全 文 ：第 2 9 卷 第 6 期
2 (X) 8 年 12 月
热 带 作 物 学 报
CH IN E SE J O UR N AL OF T R OP I CAL CR OPS
V o l
.
2 9 N
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6
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T o t a l R N A in S i s a l
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1 C o l l e g e o f L i fe s e i e n e e s
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H e fe i 2 3 0 0 3 6
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C A T A S
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G u an g d
o n g 5 2 4 0 9 1
,
C h i n a
A玩扮a e t H ig h l e v e ls o f p o ly s a e e h iar d e s a n d p o l y p h e n o li e s e o m b in e d w i th n u e l e ie a e id w e er u s e d t o e x tar e t h ig h q u a li-
ty R N A a n d D N A for m
s i s al
.
Im p or v e d S D S a n d im p or v e d C T AB fo r e x tar e t in g t o t al RN A a n d g e n o m e D N A for m
s
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w e er e o m那er d . hT e er s u ]t s s h o w e d rh a t ht e m o d i五e d CTA B e x tar e t io n m e thod w as m o er e fe e t iv e hT e ar t io s Of O D蒯
O D , an d O D刻 O D , w e er b o th u p t o 1 . 8 a n d 2 . 0 , re s p e e t iv e ly . F u rt h e rm o re , t h e C T A B m e th o d w a s m o re e fe e t i v e of r
e x r ar e t io n o f 罗 n o m e DN A w h ie h w a s m o r e p u r e a n d i n t e『 al . M e a n w h il e , PA L g e n e o f s is al w a s e lo n e d , a n d er a e t io n s y s -
t e m o f R A P D w a s o p t im iz e d b a s e d o n th e l e v e ls o f D N A a n d RN A
.
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s in d ie a t e d th a t rh e e x tar e t e d n u e l e ie a e id w as s u i t-
ab l
e fo r a s e ir e s o f b io t e e h n o lo g ie al er s e acr h
e s
.
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e s e m e th o d s a er e s p e e ia ll y u s e fu l fo r p le n ty o f p o ly s a e e h a ir d e a n d h y -
d or x y b e n z e n e P l a n t m a t e ir al s
.
K e y w o r ds
s is al
, n u e l e i e e x t ar e t io n
,
RT 一 P C R , R A P D
C L C N o
.
556 3
.
8
1
。
nI t r o d u C t i o n
S i s al 15 a P e r e n n i a l
, s u e e u l e n t a n d x e r o P h i l o u s if b e r e or p
, a n d o n e o f fe w fo r e i g n e x e h a n g e e a nr i
n g e or p s i n
t or p i e al r e g i o n s
.
A t p er s e n t
,
t h e e u l t i v a t i o n a r e a 15 a b o u t 18 o 0() hm
Z , a n d t h e p or d u e t i o n 15 5 5 0 (X〕 t o n s p e r y e a r i n
C h i n a
,
t h e s e e o n d a n d th e th idr l缨 e s t i n t h e w o r ld , er s P e e ti v e l y (Z h o u a n d L u o , 20() 7 ) . U n fo rt u n a te l y , P or d u e ti o n
15 h a m Pe er d b y d i s e a s e s
,
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,
for
s t a n d t y P h o o n fo r a lo n g ti m e (Z h
a o e t 以 . , 20() 7 )
.
T r a d i ti o n al b er e d i n g p or e e -
d u r e s h a v e n o t b e e n v e叮 s u e e e s s fu l . W i t h t h e d e v e l o Pm e n t o f m o d e m m o l e e u la r b io t e e h n o lo 群 , i t 15 n e e e s s a仃 t ( )
i m p or v e e o n v e n t i o n al b r e e d i n g p or gr a m s w i t h m o l e e u lar b i o t e e h n o l o g i e al w a y s a n d m e a n s s u e h a s m i e or p or p a g a -
t i o n
,
g e n e e l o n i n g
,
m o l e e u lar m a r k e sr
,
g e n e t i e tarn
s fo mr
a ti o n a n d 5 0 o n
,
w h i e h e a n h e lp b er e d e r s t o e v o lv e n
e w
p l a n t t yp e s to m e e t t h e d e m a n d of th
e i n d u s t叮 . M o l e e u lar b i o t e e h n o l o群 er s e a cr h o f s i s al w a s ar r e l y er p o rt e d a t
h o m e a n d b or a d
,
b u t fo e u s e d o n if b e r er s e acr h
.
