全 文 ：第３９卷　第１２期 西 南 师 范 大 学 学 报 （自然科学版） ２０１４年１２月
Ｖｏｌ．３９　 Ｎｏ．１２　　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ　Ｃｈｉｎａ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｄｅｃ．２０１４
ＤＯＩ：１０．１３７１８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｘｓｘｂ．２０１４．１２．０１２
蕹菜过氧化物酶固定化条件分析
及固定化对其理化性质影响
①
王红扬１，２，３，　孙才云１，２，３，　黄　忙１，２，３，　唐云明１，２，３
１．西南大学 生命科学学院，重庆４００７１５；２．重庆市甘薯工程研究中心，重庆４００７１５；
３．三峡库区生态环境教育部重点实验室，重庆４００７１５
摘要：利用０．２％聚乙烯醇－海藻酸钠（ＰＶＡ－ＣＡ）作载体，饱和硼酸作交联剂，ＣａＣｌ２ 作固定剂固定蕹菜ＰＯＤ，通过
单因素试验探究了各个因素对固定化的影响；再通过正交实验分析，发现在饱和硼酸－６％ＣａＣｌ２，固定化时间为４５
ｍｉｎ，载体与酶液比例为１∶２和０．２％ＰＶＡ－３％ＣＡ条件下固定化蕹菜叶ＰＯＤ最佳．固定化酶的最适温度、温度稳
定性均升高，并且重复使用７次后酶活力还剩余５０％以上．
关　键　词：固定化；蕹菜；过氧化物酶；理化性质
中图分类号：Ｑ５５　　　　　文献标志码：Ａ　　　　　文章编号：１０００－５４７１（２０１４）１２－００５８－０７
过氧化物酶（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＰＯＤ）是一类在生物体内普遍存在的、由单一肽链和铁卟啉组成的血红蛋白
类氧化酶，催化由 Ｈ２Ｏ２ 参与的氧化反应，例如参与胺类和酚类化合物的氧化反应．ＰＯＤ在生物体内发挥
多种重要功能，例如参与分解吲哚乙酸［１］、合成木质素［２］和植物体内防御反应［３］．当今，该酶不仅广泛用
于免疫印迹［４］、酶联反应［５］和电镜技术［６］等生物学研究，而且在污水处理［７］、生物传感器［８］等领域发挥重
要作用．
酶在催化过程中表现出来的高效性、专一性以及反应条件温和，使其得到越来越多的关注．但是另一
方面，酶的不稳定性，尤其是一次性使用也限制了其催化领域的进一步发展．固定化酶是指将酶与特定载
体相结合，从而将酶固定在载体上的过程．固定化的酶不但非常容易与底物以及产物分开，而且提高了酶
的稳定性，可以反复使用．目前虽然已有辣根［９］、大豆皮［１０］、莲藕［１１］、甘薯叶［１２］、菊芋［１３］过氧化物酶固定
化的相关报道，但是，本实验原材料蕹菜，又称空心菜 （Ｉｐｏｍｏｅａ　ａｑｕａｔｉｃａ　Ｆｏｒｓｋ），不但在我国华南、华中、
华东和西南各地普遍栽种，而且相对于其他植物，可持续收割，价格低廉，每公顷产高达７５　０００ｋｇ，是生
产廉价ＰＯＤ并进行固定化的理想材料．因此对于蕹菜来源的过氧化物酶的固定化进行研究具有很大意义，
本实验以分离纯化得到的蕹菜ＰＯＤ为材料，利用包埋法对其进行固定化，采用单因素和正交试验法分析
影响固定化的条件，并且对固定化前后的理化性质进行对比分析．
１　材料和方法
１．１　实验材料
以本实验室分离纯化得到的电泳纯的蕹菜ＰＯＤ作为实验材料．
① 收稿日期：２０１４－０５－２０
基金项目：重庆市科委重点攻关项目（ＣＳＴＣ，２０１１ＡＢ１０２７）．
作者简介：王红扬 （１９８７－），男，河南南阳人，硕士研究生，主要从事蛋白质与酶工程的研究．
通信作者：唐云明，教授．
１．２　主要试剂与仪器
聚乙烯醇（ＰＶＡ），海藻酸钠（ＣＡ），上海化学试剂公司；ＣａＣｌ２，加拿大ＢＩＯ　ＢＡＳＩＣ公司，其余试剂均
