全 文 ：福建农林大学学报(自然科学版) 第 38卷 第 3期
JournalofFujianAgricultureandForestryUniversity(NaturalScienceEdition) 2009年 5月
收稿日期:2008-07-07　　修回日期:2008-10-06
基金项目:国家科技部 “国家科技攻关计划引导项目 ”(2005BA741C).
作者简介:顾地周(1973-),男 ,讲师.研究方向:长白山珍稀濒危植物和药用植物.
条叶百合和垂花百合高效快繁体系的建立
顾地周 1 , 赵淑玲 2 , 郭　伟 1 , 朱俊义 1 , 姜云天1
(1.通化师范学院生物系 ,吉林 通化 134002;2.振国药业有限公司 ,吉林 通化 134100)
摘要:以条叶百合和垂花百合的鳞片为外植体 , 应用均匀设计法对各步骤各主要因子和水平的作用进行了试验探讨.结果
表明:条叶百合鳞茎诱导最适宜的培养基为 N6 +0.05 mg· L-1 IAA+0.01 mg· L-1 NAA+0.50 mg· L-1 KT, 诱导率为
95.5%,鳞茎萌发为完整植株的最佳培养基为 N6 +0.01 mg· L-1 IAA,萌发率为 94%;垂花百合鳞茎诱导最适宜的培养基
为 N6 +0.05mg· L-1 IAA+0.50mg· L-1 KT, 诱导率为 95%,鳞茎萌发为完整植株的最佳培养基为 N6 +0.01mg· L-1 IAA
+0.001 mg· L-1 NAA, 萌发率为 92.5%.以鳞茎的切片为材料进行快繁的结果表明 , 在 35 -40d的一个培养周期内 , 增殖
系数达 10以上.对不同阶段培养材料的形态及超微结构的观察证明了 2种百合的鳞茎发生发育过程.
关键词:条叶百合;垂花百合;均匀设计;快繁
中图分类号:S682.2+9 文献标识码:A 文章编号:1671-5470(2009)03-0243-05
EfficientmicropropagationsystemofLiliumcallosumandLiliumcernum
GUDi-zhou1 , ZHAOShu-ling2 , GUOWei1 , ZHUJun-yi1 , JIANGYun-tian1
(1.DepartmentofBiology, TonghuaNormalUniversity, Tonghua, Jilin134002, China;
2.ZhengguoPharmaceuticalCo.Ltd., Tonghua, Jilin134100, China)
Abstract:ThescalesofLiliumcalosumSieb.etZucc.andLiliumcernumKom.wereusedasexplants.Theefectsofmainfactors
ofvariouslevelsateachstepwereinvestigatedthroughuniformdesignexperiments.TheresultsshowedthatN6 +0.05mg· L-1 IAA
+0.01 mg· L-1 NAA+0.50 mg· L-1 KTwasmostsuitableforL.calosumwithaninductionrateof95.5%, N
6
+0.01 mg· L-1
IAAwasmostsuitableforL.calosumwithagerminationrateof94%;N6 +0.05 mg· L-1 IAA+0.50KTmg· L-1 wasmostsuit-
ableforL.cernumwithaninductionrateof95%, N6 +0.010mg· L-1 IAA+0.001 mg· L-1 NAAwasmostsuitableforL.cernum
withagerminationrateof92.5%.Sliceseachwithonenodewerecutfrominducedbulbletsandculturedforpropagation, anda10-
foldproliferationratewasachievedwithin35 -40 days.Theobservationofmorphologicalstructureandultrastructureprovedthe
processofinducingbulbletsandbulbletsgerminationofthetwokindsoflily.
Keywords:Liliumcallosum;Liliumcernum;uniformdesign;micropropagation
条叶百合(LiliumcalosumSieb.etZucc.)和垂花百合(LiliumcernumKom.)均为百合科百合属多年生
草本植物 ,系长白山区野生珍稀濒危药用植物[ 1] ,鳞茎入药 ,具有养阴润肺 、清血安神等功效 ,主治结核
咳 、虚烦惊悸 、神经衰弱等症.条叶百合花梗直立 ,花红色或橙黄色 ,色泽艳丽;垂花百合花朵下垂 ,花粉红
色 ,具紫色斑点 ,十分美观 ,可驯化为园艺植物 ,用于花坛 、花境等的绿化 ,也可开发为鲜切花 ,还可作为百
合育种的种质资源.2种百合在长白山区数量十分稀少 ,分布区域十分狭窄 ,在部分地区仅呈零星分布 ,开
发及利用受到限制 ,因其种子不易获得 ,其常规繁殖主要靠分蘖方式 ,繁殖系数小.鳞茎发生途径经历与胚
发育相似的过程 ,形成子球茎后萌发进而发育为完整植株 ,不仅繁殖系数高 ,而且可用于人工种子的制作 ,
大大提高种苗的生产效率 ,并可用于遗传转化 ,直接通过鳞茎发生途径获得抗逆性强的转基因百合植株.