H i g h q u a l i ty n u e l e i e a e id 15 t h e b a s i s o f g e n e e l o n i n g
, a p er r e q u i -
s i t e t o R T 一 P CR a n d e o n s t ur e ti o n o f l ib r a yr
.
N o t o n l y d o e s s i s a l t i s s u e h a v e to u g h e e l l w a l l
,
b u t a l s o h i g h l e v e l s o f
p o l y s a e e h丽 d e s a n d p o l y p h e n o li e s e o nbr i n e d w i th n u e l e ie a e id . T h e s e af e t o r s s e ir o u s l y i n r e fer r e w i t h t h e e x t r a e t i o n
of n u e l e i e a e id s i n d i fe er
n t w a y s (肠 g e m a n n e t of . , 1 9 8 7 ) . hT e r e fo er , d i fe r e n t m e t h o d s w e r e u s e d to e x tr a e t n u e l e -
ie a e id fr o m y o u n g l e a v e s Of s i s al o n t h e b a s i s o f t h e m e t h o d s fo r th e o t h e r p l a n ts i n o u r e x P e ir m e n t
.
W e s u e e e s s fu l -
l y g a i n e d h i g h q u a l i t y n u e l e i e a e id o f s i s al a n d d e t e e t e d i t b y R T 一p C R a n d R A p D
.
2 M s et ir a l S 8 n d m e t h o d S
2
.
1 m a t e ir ia s
S i s al (H
.
l l 64 8 ) y
o u n g ti s s u e w a s o b ta i n e d fOr m S
o u t h S u b t r o p i c al C or p R e s e a cr h I n s t i t u t e
,
C h i n e s e A c a d e m y
o f T or p i e a l A幼 e u l t u r a l S e ie n e e s , Zh a nj i a n g , C h i n a .
20 7 年公益性行业 (农业 ) 科研专项经费资助 (项 目编号 : ny h y z x 0 7 一 01 8)
王 尉 男 , 19 50 年生 , 硕士 , 助教 。 研究方向 : 作物遗传育种研究 。 eT l : 巧9 56 9() 5 6 57 , E 一 m ial : w an gw ie es o we o一@ 163 . co m
* 通讯作者 。 A u th o r fo r e o re s和 n d e n e e .
收稿 日期 : 20 8 一 0 5 一 2 6 修回日期 : 2X() 8 一 06 一 17
2 7 6热 带 作 物 学 报9 2 卷
2
.
A R 2 Nx etr a et io nbym od in edS DS a nd im Pr ov d eCA B T
T ot alA R Nws a ex tr a et edr f om y
u o n gt iu u s s s ein gm od if i eS dDS a ndm i pr v o eC dA B Tm et hods ds e er ib eb dy
W a n get 以 .( 20 7 )
.
Y ou n gt iu s s e(l
一29 )ws ar f o
z n einl i qu id n itr o gn ea ndr o g
u nd inam or tr a
.
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ePow dr ews atr as nf er ed
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S S b Du f e
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( 2 %
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w : v ) 5 0 m m o l / L E D T A (p H 8
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,
lX() m m
o l /L T ir s 一 H C I (p H 7
.
4 )
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1
.
4 m o l / L N a C I
,
5% p一 m e r -
(: a p t o e t h a n o l ) i
n e l u d i n g l X() 林L p or t e i n a s e K ( 4 m g /m L )
.
O n e t h idr v o l u m e o f 5 m o l /L K A e (p H 4
.
8 ) w
a s a dd e d
.
S a m p l e s w e r e m i x e d b y g e n tl e i n v e sr i o n
, a n d t h e n p l a e e d fo r 10 m i n a t 一 2 0 ℃ . D o u b l e v o l u m e o f a n h yd or u s a le o -
h o l w a s a d d e d
,
p la e e d a t 一2 0 ℃ fo r l h , a n d t h e n e e n t ir fu g e d a t 12 0( X〕 r /m i n , 4 ℃ fo r 10 m i n . hT e s a m e v o l u m e
o f p h e n o l : e h l o r o fo mr
: i s o a m y l al e o h o l (2 5
: 2 4 : l ) w
a s a d d e d an d
e e n t ir fu g e d
.
hT i
s P or e e d u er w a s er p e a t e d
.
D o u b l e
v o l u m e o f a n h y d or u s a l e o h o l a n d o n e t e n t h v o l u m e o f 3 m o l / 1 N a A e ( p H 5
.