为国产分析纯．
ＵＶ－２５５０紫外可见分光光度计，日本岛津公司；精密电子天平，Ｍｅｔｔｌｅｒ－Ｔｏｌｅｄｏ　Ｇｒｏｕｐ；Ｍｉｌ－Ｑ　ｐｌｕｓ超
纯水仪，Ｍｉｌｉｐｏｒｅ；ＳｅｖｅｎＥａｓｙ精密ｐＨ计，Ｍｅｔｔｌｅｒ－Ｔｏｌｅｄｏ．
１．３　实验方法
１．３．１　固定化过氧化物酶的制备
本实验运用了聚乙烯醇（ＰＶＡ）－海藻酸钠（ＣＡ）为载体，包埋法固定蕹菜ＰＯＤ．海藻酸钠（ＣＡ）反应条
件温和，能够与二价阳离子Ｃａ２＋，Ｂａ２＋等结合后可形成凝胶，但是机械强度低，而聚乙烯醇（ＰＶＡ）机械强
度大，因此将两种材料混合使用，以取得理想的包埋效果．
在加热条件下，０．２ｇ聚乙烯醇（ＰＶＡ）溶于１００ｍＬ超纯水中，待溶液澄清后，加入一定量的海藻酸
钠，制得０．２％ＰＶＡ－ＣＡ溶液，作为固定化酶的载体；冷却后加入酶液并混合均匀，用注射器滴入氯化钙
溶液中，４℃固定．待酶固定后，滤出并清洗３次，４℃下进行保存．
１．３．２　不同因素对固定化效果的影响
１．３．２．１　海藻酸钠浓度对固定化的影响
配制海藻酸钠浓度梯度为１～５％的０．２％ＰＶＡ－ＣＡ溶液，再加入等体积酶液，摇匀后加入３％ＣａＣｌ２－
饱和硼酸，４℃静置３０ｍｉｎ后测定相对酶活力．
１．３．２．２　ＣａＣｌ２ 浓度对固定化的影响
配制浓度分别为２％～１０％的ＣａＣｌ２－饱和硼酸，载体与酶液体积比为２∶１，二者混合，４℃静置３０ｍｉｎ
后测定相对酶活力．
１．３．２．３　加酶量对固定化的影响
将载体与酶液按照体积比１∶１，１∶１．５，１∶２，１∶２．５，１∶３混合，与饱和硼酸－３％ＣａＣｌ２ 溶液混合，
４℃静置３０ｍｉｎ后测定相对酶活力．
１．３．２．４　固定化时间对固定化效果的影响
将载体与酶液按体积比２∶１混匀，与３％ＣａＣｌ２－饱和硼酸混合，４℃分别静置１５，３０，４５，６０ｍｉｎ后测
定相对酶活力．
１．３．３　固定化酶条件的多因素优化———正交优化实验
１．３．３．１　因素以及水平的确定
　　通过单因素实验，我们得到影响酶固
定化的４个因素，即：海藻酸钠浓度Ａ，
加酶量Ｂ，饱和硼酸－ＣａＣｌ２ 浓度Ｃ和固定
化时间Ｄ．为研究这４个因素共同作用时
对蕹菜过氧化物酶固定化的影响，我们确
定了３个水平（见表１），进行正交实验．
表１　正交实验设计因素及水平
因　　素 水　　平
ＣＡ浓度Ａ／％ １，２，３
加酶量Ｂ １∶１，１∶２，１∶３
饱和硼酸－ＣａＣｌ２ 浓度Ｃ／％ ６，８，１０
固定化时间Ｄ／ｍｉｎ　 １５，３０，４５
１．３．３．２　正交优化设计
利用正交设计助手，考虑上述Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ４个因素，每个因素３个水平，按正交设计表Ｌ９（３４）进行实验
设计，方案如表２所示．
１．３．４　固定化酶部分性质的测定
１．３．４．１　最适温度测定
分别测定固定化酶在２０℃～８０℃条件下的催化活性．
１．３．４．２　温度稳定性的测定
将酶分别在２０℃～７０℃条件下保存７５ｍｉｎ，每１５ｍｉｎ测定１次酶活．
９５第１２期　　　　 王红扬，等：蕹菜过氧化物酶固定化条件分析及固定化对其理化性质影响
表２　正交实验设计计划表
所在列 １　 ２　 ３　 ４
因素 Ａ　 Ｂ　 Ｃ　 Ｄ
实验１　 ２％ １∶１　 ６％ １５
实验２　 ２％ １∶２　 ８％ ３０
实验３　 ２％ １∶３　 １０％ ４５
实验４　 ３％ １∶１　 ８％ ４５
实验５　 ３％ １∶２　 １０％ １５
实验６　 ３％ １∶３　 ６％ ３０
实验７　 ４％ １∶１　 １０％ ３０
实验８　 ４％ １∶２　 ６％ ４５
实验９　 ４％ １∶３　 ８％ １５
１．３．４．３　最适ｐＨ值的测定
分别测定ｐＨ值在３～８条件下的催化活性．
