4μmol L 2 , 4-D的 MS 培养基对愈伤组织的
诱导效果最佳 ,高于或低于此浓度都会使效果降低
(数据未列出)。在正常光照培养 45d后 ,节间外植
体即长出生长良好的微黄色具有成胚功能的愈伤组
织。随后每 45 天更换 1次 MS 培养基(含 4μmol L
2 , 4-D)。
2.2　BAP 、Kn 、蔗糖 、葡萄糖等对印度娃儿藤体细胞
胚发生的影响
为了诱导胚的发生 ,将愈伤组织转移到含不同
浓度 BAP 或Kn的 MS培养基上。在以上两种培养
基上 ,胚胎生成率及单位外植体上体细胞胚的数目
都很低 ,但含 Kn 的MS 培养基效果优于 BAP ,其中
含6 μmol L Kn的 MS培养基效果最好(图 1 A , B)。
在含 6μmol L Kn的MS 培养基上 ,69%的外植体出
胚(图 2 A),平均 25胚 外植体(图 2 B)。外植体培
养15d后即可观察到胚的形成 ,微黄色的愈伤在胚
形成前即变绿。体细胞胚的分化是连续的 、非同步
的 ,而且形态学上未发生异常变化。为了进一步提
高胚胎生成效率 ,我们比较了不同浓度蔗糖 、葡萄糖
分别与6 μmol L Kn组合的效果 。结果表明 ,当培养
基中蔗糖浓度逐渐提高至 200mmol L 时 ,单位外植
体产生体细胞胚的数目逐渐增大 ,再提高蔗糖浓度
则数目逐渐减小 。当培养基中蔗糖浓度为 200
mmol L时 ,单位外植体产生胚 49.2个 ,产胚率达到
最大 ,为 71.2%(图 3)。蔗糖是诱导体细胞胚发生
的常用糖类 ,已报道其能在胡萝卜[ 13] 、茄属植物[ 14] 、
黑色鸢尾[ 18] 和西伯利亚人参[ 19] 等植物中起作用 。
不同浓度的葡萄糖单独或与蔗糖结合使用都能减少
胚的生成 。产胚百分率和单位外植体产生体细胞胚
的数目随葡萄糖浓度的增高而降低(从 50μmol L到
300μmol L)(图 4)。葡萄糖与蔗糖共同使用也会降
低反应特性频率(图 5 A 、5 B)。由此可见 ,葡萄糖
单独或与蔗糖一起使用都会抑制系统中体细胞胚的
形成。碳水化合物通常在较低浓度时起作用 ,因此
其主要生理作用可能是影响胚胎的形成过程 ,而非
提供能源[ 20] 。高浓度的糖类(大于或等于 300
mmol L)通常抑制体细胞胚的形成 ,其机制可能为糖
类通过改变渗透压来调节代谢[ 21] 。在许多系统中 ,
糖浓度不仅影响体细胞胚的形成 ,而且还关系到体
细胞胚的分化 、植株的生根以及器官的形成[ 22-24] 。
图 1　印度娃儿藤节间愈伤组织不同阶段体细胞胚的发生
Fig.1　Different stages of somatic embryogenesis
from internodal callus of T.indica
A:well developed friable embryogenic calli just before embryogenesis on
MS medium supplemented with 6μmol L Kn.Bar:5mm;B:somatic
embryos developing f rom the internodal calli on MS medium
supplemented with 6μmol L Kn.A stage slightly advanced than Fig.
1A.Bar:6mm;C:an early stage of the cotyledonary somatic embryo on
MS medium supplemented with 2μmol L ABA and 200mmol L sucrose.
Bar:1000μm ;D:a close up view of the different stages of somatic
embryo on MS medium supplemented with 2μmol L ABA and 200
mmol L sucrose.Bar:1000μm.
2.3　不同浓度的 GA3 和蔗糖对印度娃儿藤体细胞
胚形成的影响
本实验中 200mmol L 的蔗糖和 10μmol L 的 GA3
能够明显刺激体细胞胚的形成。在含 200 mmol L
蔗糖的培养基中加 10μmol L GA3 胚生成率为 98%,
单位外植体产胚 51个(图 6A 、B)。在不同蔗糖浓度
467T.Dennis Thomas 等:糖 、GA3及 ABA 对印度娃儿藤(Tylophora indica (Burm.f.)Merrill)体细胞胚发生的影响
　　　
图 2　不同浓度 BAP 和Kn 对印度娃儿藤胚发生期间胚诱导效率(A)和单位外植体产胚数量(B)的影响
Fig.2　The influence of different concentrations of BAP and Kn on the efficiency of embryo induction(A)
and the number of embryosper explant(B)during embryogenesis in T.indica
(Results expressed as means of three replicates±SD.Sucrose concentration 300 mmol L.Culture period 45d.
Cont rol:6μmol L Kn and 300 mmol L sucrose.)
图 3　添加在 6 μmol L Kn 的不同浓度的蔗糖对
印度娃儿藤胚胎发生期间胚诱导效率和单位外植体
产胚数的影响
Fig.3　The influence of different concentrations of sucrose
together with 6 μmol L Kn on number of somatic embryos per
explant and efficiency of embryo induction during embryogenesis
in T.indica
(Results expressed as means of three replicates ± SD.
Culture period 45 d.Control:6μmol L Kn
and 300 mmol L sucrose.)