目前 ,国内外关于百合鳞茎发生的研究报道较多[ 2-3] ,但条叶百合和垂花百合的相关研究尚未见报道.本
试验在前人报道的基础上 ,研究 2种百合鳞茎的发生体系 ,旨在明确高效 、稳定的鳞茎诱导 、发育及萌发条
件;同时对鳞茎诱导及其萌发过程中的形态及超微结构进行研究 ,为深入了解 2种百合鳞茎发生的形态学
及形态调控技术提供依据 ,为提高种苗生产率和制作百合人工种子提供参考.
DOI :10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2009.03.012
1　材料与方法
1.1　外植体材料及其处理
6月份于吉林省通化白鸡腰国家级自然保护区采集条叶百合和垂花百合 2种百合鳞茎.在实验室内
将外层鳞片剥下取内层幼嫩小鳞片 ,在超净工作台上用 70%酒精涮洗 30s,再用 0.5%次氯酸钠浸泡 6 min,
最后用无菌水冲洗 8次[ 4-6] .用无菌滤纸吸干表面水分 ,切除被杀菌消毒剂损伤部位后作为外植体备用.
1.2　2种百合鳞片直接诱导鳞茎的培养基筛选
以 N6为基本培养基 ,附加 50 g· L-1蔗糖 、8.5 g·L-1琼脂粉 , pH5.9,温度(25±2)℃,暗培养 ,将经
过处理的外植体接种到附加不同含量的 IAA、IBA、NAA和 KT.由预试验可知 , IAA含量为 0.05-0.10 mg
· L-1 , IBA含量为 0.03-0.07 mg· L-1 , NAA含量为 0.01-0.05 mg· L-1 , KT含量为 0.10-0.50 mg·
L-1.含量低于控制范围的植物生长调节物质不能促使 2种百合鳞片诱导出鳞茎;含量过高的植物生长调
节物质导致鳞片脱分化为愈伤组织而不能直接诱导出鳞茎 ,不采取愈伤组织再生芽苗的快繁方式以确保
遗传的稳定性.为了提高百合鳞茎诱导的速度和诱导率 ,采用均匀设计法 [ 7] ,每个处理接种 30个外植体 ,
研究 IAA、IBA、NAA和 KT交叉配比对 2种百合鳞片直接诱导鳞茎的影响 ,筛选最适宜的鳞茎诱导培养
基.U10(104)均匀设计试验安排如表 1所示.
1.3　鳞茎高效增殖体系的建立
以 2种百合鳞片诱导产生的鳞茎为材料 ,将整个鳞茎切割成薄片 ,再转接到优化后的鳞茎诱导培养基
中进行鳞茎增殖培养 ,统计并计算增殖周期和系数.
1.4　2种百合鳞茎萌发为完整植株的培养基筛选
待鳞茎增殖到一定数量后 ,将鳞茎逐个剥离下来转接到附加不同含量 IAA和 NAA的 N6培养基中进
行鳞茎萌发为完整植株的培养.由预试验可知 , IAA含量为 0.005-0.01 mg· L-1 , NAA含量为 0.001-
0.005mg·L-1.含量低于控制范围的生长素降低了 2种百合鳞茎的萌发和生长速度;含量过高的生长素
导致鳞茎再次产生子球 ,延缓鳞茎的发育速度及完整植株的再生进程.为了提高 2种百合鳞茎成功发育为
完整植株的速度 ,每个处理接种 30个鳞茎 ,研究 IAA和 NAA交叉配比对 2种百合鳞茎萌发率的影响 ,筛
选最适宜的鳞茎萌发为完整植株的培养基.U10(102)均匀设计试验安排如表 2所示.
N6培养基附加 20g· L-1蔗糖 、8.5g· L-1琼脂粉 , pH5.9,温度(25±2)℃,光照度 1200lx,光照周期
12 h·d-1.
1.5　结果观察
采用数码相机对外植体各阶段的形态变化进行拍摄;同时 ,对不同阶段的培养物进行扫描电镜观察和
拍摄.
1.6　数据分析
数据分析与处理采用均匀设计软件.选用 U10(108)均匀表 ,回归分析均采用全回归(后退)法.