2 ) w
e er a d d e d
,
k e p t fo r 3 0 m i n a t
一 2 0 ℃ , a n d th e n e e n t ir fu 罗d . R N A p er e i p i ta t e w a s d i s s o l v e d i n to a p or p e r a m o u n t R N a s e 一 fr e e . O n e t h idr v o l u m e
《们 2 m o l / L L IC I w a s a d d e d , m i x e d fo r a t l e a s t 4 h a t 一2 0 ℃ , a n d t h e n e e n t ir fu g e d fo r 2 0 m i n . R N A p e l l e t s w e er
、 v a s h e d tw i e e w i t h 7 5 % (
v : v
)
e t h a n o l
.
RN A Per e ip i tat e w as d i s s o l v e d i n t o 2 0一 10 林L RN a s e 一 fr e e a n d k e p t a t
一 8 0 ℃ .
Y o u n g t i s s u e ( l
一 2 9 ) w a s for
z e n i n liq u id n it or g e n a n d 卿u n d i n a m o rt ar . hT e 卯w d e r w as tar n s fe er d t o 5 m L
C T AB b u fe
r
(2 % C T A B
,
lX() m m
o l / L irT
s 一 C I (PH 8
.
0 )
,
1
.
4 m OI / L N a C I
,
2 0 m o o l /L E D T A (p H 8
.
0 )
,
5 % 日-
m e cr a p to e th a n o l ) i
n e l u d i n g 10 林 L p or te i n a s e K ( 4 m g /m L )
.
F o ll o w i n g i n e u b a ti o n a t 6 5 ℃ a t Ie a s t 3 0 m i n w i t h
g e n t le m i x i n g e v e叮 5一 8 m i n , 5 m L o f v h e n o l: e ih o or fo mr : i s o am y l al e o h o l ( 2 5 : 2 4 : l ) w a s a d d e d a n d m ix e d
.
S a m -
p l e s w e er e e n t ir fu g e d a t 12 (叉叉) r /m i n , 4 ℃ fo r 15 m i n . O n e th idr v o l u m e o f 1 2 m o l /L L IC I w as a d d e d , m i x e d fo r a t
l e a s t 4 h a t 一 2 0 ℃ , a n d t h e n e e n t ir fu 罗d a t 12 《x x〕 r /m i n , 4 ℃ fo r 2 0 m i n . o n e th idr o f 5 m o l / L K A e (p H 4 . 8 ) a n d
o n e if ft e e n th o f a n h yd or u s al e o h o l w e er a d d e d t o a q u e o u s p h a s e a t l e a s t 2 h a t 一 2 0 ℃ . R N A p e l l e t s w e r e w a s h e d
tw i e e w i t h 7 5 % (
v : v
)
e t h a n o l aft
e r e e n tir fu g a t i o n
.
R N A p er e iP i t a te w a s d i s s o l v e d i n t o a P or P e r am
o u n t R N a s e 一 fr e e
a n d k e p t a t 一 8 0 ℃ .
2
.
3 G e n o m e D N A e x tar c it o n b y C T A B a n d SD S m e t h创如
1
.
3
.
1 C T AB m e th o d d e s e ir b e d b y U u e r 以 . (2X() 5 ) a n d im P or v e d
.
Y o u n g ti s s u e ( l
一 2 9 ) w a s for
z e n i n l iq u id
n i t or g e n a n d 卿 u n d i n a m o rt a r . hT e p o w d e r w a s t r a n s fe er d t o 5 m L o f C T A B b u fe r (2 % C T A B ) , 10 m m o l z L
T ir s 一 C l (p H 8
.
0 )
,
1
.
4 m o l / L N a C I
,
2 0 m m o l / L E DAT (
p H S
.
0 )
,
2 % p一 m e cr a P t o e t h a n o l a n d Z % (w : v ) P V P P i n -
e l u d i n g 10 林L p or *e i n a s e K (4 m g /m L )
.
F o l l o w i n g i n e u b at i o n a t 6 5 ℃ a t l e a s t 1 h w iht g e n tl e m i x i n g e v e理 8一 10
m i n
,
5 m L o f e h l o or fo mr
: i s o a m y l al e o h o l (2 4
: l ) w
a s a d d e d a n d e e n t ir fu g e d a t 1 2 (兀旧 r /m i n fo r 10 m i n . T h e o t h e r
s t e p s w e er fo l l o w e d a s d e s e ir b e d b y L i u e t 以 . (20 5 )
.
