全 文 ：166 2015, Vol.36, No.03 食品科学 ※生物工程
蕹菜过氧化物酶的分离纯化及理化性质
王红扬，王 洁，李 星，唐云明*
（西南大学生命科学学院，重庆市甘薯工程研究中心，三峡库区生态环境教育部重点实验室，重庆 400715）
摘 要：新鲜蕹菜经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析和Superdex-200凝胶过滤层析后获得电泳纯
的过氧化物酶（peroxidase，POD），该酶的比活力、回收率、纯化倍数和产率分别为35 972.96 U/mg、12.21%、
168.48和211.07 U/g。该酶的亚基分子质量为42.7 kD，最适温度为40 ℃，最适pH值为 6，并且在20～50 ℃及
pH 5～8的范围内具有良好的稳定性。以不同浓度的H2O2为底物，测得该酶的Km值为18.32 mmol/L。NaCl、尿素
（Urea）、Zn2+、Mg2+对该酶都具有较强的激活作用，十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、硫氰化钾
（potassium thiocyanate，KSCN）、抗坏血酸（ascorbic acid，AsA）、Ba2+、Mn2+ 、Fe2+、甲醇、乙醇、正丁醇和
异丙醇对蕹菜POD活力均有抑制作用，其中抗坏血酸对POD有极强的抑制作用，当浓度为0.01 mol/L时，酶活力接
近于0。
关键词：蕹菜；过氧化物酶；分离纯化；酶活力
Isolation, Purification and Characterization of Peroxidase from Ipomoea aquatica Forsk.
WANG Hongyang, WANG Jie, LI Xing, TANG Yunming*
(Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, Chongqing Sweet-potato Engineering
Research Center, School of Life Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)
Abstract : Electrophoresis-purity peroxidase (POD) was extracted and purified from Ipomoea aquatica Forsk. through
ammonium sulfate precipitation, DEAE-Sepharose and Superdex-200 chromatography. The specific activity of the purified
peroxidase was 35 972.96 U/mg and the yield was 211.07 U/g with a recovery rate of 12.21% and a purification fold of
168.48. Its molecular mass was around 42.7 kD as determined by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
(SDS-PAGE). Besides, the POD with the optimal temperature and pH of 40 ℃ and 6, respectively, was relatively stable
in the temperature range of 20–50 ℃ and pH range of 5–8. This enzyme showed a Km value of 18.32 mmol/L towards the
substrate hydrogen peroxide. In addition, the POD was found to be activated by NaCl, urea, Zn2+and Mg2+ but inhibited by
SDS, KSCN, ascorbic acid (AsA), Ba2+, Mn2+, Fe2+, methanol, ethanol, n-butyl alcohol and isopropanol, and completely
inactivated by 0.01 mmol/L AsA.
Key words: Ipomoea aquatica Forsk.; peroxidase; isolation and purification; enzyme activity