１．３．４．４　ｐＨ稳定性的测定
将酶分别ｐＨ值在３～８条件下保存１ｈ，每１５ｍｉｎ测定１次酶活．
１．３．４．５　固定化酶的重复使用稳定性
测定酶活后用双蒸水冲洗干净，连续测定，重复１０次．
２　结果与分析
２．１　固定化酶条件的单因素优化结果
２．１．１　海藻酸钠浓度对固定化酶活性的影响
如图１所示，０．２％ＰＶＡ－３％ＣＡ固定化后的酶活力最高，并且硬度大，有一定弹性，不易碎．
２．１．２　载体与酶的比例对固定化酶活性的影响
如图２所示，随比例的增加，酶活力逐渐升高；但是当比例大于１∶２之后，酶活力逐渐降低，因此载
体与酶最合适的比例是１∶２．
图１　海藻酸钠浓度
对固定化ＰＯＤ活性的影响
图２　载体与酶液比例
对固定化ＰＯＤ活性的影响
２．１．３　ＣａＣｌ２ 浓度对固定化酶活性的影响
如图３所示，在ＣａＣｌ２ 浓度为２％～８％浓度范围内，酶活力逐渐增加；当ＣａＣｌ２ 浓度大于８％时，酶活
逐渐减小．因此最适合的ＣａＣｌ２ 浓度是８％．
２．１．４　时间对固定化酶活性的影响
如图４所示，当固定化时间为３０ｍｉｎ时，固定化酶活性最高；之后随着时间延长，酶活逐渐降低．
０６ 西南师范大学学报（自然科学版）　　　　　ｈｔｔｐ：／／ｘｂｂｊｂ．ｓｗｕ．ｃｎ　　　　第３９卷
图３　ＣａＣｌ２ 浓度对固定化蕹菜叶
ＰＯＤ活性的影响
图４　固定化时间对固定化蕹菜叶
ＰＯＤ活性的影响
２．２　固定化酶条件的多因素优化———正交优化实验结果
正交实验以及直观分析结果如表３所示．
表３　正交实验设计及结果计算表
试验号 Ａ　 Ｂ　 Ｃ　 Ｄ 酶活回收率／％
实验１　 ２％ １∶１　 ６％ １５　 ５０．４
实验２　 ２％ １∶２　 ８％ ３０　 ４５．９
实验３　 ２％ １∶３　 １０％ ４５　 ５２．２
实验４　 ３％ １∶１　 ８％ ４５　 ４８．６
实验５　 ３％ １∶２　 １０％ １５　 ５１．９
实验６　 ３％ １∶３　 ６％ ３０　 ５４．７
实验７　 ４％ １∶１　 １０％ ３０　 ４２．３
实验８　 ４％ １∶２　 ６％ ４５　 ５６．７
实验９　 ４％ １∶３　 ８％ １５　 ４４．２
Ｋ１　 ４９．５００　 ４７．１００　 ５３．９３３　 ４８．８３３
Ｋ２　 ５１．７３３　 ５１．５００　 ４６．２３３　 ４７．６３３
Ｋ３　 ４７．７３３　 ５０．３６７　 ４８．８００　 ５２．５００
极差 ４．０００　 ４．４００　 ７．７００　 ４．８６７
　　根据表３数据可知，４个因素对固定化酶的酶活力回收率的影响从大到小依次为Ｃ，Ｄ，Ｂ，Ａ．因此蕹菜
ＰＯＤ固定化最佳组合为Ｃ１Ｄ３Ｂ２Ａ２，即在饱和硼酸－６％ＣａＣｌ２，固定化时间为４５ｍｉｎ，载体与酶液比例为
１∶２和０．２％ＰＶＡ－３％ＣＡ条件下固定蕹菜ＰＯＤ最佳．
２．３　固定化酶性质鉴定
２．３．１　固定化蕹菜ＰＯＤ的最适温度
如图５所示，固定化后，酶的最适温度由固定前的４０℃上升为６０℃，说明固定化酶具有更高的稳定
性，可以在更高的温度下催化反应．
图５　蕹菜过氧化物酶固定后最适温度变化
１６第１２期　　　　 王红扬，等：蕹菜过氧化物酶固定化条件分析及固定化对其理化性质影响
２．３．２　固定化蕹菜叶ＰＯＤ的温度稳定性变化
如图６所示：固定化酶的活性在２０℃～６０℃范围内较稳定，与固定化前相比，在６０℃时仍然能够保
持较高的酶活，说明蕹菜ＰＯＤ固定化后稳定性增加．
图６　蕹菜过氧化物酶固定化后热稳定性变化
２．３．３　固定化蕹菜叶ＰＯＤ的最适ｐＨ值变化
如图７所示，和固定化前相比，固定化后的蕹菜叶ＰＯＤ最适ｐＨ仍然为ｐＨ６．
图７　蕹菜过氧化物酶固定化后最适ｐＨ变化
２．３．４　固定化蕹菜叶ＰＯＤ的ｐＨ值稳定性变化
如图８所示，固定化后的蕹菜ＰＯＤ在ｐＨ值为５～８范围内具有较高活性，与固定前大致相同．