2
.
3
.
2 S D S m e t h o d d e s e ir b e d b y Y u e t 以 . ( 2X() 6 ) a n d im p or v e d
.
Y o u n g t i s s u e ( l
一 2 9 ) w a s for
z e n i n l iq u id n i -
t or g e n a n d脚 u n d i n a m o rt a r · hT e p o w d e r w a s t ar n s fe r e d t o 5 m L o f C T A B b u fe r (2 % (w : v ) 5 0 m m o l / L E D T A )
(p H 8
.
0 )
,
lX() m m
o l / L T ir s 一 H C I (p H 7
.
4 )
,
1
.
4 m o l /L N a C I
,
2 % p 一 m e cr a p t oe t h a n o l an d Z % PV P P i n e l u d i n g
10 林 L p r o te i n a s e K (4 m g /m L )
.
F o l l o w i n g i n e u b a ti o n a t 6 5 ℃ at l e as t 3 0 而 n , 5 nIL Of e h l o or fo mr : i s o a m y l al e o h o l
(2 4 : l )
a n d o n e te n t h 3 m o l / L N a A e w e er a dd e d a n d e e n t ir fu g e d at 12 《XX) lr m i n fo r 10 m i n . hT e s t e p w as er p e a t -
e d
.
D N A w a s p er e i p i t a t e d w i t h t h e s a m e v o l u m e o f i s o P or P a n o l a n d o n e te n th 3 m o l /L N aA
e
.
hT
e o t h e r s t e p s w e er
fo l lo w e d a s d e s e ir b e d b y Y u e r al
.
(20 6 )
2
·
4 A n a l y s i s o f n u e l e i c a c ids a n d P C R
a m P肠 e d P r od u e st
B io p h o t o m e t e r p l u s ( D U 64 0 )
a n d a g a or s e g e l e l e e tor p h o r e s i s a n al y s i s w e er a d o p t e d t o e h e e k t h e p u ir t y a n d
y i e l d o f n u e l e i e a e id s
.
PC R a m p l i if e d p r o d u e t s (5 林L ) a n d n u e l e i e a e id s ( l 林 L ) w e er a n al y z e d b y 1
.
2 % (R N A
a n d
P CR p or d u e t s )
a n d 0
.
8 % (D N A )
e l e e tor p h o r e s i s a gaor
s e i n e l u d i n g e t h id i u m b or m id e ( l 卜g /m L ) fo r 4 5 m i n i n l x 阅
口`月,
1
6期 王 尉等 : 剑麻核酸的高效提取及应用 (英文 )72 7
T B E b ufe
a e re o
d ri
ng to4 一 s v/ em
.
S e pa a rte d f ra gm e nts we e rvi s ua li z e d s ui ng a U V im 昭e a e q ui si ti o n, a n d t h e n
p h o t o脚p h e d .
Y ie l d 。 f R N A a n d D N A (林g / g , FW ) = (O D 姗 x 4 o x d i l u t i o n t im e s . x v o l u m e o f s t o e k s o l u t i o n ) / s a m v l e w e i g h t (g )
2
.
5 P A L Of R T 一 P C R fr o m s ias l
o n th e b a s i s o f th e er p o rt e d k e e p i n g fr a gm e n t a b o u t P A L a m i n o a e id
, a n n e x p ir m e sr w e r e d e s i g n e d
.
U p s t r e a m
P r im e r w a s s
’ 一 GT B A A G GC Y A G Y A G TG AT
一 3 ’
.
D o w n s t r e a m p ir m e r w a s s
’ 一 G Y T T YT G C A TC A R Y G G G T 一 3
’ .
O n e s t e P R T 一 CP R w
a s P e for mr
e d w i t h m R N A S e l e e t i v e P CR K i t V e r l
.
l fo mr aT k
a ar C o m P a n y
.
A m P li if e a t i( ) n
p or g r a m w a s 5 0 ℃ fo r 3 0 m i n fo r R T , t h e n 9 4 ℃ fo r 2 m i n t o r e d u e e a e t i v i t y o f RT a s e , fo l l o w e d b y 3 8 e y e le s e a 。: h
o f 9 4 ℃ fo r 3 0 5 , 5 5 ℃ fo r 30 5 , 7 2 ℃ fo r 1 m i n , a if n a l e x t e n s i o n t e m p e r a t u er o f 7 2 ℃ fo r 10 m i n .
2
.