中图分类号：Q946.5 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2015）03-0166-05
doi:10.7506/spkx1002-6630-201503032
收稿日期：2014-03-02
基金项目：重庆市科委重点攻关项目（CSTC2011AB1027）
作者简介：王红扬（1987—），男，硕士研究生，主要从事蛋白质与酶工程研究。E-mail：wanghongyang123@hotmail.com
*通信作者：唐云明（1960—），男，教授，博士，主要从事蛋白质与酶工程研究。E-mail：tbright@swu.edu.cn
过氧化物酶（peroxidase，POD）是一类在生物体内
普遍存在的、由单一肽链和铁卟啉组成的血红蛋白类氧化
酶，它催化由H2O2参与的氧化反应，例如参与胺类和酚类
化合物的氧化反应。POD在生物体内发挥多种重要功能，
例如参与分解吲哚乙酸[1]、合成木质素[2]和植物体内防御
反应[3]。当今，该酶不仅被广泛用于免疫印迹[4]、酶联反
应[5]和电镜技术[6]等生物学研究，而且在污水处理[7]、生物
传感器[8]等领域发挥重要作用。
目前，该酶商品化生产的主要原料是辣根，但是辣
根生长条件严格，我国种植量少，主要靠进口，因此价
格昂贵。目前虽然已有从韭菜[9]、枇杷[10]、莲藕[11]、甘薯
叶[12]、荔枝果皮[13]、苦瓜[14]等植物中分离纯化该酶的相
关报道，但是从廉价来源的植物中筛选出富含POD的
样品，并希望在大规模工业生产中提高产量、降低成
本的研究迄今鲜有报道。蕹菜，又称空心菜（Ipomoea
aquatica Forsk.），不但在我国华南、华中、华东和西
南各地普遍栽种，而且相对于其他植物，例如韭菜、芒
果、洋葱、苦瓜等，可持续收割、价格低廉、亩产高达
※生物工程 食品科学 2015, Vol.36, No.03 167
5 000 kg，是生产廉价POD的理想材料。因此，本实验以
蕹菜为材料对POD进行分离纯化并且对其部分性质进行
研究，为POD的生产提供新的原料和方法，同时为其应
用于食品工业、环境保护及生物医学领域提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜蕹菜购于重庆市北碚区文星湾永辉超市。
DEAE-Sepharose、Superdex-200、分子排阻层析标
准样品、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium
dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-
PAGE）蛋白标准品 美国GE公司；Tris 香港Farco
公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺 美国Fluka公司；
其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备
AKTA prime plus蛋白质纯化系统 美国GE公司；
冷冻干燥仪 德国Uni Equip公司；Milli-Q plus超纯水仪
美国Millipore公司；垂直板电泳槽和电泳仪 美国Bio-Rad
公司；UV-2550型分光光度计 日本岛津公司；GL-21M
高速冷冻离心机 湖南湘仪公司；精密电子天平、
SevenEasy精密pH计 瑞士Mettler-Toledo公司。
1.3 方法
1.3.1 粗酶液的提取
取新鲜蕹菜，洗净晾干后称质量，按照1∶3（m/V）
的比例加入预冷的0.05 mol/L pH 7.5的磷酸盐缓冲液，匀
浆后于4 ℃静置抽提3 h。4 ℃、10 000 r/min离心两次，
每次30 min，收集上清液，得到粗酶液。
1.3.2 硫酸铵分级沉淀
在搅拌的同时向粗酶液中缓慢加入研磨后的干燥
硫酸铵到20%饱和度，4 ℃条件下盐析2 h，12 000 r/min
离心30 min收集上清液；再向所得上清液缓慢加入硫酸
铵至60%饱和度，4 ℃条件下盐析2 h，12 000 r/min离心
30 min后向沉淀中加入提取缓冲液使沉淀充分溶解；4 ℃
透析除盐过夜，即可得到初步纯化的POD酶液。
1.3.3 DEAE-Sepharose层析
经0.05 mol/L磷酸盐缓冲液平衡柱子后，取10 mL粗
酶液上柱，用0～1 mol/L NaCl（pH7.5的磷酸盐缓冲液配
制）进行线性梯度洗脱，流速设定为0.5 mL/min，每管收