2　结果与分析
2.1　植物生长调节物质交叉配比对条叶百合鳞片直接诱导鳞茎的影响
试验所得数据(表 1)经均匀设计软件分析处理后(表 3)可知 ,回归方程显著.根据回归方程求出 Y1
的最优组合为:X1 =0.05, X2 =0, X3 =0.01, X4 =0.50,在此组合基础上求得最优解:y=95.0,此解为方程的
解析解 ,需按公式 Y=y±uα· s计算出优化值区间估计为 Y1 =95.0(±0.945),即 94.055% -95.945%.以
最优组合做验证试验 ,将条叶百合鳞片接种到附加 0.05 mg· L-1 IAA、0.01 mg· L-1 NAA和 0.50 mg·
L-1 KT的 N6培养基中培养 15d,鳞片切口处开始出现球状突起;继续培养至 35 d,球状突起转变为近鱼
雷状的球形鳞茎 ,同时部分鳞茎伴有根的产生(图 1A),鳞茎诱导率达 95.5%以上 ,在估计区间范围内 ,且
比所有试验 Y1值都大.可见 ,条叶百合鳞片诱导鳞茎的最佳诱导培养基为:N6 +0.05 mg·L-1 IAA+0.01
mg·L-1 NAA+0.50 mg·L-1 KT.
·244· 福建农林大学学报(自然科学版) 第 38卷　
表 1　U10(104)均匀设计试验安排及结果 1)
Table1　TheplanandresultofU10(104)uniformdesigntest
处理号 因素 /(mg· L
-1)
X1 X2 X3 X4
Y1 /% Y2 /%
1 0.05 0.05 0.04 0.50 91.0 92.0
2 0.06 0.03 0.03 0.50 89.0 88.5
3 0.07 0.06 0.01 0.40 85.0 80.0
4 0.08 0.03 0.05 0.40 76.5 76.0
5 0.09 0.06 0.02 0.30 74.0 73.0
6 0.10 0.04 0.02 0.30 70.5 69.0
7 0.08 0.07 0.05 0.20 72.0 70.5
8 0.07 0.04 0.01 0.20 81.0 77.5
9 0.06 0.07 0.03 0.10 80.0 76.5
10 0.05 0.05 0.04 0.10 83.0 78.5
　　　1)X
1
为 IAA含量 , X
2
为 IBA含量 , X
3
为 NAA含量 , X
4
为 KT
含量 , Y1、Y2分别为条叶百合和垂花百合鳞茎的诱导率.
表 2　U10(102)均匀设计试验安排及结果 1)
Table2　TheplanandresultofU10(102)uniformdesigntest
处理号 因素 /(mg·L
-1)
X1 X2
Y3 /% Y4 /%
1 0.005 0.004 52.5 85.5
2 0.006 0.003 59.5 87.0
3 0.007 0.001 65.5 89.0
4 0.008 0.005 76.0 88.0
5 0.009 0.002 81.0 90.5
6 0.010 0.002 93.0 91.0
7 0.007 0.005 68.5 87.0
8 0.008 0.001 73.0 90.0
9 0.009 0.003 82.0 90.0
10 0.010 0.004 90.5 91.0
　　　1)X
1
为 IAA含量 , X
2
为 NAA含量 , Y
3
、Y
4
分别为条叶百合和
垂花百合鳞茎的萌发率.
表 3　条叶百合和垂花百合高效快繁各阶段的回归分析结果 1)
Table3　RegressionanalysisresultofeficientmicropropagationofL.calosumandL.cernuminvariousstages
培养阶段 回归方程 复相关系数(R) 剩余标准差(S) 检验值(Ft) 临界值
条叶百合鳞茎诱导 Y1=105.0-383.0X1 -123.0X3 +21.3X4 0.9996 0.255 2250.00 F(0.01 , 3 , 6)=9.780
垂花百合鳞茎诱导 Y2 =93.4-340.0X1 +29.5X4 0.9819 1.570 93.98 F(0.01 , 2 , 7)=9.547
条叶百合鳞茎萌发 Y3 =12.7+7880.0X1 0.9934 1.580 602.80 F(0.01 , 1 , 8)=11.260
垂花百合鳞茎萌发 Y4 =82.3+1010.0X1 -448.0X2 0.9933 0.253 257.20 F(0.01 , 2 , 7)=9.547
　　1)样本容量 n=10,显著性水平 α=0.01.