6 O Pd而ez d er a e t io n s y s t e m o f RA p D
T h e R A p D r e ac t i o n s y s t e m w a s o p t im i z e d w i th r e s p e e t t o M扩’ e o n e e n t r a t i o n , dN T p e o n e e n t r a t i o n a n d T m .
T h e fo l l o w i n g e o n e e n t ar ti o n s w e er s t e a d i l y k e P t u n d e r r a n d o m p ir m e r 0
.
1 林m o l / L , 1 . 0 U o f T a q D NA P o lym e r a s e ,
2 0 n g of te m p l a te i n 2 5 林 L PC R s y s t e m . hT e o p t i m u m er a e t i o n p r o g ar m w a s a s fo l l o w s : 5 m i n P r e d e n a t u r i n g a l
9 4 ℃ , fo ll o w e d b y 4 0 e y e l e s o f 1 m i n d e n a t u r a t i o n a t 9 4 ℃ , 1 m i n p r i m e r a n n e a l i n g a t 3 7 ℃ , 9 0 5 p o l y m e r i z a t i ( ) n
a t 7 2 ℃ w i th a if n a l e x t e n s io n a t 7 2 ℃ fo r 10 m i n .
3 R e s ul st a n d a n a ly s i s s
8名,`-ù、曰ù
3
.
1 T o alt R N A a n a ly劝s
oT
ta l RN A w a s i s o l a t e d for m
s i s a l t i s s u e u s i n g im p or v e d
C T A B a n d m o d i if e d SD S
.
T o e o m p a r e t h e tw o m e th o d s
,
t h e q u a n -
t i t y a n d q u a l i t y o f t h e t o ta l R N A w e r e e h e e k e d b y t h e s p e e t r o p h o -
t o m e te r (O D耐 OD , , O D蒯O D现 ) a n d a g a r o s e g e l e l e e tor p h o r e -
5 15 ( F i g
.
l )
.
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e er s u l t s i n d i e a t e d t h a t t h e im p r o v e d C T A B w a s
m o r e e if
e i e n t
.
T h e ar t i o o f O D蒯 O D加 w a s o v e r 2 . 0 , a n d OD蒯
O D加 a b o u t 1 . 8 . T h e q u a n t i t y w a s u P t o 60() 卜g / g , FW . F u rt h e r -
L a n e s l
,
2 : lm P
r o v
ed C T A B ;
助n e s3 , 4 : Mod i五e d S D S
iF g
.
l A g a r o s e g e l e lce t r 0 Ph o re s i s a an ly is s o f
ot 妞 I R N A fr o 〔 n s ias l
m o r e
,
t h e b a n d s o f 5
.
85 a n d 55 w e er o b v i o u s i n e l e e tor Ph o er s is a n a ly s i s
.
hT
e l a n e s we er
n o t s ta i n e d b y p o l y s a e -
e h a r id e s
,
DN A
,
p or t e i n a n d p o l y p h e n o l i e s
·
o n t h e e o n t ar 叮 , t h e q u a n t it y w a s v e叮 l o w b y m o d i if e d S D S (6 0 n g / g ,
FW )
, a l t h o u g h t h e q u al i t y w a s h i g h
.
hT
e t o t al RN A w a s n o t e o n s i s t e n t w it h a s e r i e s o f b io t e e h n o lo g i e a l er s e a r e h e
s
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o t t in g a n d e D N A l ib ar 仃 e o n s utr e t i o n
.
3
.