集4 mL；测定各管蛋白质含量及其酶活性，收集活性相
对较高的酶液，经透析脱盐后，冷冻干燥保存。
1.3.4 Superdex-200层析
1.3.3节所得的冻干酶用提取缓冲液溶解，取5 mL上
样于Superdex-200层析柱，用提取缓冲液洗脱，流速为
0.5 mL/min，每管收集4 mL，测定各管蛋白质含量及其
酶活性，收集活性相对较高的酶液，透析脱盐后，冷冻
干燥后于－20 ℃条件下保存。
1.3.5 POD活力的测定
参考Chen等 [15]的方法。反应体系为3 mL，包括
2.775 mL 50 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）、0.1 mL 1%
H2O2、0.1 mL 4%愈创木酚和0.025 mL酶液。操作过程如
下：在加入底物和缓冲液后，再加入0.025 mL酶液并混
匀，在25 ℃条件下记录2 min内每分钟光密度（OD470 nm）
值的变化值。以测定条件下每分钟光密度值变化0.01所需
要的酶量为一个酶活力单位（U）。
1.3.6 蕹菜POD纯度鉴定与分子质量测定[16]207-223
采用SDS-PAGE进行纯度鉴定，其中分离胶为12%，
浓缩胶为5%，加样量为20 μL。经SDS-PAGE和凝胶过滤
层析分别测定该酶亚基分子质量与全分子质量。
1.3.7 蛋白质浓度的测定
分别用紫外分光光度法与Bradford法[16]171-176测定。
1.3.8 蕹菜POD性质的研究
1.3.8.1 最适温度和热稳定性的测定
分别在不同温度（20～80 ℃，相差5 ℃）下测定
酶活力，确定最适温度，在此条件下酶活力为100%；
将酶液放置于不同温度（20～70 ℃，相差10 ℃）下保
存，每隔1 h测定相对酶活力（以25 ℃条件下的酶活力
为100%）。
1.3.8.2 最适pH值和pH值稳定性的测定
在pH 3～8条件下测定酶的活力，以确定最适pH值
（酶活力为100%）；将酶液放置于pH 3～8条件下保
存，每隔1 h测定酶活力（以pH 7.0时测得的酶活力作为
100%）。
1.3.8.3 米氏常数（Km）的测定
以不同浓度的H2O2（10～50 mmol/L）为底物，在酶
活力测定条件下（25 ℃、pH 7.0），测得蕹菜POD的酶
活力。采用双倒数作图（Lineweaver-Burk）法[17]233-234求
得该酶的Km值。
1.3.8.4 有机溶剂对POD活性的影响
分别将甲醇、乙醇、正丁醇、异丙醇4 种有机溶
剂与缓冲液混合，混合后体积分数分别为10%、20%、
30%、40%、50%、60%，之后再与酶液混合，25 ℃条件
下作用30 min，加入底物后，测定酶活力（以不加有机
溶剂的酶活力为100%）。
1.3.8.5 部分化合物对POD活性的影响
分用将NaCl、抗坏血酸（ascorbic acid，AsA）、
SDS、硫氰化钾（potassium thiocyanate，KSCN）、尿
素（Urea）5 种化合物配制成100 mmol/L母液，再按相
应比例分别与缓冲液及酶液混合（终浓度分别达到为
10、20、30、40、50 mmol/L），置于25 ℃条件下作用
30 min，之后再加底物测定POD活力（以不加化合物时
的酶活力为100%）。
168 2015, Vol.36, No.03 食品科学 ※生物工程
1.3.8.6 部分金属离子对POD活性的影响
在酶活力测定体系中加入一定的0.1 mol/L金属离
子，得到不同终浓度的金属离子（0.01～0.05 mol/L）
体系，随后加入0.025 mL酶液，置于25 ℃条件下作用
30 min，加入底物，测定酶活力（以不加金属离子的酶
活力为100%）。
2 结果与分析
2.1 蕹菜POD的分离纯化结果
1 61 65 6913 17 41 49 53 575 9 21 29 33 3725 45
1.2
1.8
2.0
1.6
1.4
1.0
0.6
0.4
0.0
0.2
0.8
0.6
0.9
1.0
0.8
0.7
0.5
0.3
0.2
0.0
0.1
0.4
5 000
20 000
25 000
15 000
10 000
0
㇑ᮠ
O
D
28
0
nm
OD280 nm
䞦⍫࣋ PO
D
䞦
⍫
࣋
/U
N
aC
l⎃
ᓖ
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m
ol/L˅
图 1 蕹菜POD的DEAE-Sepharose层析图
Fig.1 DEAE-Sepharose chromatography of POD from Ipomoea
aquatica Forsk.