A.条叶百合的鳞茎诱导(35d);B.条叶百合的鳞茎增殖(38d);C.条叶百合的鳞茎萌发为完整植株(20d);D.垂花百合的
鳞茎诱导(30d);E.垂花百合的鳞茎增殖(35d);F.垂花百合的鳞茎萌发为完整植株(25d).
图 1　2种百合鳞茎诱导和萌发各阶段的形态结构
Fig.1　Morphologicalstructureofthebulbletsoftwokindsoflilyinvariousstagesofinducingandgermination
2.2　植物生长调节物质交叉配比对垂花百合鳞片直接诱导鳞茎的影响
试验所得数据(表 1)经均匀设计软件分析处理后(表 3)可知 ,回归方程显著.根据回归方程求出 Y2
的最优组合为:X1 =0.05, X2 =0, X3 =0, X4 =0.50,在此组合基础上求得最优解:y=91.2,此解为方程解析
解 ,需按公式 Y=y±uα· s计算出优化值区间估计为 Y2 =91.2(±5.49),即 85.71%-96.69%.以最优组
合做验证试验 ,将垂花百合鳞片接种到附加 0.05 mg· L-1 IAA、0.50 mg· L-1 KT的 N6培养基中培养 12
·245·　第 3期 顾地周等:条叶百合和垂花百合高效快繁体系的建立
d,鳞片切口处开始出现球状突起;继续培养至 30 d,球状突起转变为近鱼雷状的球形鳞茎(图 1D),鳞茎
诱导率达 95%以上 ,在估计区间范围内 ,且比所有试验 Y2值都大.可见 ,垂花百合鳞片诱导鳞茎的最佳诱
导培养基为:N6 +0.05mg·L-1 IAA+0.50mg·L-1 KT.
2.3　鳞茎高效增殖体系的建立
分别以 2种百合鳞片诱导产生的鳞茎为材料 ,将整个鳞茎切割成薄片 ,再分别转接到优化后的鳞茎诱
导培养基中进行鳞茎增殖培养.培养 10d后 , 2种百合鳞茎切片表面球状突起;继续培养至 25d,球状突起
转化为鳞茎;培养至 50 d后可产生大量的鱼雷状鳞茎(图 1B、1E).35-40 d为 1个增殖周期 , 2种百合每
瓶增殖系数平均都达 10以上.随着增殖次数的增加可适当降低生长素含量 ,避免激素积累导致鳞茎形态
发生变化.
2.4　生长素交叉配比对条叶百合鳞茎萌发为完整植株的影响
试验所得数据(表 2)经均匀设计软件分析处理后(表 3)可知 ,回归方程显著.根据回归方程求出 Y3
的最优组合为:X1 =0.01, X2 =0,在此组合基础上求得最优解:y=90.5,按公式 Y=y±uα· s计算出优化值
区间估计为 Y3 =90.5(±5.30),即 85.20%-95.80%.以最优组合做验证试验 ,将条叶百合鳞茎接种到附
加 0.01mg·L-1 IAA的 N6培养基中进行萌发培养 ,培养 10 d,条叶百合鳞茎上部长出 2-3片嫩叶 ,同时
基部出现白色根锥;20d后鳞茎长出 5-10片翠绿色的嫩叶 ,呈明显生长趋势;继续培养至 30d,嫩茎基部
直接长出 3-5条肉质的不定根(图 1C);40d后苗高可达 5.0cm以上 ,根长可达 3.0cm以上 ,根和苗的形
态 、发育均正常 ,萌发率达 94%以上 ,在估计区间范围内 ,且比所有试验 Y3值都大.可见 ,条叶百合鳞茎萌
发为完整植株的最佳培养基为:N6 +0.01mg· L-1 IAA.
2.5　生长素交叉配比对垂花百合鳞茎萌发为完整植株的影响
试验所得数据(表 2)经均匀设计软件分析处理后(表 3)可知 ,回归方程显著.根据回归方程求出 Y4
的最优组合为:X1 =0.010, X2 =0.001,在此组合基础上求得最优解:y=91.9,此解为方程解析解 ,需按公式
Y=y±uα· s计算出优化值区间估计为 Y4 =91.9(±0.886),即 91.014%-92.786%.以最优组合做验证试
验 ,将垂花百合鳞片接种到附加 0.01mg· L-1 IAA、0.001 mg· L-1 NAA的 N6培养基中培养 15 d,鳞茎基
部开始出现根锥;培养 25d后 ,鳞茎可长出 7-10片翠绿色的嫩叶;继续培养至 35d,鳞茎基部直接长出 3
-5条肉质的不定根(图 1F);45 d后苗高可达 5.5cm以上 ,根长可达 3.0cm以上 ,根和苗的形态 、发育均
正常 ,萌发率达 92.5%以上 ,在估计区间范围内 ,且比所有试验 Y4值都大.可见 ,垂花百合鳞茎萌发为完整
植株的最佳培养基为:N6 +0.01mg·L-1 IAA+0.001mg·L-1 NAA.