2 G e n o 幻。 e D N A a n a l y s i s —D u ir n g t h e p or e e s s o f D N A e x t r a e ti o n , C T A B a n d S DS b u fe r lw e r e al l a d d e d w i t h Z % p 一 m e r e a P t o e th a n o l a n d Z % (w : v )p V P p t o p er v e n t for m v o ly p h e n o l ie s . P r o te i n a s e K er d u e e d t h ea e t i v i t y o f D N a se a n d R N a s e , a n d a v o id e d al t o g e t h e r d e p o s i t i n go f p r o t e i n a n d n u e l e i e a e id b y d e e o m p o s i n g o r g a n i e p or t e i n for ms i s al . T h e q u a n t i t y an d q u al i ty o f t h e D N A w e r e e h e e k e d b y t h es p e e t or p h o t o m e te r a n d a g a or s e g e l e l e e t or p h o er s i s (F i g . 2 ) . hT eCAT B m e t h o d o b ta i n e d m o r e q u a n t i t y a n d q u al i t y g e n o m e D N A( 12 2 . 8 m g /g ) . H o w e v e r , S DS e x t r a e t i o n e if e i e n e y w a s w o sr e .3 . 3 R T 一 P C R o f P A L ge n e i n s ias l S】万 n r ht do C l…AB I l r ht 团F igZ A g a r侧笼 ge l e le e t r o P h o er s i s a n a 】y is s o fge no me D N A f or m s ias 】b y SD S an d C T A BbP2 0( 旧! 《XX】7505o25 010 0 . 3 R T 一 P C R 代s ul st o fT o id e n t i fy n u e l e i e a e id q u al i t y ,
e a r i e d o u t a t t h e le v e ls o f R N A a n d
RT 一 PC R o f P A L g e n e w a s
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P A L i n t h e le v e卜 o f R N A a n d D N A
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T w o fr a g m e n t s w e r e e l o n e d w iht a n n e x p ir m e r s (F i g
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7 2 8热 带 作 物 学 报 9 2卷
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s n 0 W e a I n e Ia c t o sr 0 1 a m P l l l l c a t l o n W e er o P t lm田 .
4 D i s c u s s i o n a n d c o n c lus i o n
T is s u e s for m
s i s a l p l a n t s e o n ta i n h ig h e r p o lyp h e n o l ie e o m p o u n d s a n d p o ly s a e e h a ir d e s
.
M o s r s t a n dadr p
r o e e -
d u r e s fo r n u e le ie a e id e x t ar e t io n e a n n o t r e m o v e e o n t a m i n a t e d p l a n t P o l y s a e e h a ir d e s o r p o l y p h e n o l i e e o m P o u n d s
,
w h i e h e a n h a v e d i r e e t e fe
e t s o n s u b s e q u e n t P C R a m p l iif e a t i o n ( F
a n g e t 以 . , 19 9 2 ) . In t h e e x p e ir m e n t , t h e m e t h o d s
r e P o rt e d b y W a n g e t 以 . (20 7 ) fo r t h e P er p a ar t io n o f R N A for m d i fe er n t ti s s u e s i n b a n a n a w e er m o d i if e d
.
In a n a t -
t e m p t t o o v e r e o m e p o ly s a e e h面 d e s , e x t ar e t i n g s o l u t i o n s o f CTA B a n d S D S e a n er m o v e p o ly s a e e h a ir d e s b y fo mr i n g
i n s o lu b l e e o m p l e x e s
,
b u t o t h e r m e a n s m u s t u s u al l y b e fo l l o w e d
, s u e h as p er
e ip i t a ti o n m e t h o d o f L IC I (S h
a n e t 以 . ,
2 0 0 2 ; J i
a n g e t 以 . , 2X() 3 ) , w h ie h w a s t h e s a m e as o u r e o n e l u s i o n
·
B e e an
s e o f R N A p er e ip i t a ti o n i n 7 5 % e t h a n o l
(X i a o e z 以 . , 20 3 ) , s e l e e t i v e P r e e i p i t a t i n g P o ly s a e e h a ir d e s o r R N A e a n b e u s e d (Z h o u e r 公 . , 2 0( 碎 ) . 5 0 w e a d o P t e d
5 m o l / L K A e
,
3 m o l / L N a A e (p H 5
.
2 )
,
h ig h e o n e e n t ar t i o n o f N a C l a n d o n e th idr
o f s m o l / L K A e ( P H 4
.
8 ) w i t h
o n e
if ft e e n th o f a n h y d or u s a l e o h o l t o er m o v e p o l y s a e e h a ir d e s d u ir n g RN A a n d D N A e x t ar e t i o n
.
A t p er s e n t
,
p o l y p h e n o l i e s a n d v i脚 e n t w e r e p r e v e n t e d for m o x y g e n a ti o n b y th e m e th o d o f r e d u e e r ( p一 m e cr a p -
t o e t h a n o l a n d e y s t e i n e ) (S
u a n d G ib o r
,
19 8 8 )
, e h e l a t e d m e th o d (p
o l y v i n y lp ymr l id
o n e , PV p )
,
T ir s 一 b o ar e i e a e id ,
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.