1 61 65 6913 17 41 49 53 575 9 21 29 33 3725 45
0.2
0.5
0.6
0.4
0.3
0.1
0.0
2 000
8 000
10 000
6 000
4 000
1 000
7 000
9 000
5 000
3 000
0
㇑ᮠ
O
D
28
0
nm
OD280 nm
䞦⍫࣋ PO
D
䞦
⍫
࣋
/U
图 2 蕹菜POD的Superdex-200层析图
Fig.2 Superdex-200 chromatography of POD from Ipomoea
aquatica Forsk.
表 1 蕹菜POD的分离纯化效果
Table 1 Isolation and purification of POD from Ipomoea aquatica Forsk.
纯化步骤 总蛋白含量/mg 总活力/U 比活力/（U/mg） 回收率/% 纯化倍数
粗酶液 4 040.56 862 700.00 213.51 100.00 1.00
硫酸铵分级沉淀 1 128.23 558 857.00 495.25 64.78 2.32
DEAE-Sepharose 30.37 237 760.12 7 828.09 27.56 36.66
Superdex-200 2.93 105 335.67 35 972.96 12.21 168.48
蕹菜POD粗酶液经DEAE-Sepharose层析后，结果
如图1所示，蛋白质含量最高的是第11管，而酶活力最
高的是第18管，通过该步骤有效地去除了杂蛋白，纯
化了目的蛋白。经DEAE-Sepharose层析所得样品通过
Superdex-200分子排阻层析，结果如图2所示，蛋白质含
量较高的是第22和第47管，而酶活力最高的是第34管，
目的蛋白与杂蛋白得到有效分离。经SDS-PAGE为单一
条带（图3），说明该酶达到了电泳纯。该酶的分离纯
化结果见表1，蕹菜POD的纯化倍数为168.48，回收率为
12.21%，比活力为35 972.96 U/mg，产率为211.07 U/g。
2.2 蕹菜POD分子质量测定结果
SDS-PAGE测得该酶的亚基分子质量为42.7 kD（图3），
经Superdex-200凝胶过滤层析测得该酶的全分子质量约为
43 kD，由此可以判定蕹菜POD由单一亚基构成。
S M
1
2
3
4
5
6
M. 分子质量标准品；1. 兔磷酸化酶B 97.0 kD；2. 牛血清蛋白66.0 kD；
3. 鸡卵清蛋白45.0 kD；4. 牛碳酸酐酶30.0 kD；5. 胰蛋白酶抑制
剂20.1 kD；6. α-牛乳清蛋白14.4 kD；S. 蕹菜过氧化物酶42.7 kD。
图 3 蕹菜POD的SDS-PAGE图
Fig.3 SDS-PAGE of purified POD from Ipomoea aquatica Forsk.
2.3 蕹菜POD的理化性质
2.3.1 最适温度和热稳定性
20 803025 35 40 50 60 65 755545 70
100
80
60
120
20
0
40
⏽ᑺ/ć
Ⳍ
ᇍ
䝊
⌏
࡯
/%
图 4 温度对蕹菜POD活力的影响
Fig.4 Effect of temperature on the activity of POD from Ipomoea
aquatica Forsk.
0 51 32 4
100
80
60
120
140
20
0
40
ᯊ䯈/h
Ⳍ
ᇍ
䝊
⌏
࡯
/%
20 ć
30 ć
40 ć
60 ć
70 ć
50 ć
图 5 蕹菜POD的热稳定性
Fig.5 Effect of temperature on the stability of POD from Ipomoea
aquatica Forsk.
由图4可知，蕹菜POD的最适反应温度为40 ℃。
由图5可知，蕹菜POD在20～50 ℃之间具有很好的热
稳定性，其中在50 ℃条件下保温5 h后相对酶活力仍可
※生物工程 食品科学 2015, Vol.36, No.03 169
达到82%；但是在温度高于60 ℃后，热稳定性迅速降
低，相对酶活力丧失高达60%以上，之后维持在低酶
活性状态。
2.3.2 最适pH值和pH值稳定性
3 1154 6 7 9 108
100
80
60
120
20
0
40
pH
Ⳍ
ᇍ
䝊
⌏
࡯
/%
图 6 pH值对蕹菜POD活力的影响
Fig. 6 Effect of pH on the activity of POD from Ipomoea aquatica Forsk.