图８　蕹菜过氧化物酶固定化后ｐＨ稳定性变化
２．３．５　固定化蕹菜叶ＰＯＤ的重复使用稳定性
如图９所示，使用第４次时酶活力最大，达到９６％，可能是由于浸泡后，凝胶通透性提高，增加了酶
与底物的接触面积．重复使用７次后，酶活力仍然大于５０％，表明该固定化的酶具有良好的重复使用性．
２６ 西南师范大学学报（自然科学版）　　　　　ｈｔｔｐ：／／ｘｂｂｊｂ．ｓｗｕ．ｃｎ　　　　第３９卷
图９　固定化酶的重复使用稳定性
３　讨　　论
酶的固定化常见的方法有吸附法、包埋法、结合法、
交联法等，研究者使用不同方法采用不同载体对酶固定
化进行了深入的研究．董学卫等［１４］使用交联法以聚乙二
醇改性壳聚糖为载体，对影响纤维素酶固定化的因素进
行了探讨．于海用共价结合法将辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）
固定在坚硬耐磨的石英砂上，研究固定化的最佳反应条
件．王苗苗［１５］以新颖的介孔二氧化硅磁性复合材料为载
体，研究了固定漆酶的条件．曾嘉等［１６］以壳聚糖微球为
载体，分析了固定化的葡萄糖氧化酶的性质．锁爱莉
等［１７］分析以疏水－亲水型硅胶作为载体固定化葡萄糖氧化酶的性能，以期制备测定葡萄糖浓度的生物传
感器．
单因素条件分析，得到在０．２％ＰＶＡ－３％ＣＡ，载体与酶比例１∶２，ＣａＣｌ２ 浓度是８％和固定化时间３０
ｍｉｎ时可以获得最佳固定效果．正交试验结果显示，各条件影响力的大小依序为ＣａＣｌ２ 浓度，固定化时间，
载体与酶比例，海藻酸钠浓度，因此最佳反应条件是饱和硼酸－６％ＣａＣｌ２，固定化时间为４５ｍｉｎ，载体与酶
液比例为１∶２和０．２％ＰＶＡ－３％ＣＡ，与甘薯叶固定化的最佳条件不同．ＣａＣｌ２ 的影响最大可能是因为，钙
离子与海藻酸钠结合生成海藻酸钙凝胶，影响凝胶的疏密程度，从而进一步影响了酶与底物的接触面积．
蕹菜ＰＯＤ经固定化后，最适温度由４０℃上升为６０℃，高于固定化的莲藕过氧化物酶的最适温度５０℃，
表明固定化增加了酶的温度作用范围．固定化酶的活性在２０℃～６０℃范围内较稳定，略高于木素过氧化
物酶［１８］稳定性．与固定化前相比，在６０℃时仍然能够保持较高的酶活，说明蕹菜ＰＯＤ固定化后稳定性增
加．而固定化前后最适ｐＨ及其ｐＨ稳定性没有明显变化，而大豆皮过氧化物酶经氧化铝海藻酸钠固定化
后最适ｐＨ由５升高为６．此外，重复使用７次后，固定化酶的相对活力仍然大于５０％，与固定化的菊芋叶
片ＰＯＤ的重复使用稳定性相似，说明蕹菜固定化的ＰＯＤ重复使用性良好，增加了该酶的使用效率．
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Ｏｎ　Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
ｏｆ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｉｐｏｍｏｅａ　Ａｑｕａｔｉｃａ　Ｆｏｒｓｋ
ＷＡＮＧ　Ｈｏｎｇ－ｙａｎｇ１，２，３，　ＳＵＮ　Ｃａｉ－ｙｕｎ１，２，３，
ＨＵＡＮＧ　Ｍａｎｇ１，２，３，　ＴＡＮＧ　Ｙｕｎ－ｍｉｎｇ１，２，３
１．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　４００７１５，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　Ｓｗｅｅｔ　Ｐｏｔａｔｏ　Ｅｎｇｉｎｎｅｅｒｉｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　４００７１５ ，Ｃｈｉｎａ；