W
e u s e d s % p
一 m e cr a p to e t h a n o l i n p l a e e o f PV PP to e h e l a t e p o ly p h e n o l i e s , b e e a u s e i t e a n b e ti g h t l y e o m -
b i n e d w i th l o n g P o l y (A )
o f m R N A ( B ah l
o u l a n d B u r k a r d
,
1993 )
a n d ier
v e r s ib l y ab
s o r b w a t e r s a t u ar te d Ph e n o l s
fo mr i
n g w h i te e o m p o u n d s
,
l e a d i n g to R N A 10 5 5 d u ir n g e e n t ir fu ig
n g
.
M o r e o v e r
, s t a i n i n g P or t e i n e an b ir n g t o t h e d e 一
e l i n e o f R N A q u a l i t y a n d e fe
e t o n t h e s u b s e q u e n t e x p e ir m e n t o f m o l e e u lar b i
o l o盯 . 5 0 p or te i n as e K w a s u s e d t o
d e e o m p o s e i t
, a n d t h e n P h e n o l : e h l o or fo mr
: i s o a m y l 日e o h o l ( 2 5 : 2 4 : l ) w a s a d o P t e d t o e x t r a e t er m a i n i n g P or t e i n b e 一
s id e s u s i n g S DS
,
C T A B a n d m e cr a p to e t h an
o l i n t h i s e x Pe ir m e n t ( J
o s e p h a n d D a v id
,
2X() 3 )
.
In t h e r w o m e t h o d s o f im P or v e d C T A B a n d m o d i if e d SD S
,
th e o b v i o u s d i fe er
n e e s w e er th e e alr y
o r l a t e s e -
q u e n e e s o f s e v a ar t i n g R N A a n d p r e e i p i ta t i n g p o l y s a e e h iar d
e s
.
C o m p aer d
w i t h m o d iif e d SD S
,
p h e n o l : e h l o or fo mr
:
i s o a m y l a l e o h o l w a s u s e d fo r or u g h e x tar e t i o n o f p or t e i n i n i m p or v e d CAT B
, a n d th e n
,
RN A w a s s e l e e t iv e ly p r e e ip -
1ta t e d b y a dd i n g o n e fo rt h v o l u m e o f 12 m o l /L U C I
,
P o l y s a e e h air d
e w as k
e p t in th e a q u e o u s p h a s e
.
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e re m a i n s
w e re re m o v e d b y 5 m o l / L K A e ( l / 3V )
a n d e t h a n o l ( l / 1 5V )
.
H o w e v e r
,
P o ly s ac e h iar d
e s w e er s e l e e t iv e l y P er e i P i t a t -
e d i n m o d i if e d S D S b y 5 m o l / L K A e (P H 4
.
8 ) fo r o n e th i n g
.
RN A w as
s e par
t e d for m g
e n o m e D N A a n d o t h e r m i x -
t u er s b y L IC I
.
H ig h q u al i ty R N A w a s o b ta i n e d i n th e tw o m e t h o d s
,
b u t th e im p or v e d SD S w as i n e if e i e n t a n d e o m -
p l e x i n th e p or e e s s o f e x t ar e t i n g
.
W e s h o u l d p a y a rt e n t i o n to s e l e e t i n g e x tr a e ti o n m e t hdo an d er as
o n a b l e
ar
n g e -
m e n t o f th e o r d e r a e e o dr i n g to m a t e ir al s
.
hT
e er s u l t s t h a t t h e q u al i ty n u e l e i e a e id w as
e x t ar e t e d for m m
a n y P l a n t s
b y t h e s a m e w a y w e r e q u i t e d i s e r e p a n t
.
5 0 i t m u s t b e v al id a te d b y e x p e ir m e n t
.
In e o n e l u s io n
,
C T A B w a s m o r e e if
e ie n t t h an S D S i
n e x t
acr
t i n g n o t o n l y R N A b u t al so D N A i n s i s al
.
P A L
g e n e w a s s u e e e s s fu l l y e l o n e d
, a n d R A P D w as am p li if
e d w h e n u s i n g R N A a n d D N A for m l
e a v e s o f s i s a l b y CAT B
m e th o d
.
hT
e i s o l a t e d RN A a n d D N A w e r e s u i tab l
e fo r RT 一 PC R , b l o t t i n g an d e o n s t ur e t i o n o f lib r a yr
.
6期 王 尉等 : 剑麻核酸的高效提取及应用 (英文 )
R e e fe rC ns e
B曲 I o uz M. , B u 改耐 e . ( l卯 3 ) . A n im p or v e d m e th记 拓 r th 。 ios lat so n o f t o t目 R N A ofr m s p ru e e t i s s u e s [J I . P一an r M o l . B i o l . Re p . , l 一: 2一2 一 2 25
Fan g G
. ,
H
anur
5
. ,
G川 m e t R . ( 19 2 )
.