0 51 32 4
80
60
100
120
20
0
40
ᰦ䰤/h
⴨
ሩ
䞦
⍫
࣋
/%
pH 5
pH 3
pH 4 pH 7
pH 8
pH 6
图 7 蕹菜POD的pH值稳定性
Fig.7 pH Stability of POD from Ipomoea aquatica Forsk.
实验结果表明，蕹菜POD的最适pH值为6（图6），
在pH 5～7范围内均能保持90%以上活性；蕹菜POD在
pH 5～8范围内稳定性良好，保持5 h后相对酶活力还接近
90%。但是，当pH值低于4以后，保持1 h，相对酶活力
即降低至50%以下，并且随着时间延长，酶活力持续缓
慢降低（图7）。
2.3.3 蕹菜POD米氏常数（Km）的测定结果
在POD活性测定系统中，用蕹菜POD催化不同浓度
（0.02～0.1 mol/L）的过氧化氢与愈创木酚的反应，测定
蕹菜POD活力。以双倒数作图法求得蕹菜POD的Km值为
18.32 mmol/L（图8），其中v表示酶促反应速率。
－60 －40 －20 400 20
y˙0.104 6xˇ5.708
R2˙0.986 9
60
4
10
12
8
6
2
0
1/v
/ ˄
˄
mi
n g
L ˅
/m
mo
l ˅
1/[S]/˄L/mmol˅
图 8 双倒数法测定蕹菜POD的米氏常数
Fig.8 Determination of Km of POD from Ipomoea aquatica Forsk. by
Lineweaver-Burk plot
2.3.4 有机溶剂对蕹菜POD活性的影响
0.00 0.060.01 0.03 0.040.02 0.05
80
60
100
120
20
0
40
⎃ᓖ/˄mol/L˅
⴨
ሩ
䞦
⍫
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⭢䞷
图 9 甲醇、乙醇、正丁醇、异丙醇对蕹菜POD活力的影响
Fig.9 Effects of methanol, ethanol, isopropyl alcohol and n-butyl
alcohol on the activity of POD from Ipomoea aquatica Forsk.
由图9可知，甲醇、乙醇、正丁醇和异丙醇这4 种有
机溶剂对蕹菜POD活力均有抑制作用，并且随着有机溶
剂浓度的增大，抑制作用不断增强。其中正丁醇和异丙
醇抑制作用较为显著，乙醇和甲醇抑制作用相对较弱。
2.3.5 不同化合物对蕹菜POD活性的影响
0.00 0.050.01 0.030.02 0.04
80
60
100
120
20
0
40
⌧ᑺ/˄mol/L˅
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࡯
/%
Urea
SDS
KSCN
AsA
NaCl
图 10 不同化合物对蕹菜POD活力的影响
Fig.10 Effects of various compounds on the activity of POD from
Ipomoea aquatica Forsk.
由图10可知，NaCl、Urea对POD有非常轻微的
激活作用，最大激活相对酶活力到106%；SDS、
KSCN对POD均有较强的抑制作用，其中当SDS浓度为
0.05 mol/L时，相对酶活力不到46%；AsA对POD则有
极强的抑制作用，其中当浓度仅为0.01 mol/L时，酶活
力就被完全抑制。
2.3.6 不同金属离子对蕹菜POD活性的影响
0 5010 3020 40
150
200
250
50
0
100
⎃ᓖ/˄mol/L˅
⴨
ሩ
䞦
⍫
࣋
/%
Kˇ
Mn2ˇ
Fe2ˇMg2ˇ
Zn2ˇ
Ca2ˇ
Ba2ˇ
图 11 不同金属离子对蕹菜POD活力的影响
Fig.11 Effects of metal ions on the activity of POD from Ipomoea
aquatica Forsk.