３．Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｅｃｏ－ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｔｈｒｅｅ　Ｇｏｒｇｅｓ　Ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ　Ｒｅｇｉｏｎ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　４００７１５，Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ－ｐｕｒｉｔｙ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＰＯＤ）ｆｒｏｍ　Ｉｐｏｍｏｅａ　ａｑｕａｔｉｃａ　Ｆｏｒｓｋｈａｓ　ｂｅｅｎｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｗｉｔｈ
０．２％ＰＶＡ－ＣＡ　ａｓ　ｃａｒｒｉｅｒ，ｓａｔｕｒａｔｅｄ　ｂｏｒｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ａｓ　ｃｒｏｓｓ　ｌｉｎｋｅｒ　ａｎｄ　ＣａＣｌ２ａｓ　ｆｉｘｉｎｇ　ａｇｅｎｔ．Ｔｈｅｉｒ
ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ＰＯＤ　ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎａｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｍｅａｎｓ　ｏｆ　ｓｉｎｇｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｃｏｍｂｉｎａ－
ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅｉｒ　ａｇｅｎｔｓ　ｖｉａ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ　ａｒｅ　０．２％ＰＶＡ－３％ＣＡ，ｔｈｅ　１∶２ｒａｔｉｏ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＰＶＡ－ＶＡ　ａｎｄ　ｅｎ－
ｚｙｍｅ，ｓａｔｕｒａｔｅｄ　ｂｏｒｉｃ　ａｃｉｄ－６％ＣａＣｌ２ａｎｄ　４５ｍｉｎ　ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ　ｔｉｍｅ．Ａｆｔｅｒ　ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｔｅｍ－
ｐｅｒａｔｕｒｅ，ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｉｎ　ｈｉｇｈ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｕｓｅ　ｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｅｎｈａｎｃｅｄ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｉｐｏｍｏｅａ　ａｑｕａｔｉｃａ　Ｆｏｒｓｋ；ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ；ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ
责任编辑　周仁惠　　　　
４６ 西南师范大学学报（自然科学版）　　　　　ｈｔｔｐ：／／ｘｂｂｊｂ．ｓｗｕ．ｃｎ　　　　第３９卷