图 4　在6μmol L ABA存在条件下不同浓度的葡萄糖
对印度娃儿藤胚胎发生期间胚诱导效率和单位外植体
产胚数量的影响。
Fig.4　The influence of different concentrations of
glucose together with 6μmol L Kn on number of embryos
per explant and the efficiency of embryo induction(%)during
embryogenesis in T.indica.
(Results expressed as means of three replicates ± SD.
Culture period 45 d.)
时 ,GA3 超过 10μmol L 和低于 10μmol L 都会导致体
细胞胚的数量略有减少。在早期印度娃儿藤的体细
胞胚的研究中 ,每克愈伤组织最多可以获得 29.5个
体细胞胚 ,本研究表明 ,更高的体细胞产率可以通过
调整GA3 和蔗糖的含量达到。类似结果在其他系
统也有报道[ 15, 25 ,26] 。然而 ,也有报道表明在体细胞
胚的生成中GA3 有负面效果 ,GA3 对不同植物有不
同的作用效果[ 27-29] 。
468 Chinese Journal of Biotechnology　生物工程学报　2006 , Vol.22 , No.3
图 5　不同浓度的蔗糖 、葡萄糖和 6μmol L Kn对印度娃儿藤胚胎发生期间胚诱导效率(A)
及单位外植体产胚数量(B)的影响。
Fig.5　The influence of different concentrations of glucose , sucrose and 6μmol L Kn on efficiency of embryo induction(A)
and the number of embryos per explant(B)during embryogenesis in T.indica(Results expressed as means of
three replicates(SD.Culture period 45 d.)
图 6　不同浓度的蔗糖和 GA3 对印度娃儿藤胚胎发生期间胚诱导效率(A)及单位外植体产胚数量(B)的影响
Fig.6　The influence of different concentrations of sucrose and GA3 on the efficiency of embryo induction(A)
and the number of embryos per explant(B)during embryogenesis in T.indica
(Results expressed as means of three replicates ± SD.
Culture period 45 d.Control:6μmol L Kn and 300mmol L sucrose.)
2.4　不同浓度的 ABA和蔗糖的组合在诱导体细胞
胚的形成中的影响
当应用2μmol L ABA和200mmol L蔗糖组合时 ,
体细胞胚的形成的反应特性最大(Fig.1 C , D)。在
含200 mmol L 蔗糖的培养基中加入 2μmol L ABA能
显著增加体细胞胚的量。该培养基上单位外植体平
均生成 44 个胚 ,产率为 95%(Fig.7A 、B)。ABA能
促进在 Picea abies[ 16] , Hevea brasilensis[ 30] 和 Cucumis
melo
[ 19] 中的体细胞胚形成 。ABA的存在可以明显减
少不必要的成熟体细胞胚的反复成胚 ,而且也不影
响胚萌发[ 31] 。在诱发橡树(Hevea brasilensis)的体细
胞胚的形成时需要低水平的内生 ABA[ 32] ,然而胡萝
卜(Daucus carota)中高浓度的 ABA也能够促进体细
胞胚的形成[ 33] 。经 ABA 处理后 , 人参(Panax
ginseng)75%的胚可以分化生根 ,而无ABA处理的胚
则不能分化生根[ 34] 。有人推论 ABA抑制多胚的分
裂和单胚的形成与进一步分化[ 35] 。ABA 在植物胚
形成中很多过程都起到重要的作用[ 36] ,包括能够抑
制萌芽提前发生[ 37] 、胚胎形态的形成和对干旱环境
的耐受性[ 38 , 39] 。
体细胞胚分化成为小植株后转移到塑料瓶 ,并
在温室中[室温(26 ±2)℃;相对湿度 90%]培养 3
个月 ,最终有 94%的植株存活下来(图 8)。所有存
活下来的植株移到大田中可以正常生长。
469T.Dennis Thomas 等:糖 、GA3及 ABA 对印度娃儿藤(Tylophora indica (Burm.f.)Merrill)体细胞胚发生的影响
图 7　不同浓度的蔗糖和 ABA 对印度娃儿藤胚胎发生期间胚诱导效率(A)及单位外植体产胚数(B)的影响
Fig.7　The influence of different concentrations of sucrose and ABA on the efficiency of embryo induction(A)
and the number of embryos per explant(B)during embryogenesis in T.indica
(Results expressed as means of three replicates(SD.Culture period 45 d.Control:6μmol L Kn and 300 mmol L sucrose.)
图 8　印度娃儿藤体细胞胚分化出植株 ,分化小苗种在塑料杯中 3个月后移栽至大田
Fig.8　Somatic embryo derived T.indica plants growing in plastic cups three months after transfer to field(Bar:0.5cm)
3　小结
本实验表明了糖类 、ABA和GA3 对体细胞胚形
成的重要性 ,印度娃儿藤 、特定浓度的 GA3 和 ABA
能够促进体细胞胚的形成 。在所应用的两个糖中 ,
高浓度的蔗糖能够促进体细胞胚的形成 ,然而葡萄
糖对其有抑制作用。类似的是 ,10μmol L GA3与 200
mmol L蔗糖和 2μmol L ABA 与 200mmol L 蔗糖能够
促进体细胞胚的形成 。本研究为获得印度娃儿藤体
细胞胚提供了一个有效的实验技术 。
致　谢　感谢印度科技部青年科学项目(No.SR
FTP LSA-06 2002)对本研究的支持 ,同时感谢印度
Pala学院St.Thomas主任为本研究提供了必要的实
验条件。
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