170 2015, Vol.36, No.03 食品科学 ※生物工程
由图11可知，Zn2+、Mg2+对蕹菜叶POD明显的激活作
用，并且随着浓度的增加，激活作用明显增强，其中Zn2+
最大可以使其达到初始酶活力的211%；Ba2+对蕹菜POD
有轻微的抑制作用；Mn2+、Fe2+对蕹菜POD则具有明显
的抑制作用，尤为明显的是Fe2+在0.01 mol/L时，相对酶
活力只剩下23%，0.02 mol/L时POD几乎完全抑制；K+、
Ca2+对蕹菜POD作用不明显。
3 讨 论
与从其他植物中分离纯化的POD相比较，本实验研究的
蕹菜POD具有以下特点：首先，在我国华南、华中、华东和
西南各地普遍栽种，分布范围广分布范围广、产量高，能能
为大规模工业化生产提供充足原料；其次，材料酶含量高，
分离纯化步骤简单，比活力、纯化倍数和单位产量均相对较
高，分别达到35 972.96 U/mg、168.48和211.07 U/g。
蕹菜POD最适温度为40℃，与女贞果实[18]、莲藕[11]、
荔枝果皮 [13]的POD最适温度接近，低于甘薯叶POD的
60 ℃[12]和棕榈叶的55 ℃[19]。在20～40 ℃均有很高的稳
定性，但是当温度过高时，活性中心遭到破坏，从而酶
与底物结合效率下降，酶活性降低。该酶的最适pH值
为6，与辣根[20]相同，在pH 5～8范围内稳定性较好，保
温5 h其相对酶活力均保持在90%以上，耐受范围广泛，
在低pH值条件下，POD失去活性中心必需的亚铁原卟
啉，从而活性降低。大多数植物的过氧化物酶分子质量
在30～70 kD范围内，该酶的亚基分子质量为42.7 kD，
与莲藕的41.5 kD[11]、红薯的42 kD[21]、苦瓜的43 kD [22]
来源的POD相近，低于木瓜的69.4 kD[23]，高于枇杷果
肉的22.6 kD[10]，具有一定的物种差异性。同时采用愈
创木酚为底物，该酶的Km值为18.32 mmol/L，低于豆壳
的0.41 mmol/L[24]、红甜菜的98.61 mmol/L[25]和甘薯叶的
291 mmol/L[12]，具有较高的底物亲和力。
常见的有机溶剂、化合物、金属离子对POD的活
性均有不同程度的影响，这是POD的结构特点决定的。
Halpin等[26]研究表明，铁离子是POD活性中心的必需成
分，即POD是由单一肽链与卟啉构成的血红素蛋白，脱
辅基蛋白分子必须与血红素结合才能构成全酶。甲醇、
乙醇、异丙醇和正丁醇对该酶均有抑制作用，主要是由
于随着有机溶剂浓度的不断增加，破坏了由氢键、疏水
键和范德华力构成的极性水化层，POD空间结构发生改
变，从而使酶活性降低。KSCN、SDS、AsA对该酶都有
显著的抑制作用，SDS作为一种常见变性剂，能够破坏
蛋白酶分子中的氢键和疏水作用，使分子去折叠，破坏
空间构象，从而导致酶活力下降[17]378-380。而KSCN和AsA
均能破坏血红素亚基，从而使该酶失活[27]。金属离子对
蕹菜POD活性的影响差异较大，其中Zn2+、Mg2+对蕹菜
POD有明显的激活作用，并且随着浓度的增加，激活作
用明显增强；Mn2+、Fe2+对蕹菜POD则具有明显的抑制作
用，尤为明显的是Fe2+在0.01 mol/L时，相对酶活力只剩
下23%，而当Fe2+浓度达到0.02 mol/L时几乎完全抑制；
K+、Ca2+对蕹菜POD作用不明显。
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