A q u ie k an d i
n xe 伴 n s i v e m e th od of r re m o v i n g po ly s , e h iar d e s ofr m plan t罗 n o m i e D N A【J」. B i o t e e h n iq u e s ,
13 : 5 2 一 5 6 .
J
o
se Ph 5
. ,
D a v id W
.
R
.
(2叨3 ) . M o le e u lar Clo n i n g 【M ]. B e iji n g : S e i e n e e P r e s s .
肠 g e m an n J . , cS h e l l J . , W ilim itzer L
.
( 19 8 7 )
.
I m Po v de m e th记 ofr iOlS a t i朋 of R N A ofr m Plan t t is u e s l J」. A n al Bi oc h e m , 16 3 : 16 一 2 0
J i an g J
.
X
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Zh , 9 T
.
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.
(2X() 3 )
.
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e t Of D N A玩 m ig n k , le a v e s an d i t s R A PD am p li if e at i o n [J l. A c t a G朋 s yP i i Si n i e a , 15 (3 ): 16 6 一 16 7 .
U u Y
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X
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Y an g X
.
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,
A n im p o v e d p roc
e d u re fo r n u e le ar D N A i叨 lat i o n 俪m E ir o bot 口a p lan t s an d i t s a p p li e a t i o n 【J ] .
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2 2 (2 )
: 18 2 一 18 5 .
Sh an l月卫1 , W an g B ao li
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.
(2加2 ) . M e th od fo r iso lat in g fu n e t i o n al R N A 阮m th e ir p e n i n g pe rs i
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e o n t e n t e d ir e h p o ly s ac e h二 d e s
an d po l即h e n o lie s 【J」. P lan t hP y s iol o罗 C omu
n i e a t i o n s
,
3 8 ( 5 )
:
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、 4 64
.
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( 19 8 8 )
.
A m e th od fo r R N A iso la t i o n fro m m iar
n e m a e ro 一 al g a e 【J』. A n al . B ioc h e m . , 17 4 : 6 5 0 一 65 7
Wan g W
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s of r t o tal R N A e x tacr t i
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X iao J
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orP 脚 5 5 In B i ot ce h n o lo gy , 2 3 ( 1 1 ): 8 4 一 8 6 .
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.
E x trac t of D N A 玩m ig n k即 le a v e s an d i t s RA P D am P li if e at i o n [ J] . B iot e e h n o lo gy B u lle t in , 2 : 8 1、 84
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.
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2 9 ( 6 )
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( 2X( 妈 ) . l m p o v eme n t o f e x tacr t i o n m et hod o f t ot al R N A 阮m s tawr b e叮 frU i t w i t h ab u n d an t OP lym e ir o e a r bo h yd r a t e s 【J l
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s o f i m p or v in g i n n o v at i o n al ab ili t y i
n s i s al s e i e n t i if e re s e二 h 【J」. lP an t F ib e o S e i e n e e s in Ch i n a , 2 9 :
1《只 ` 1 1 1
剑麻核酸的高效提取及应用
王 尉 ’ ,2 周 文钊 2’
1 安徽农业大学生命科学院 安徽合肥 2 3 0 036
2 中国热带农业科学院南亚热带作物研究所 广东湛江 52 40 91
摘 要 针对剑麻组织中多糖 、 多酚和次生物质含量高的特点 , 对其总 R N A 和基 因组 DN A 提取进行
研究 。 比较了改良 SD S 法 、 改 良 C T A B 法提取总 RN A 和 SD S 法 、 C T AB 法提取基因组 D N A 的效果 , 结果
表明 : 改 良 CTA B 法提取总 R N A 效果较佳 , 所得 R N A O D 蒯 口D 二 高于 1 . 8 , OD 蒯 O D 刃 大于 2 . 0 , 而
C T A B 法提取基因组 D N A 纯度和完整性较好 。 基 于 RN A 和 D N A 水平 , 分别对剑麻的苯丙氨酸解氨酶基
因 (PA )L R T一CP R 和 RADP 反应体系进行优化 , 均得到理想条带 。 此方法提取剑麻的核酸可运用 于后续
分子生物学研究 , 为其它材料核酸的分离提供参考依据 。
关键词 剑麻 核酸提取 RT 一 P CR R A P D
中图分类号 5 5 6 3 . 8