2.6　扫描电镜观察结果
2种百合鳞茎诱导及发育各阶段组织结构扫描电镜观察结果如图 2所示.
A.条叶百合的原球茎;B.条叶百合的鳞茎;C.垂花百合的原球茎;D.垂花百合的鳞茎.
图 2　2种百合鳞茎诱导及发育各阶段组织结构扫描电镜观察
Fig.2　Scanningelectronmicroscopicalobservationofthebulbletsoftwokindsoflilyinvariousstagesofinducingandgermination
在扫描电镜下可以观察到鳞片表面浮有大量的球状突起 ,这些球状突起是鳞茎发生过程中鳞茎的前
体 ,即原球茎(图 2A、2C),原球茎形成后与鳞片之间产生了结构上的隔离 ,这正是鳞茎发生的先决条件.
继续培养后 ,球状突起转变为鱼雷状 ,这是原球茎经发育而成的鳞茎 ,其表面有明显的鳞片(图 2B、2D).
原球茎形成后 ,随着培养时间的延长 ,原球茎会经历鳞茎发育阶段 ,且每个原球茎最终都能独立发育成完
·246· 福建农林大学学报(自然科学版) 第 38卷　
整的植株 ,具有相对的独立性.
3　讨论
本试验结果表明:N6 +0.05mg·L-1 IAA+0.01mg·L-1 NAA+0.50 mg· L-1 KT和 N6 +0.05 mg·
L-1 IAA+0.50 mg· L-1 KT培养基分别对条叶百合和垂花百合鳞片诱导鳞茎的效果最好 , 2种百合离体
培养采取鳞片再生鳞茎的方式 ,遗传稳定性好 ,速度快 ,诱导率高;2种诱导培养基均附加 0.50 mg· L-1
KT可提高鳞片的诱导速度和诱导率 ,从而缩短了诱导周期;条叶百合和垂花百合鳞茎萌发为完整植株的
培养基分别为 N6 +0.01mg· L-1 IAA和 N6 +0.01mg· L-1 IAA+0.001mg· L-1 NAA,所选用的生长素
种类不同 ,原因可能是各自萌发的机理不同.与以往百合鳞茎增殖不同的是 ,本试验以诱导产生的鳞茎切
片为材料 ,方法简便 ,经济实用 ,可操作性强 ,增殖系数高 ,达到了高效快繁的目的 ,并且应用均匀设计法处
理和分析数据 ,大大缩短了培养基配方的摸索周期 ,减少了试验次数.鳞茎发生过程中的扫描电镜观察表
明 , 2种百合鳞茎在发生过程中具有和胚发生相似的阶段.本试验发现 ,原球茎形成后与其周围组织之间
产生了结构上的隔离 ,这正是鳞茎发生的先决条件 ,且每个原球茎最终都能萌发成完整的植株 ,具有相对
的独立性.本试验初步建立了条叶百合和垂花百合相对稳定的高效离体快繁体系 ,达到了预期目的 ,为进
一步完善百合鳞茎发生调控体系和阐明鳞茎发生发育机理提供了参考.近些年来 ,欧洲一些国家开发的百
合园艺栽培种进入中国市场 ,我国仅少许百合品种得到引种.条叶百合和垂花百合系长白山区地产百合 ,
都是上好的抗寒园艺品种 ,但包括这 2种百合在内的长白山区野生百合至今未得到引种和广泛用于栽培
观赏和药用.本试验结果可能对长白山区百合的开发利用和工厂化育苗有一定的参考意义.
参考文献
[ 1] 周繇.长白山区野生珍稀濒危药用植物资源评价体系的初步研究 [ J] .西北植物学报 , 2006, 26(3):599-605.
[ 2] 陈小兰 , 胡琼华 ,王红霞.金百合的离体快速繁殖 [ J] .植物生理学通讯 , 2000, 36(4):334.
[ 3] 鄢铮 , 郭德章.布鲁诺百合的组织培养和快速繁殖 [ J] .植物生理学通讯 , 2003, 39(6):627.
[ 4] 叶炜 , 赖钟雄 ,陈义挺 , 等.51份龙眼种质的胚性愈伤组织诱导及其离体保存 [ J] .福建农林大学学报:自然科学版 ,
2007, 36(1):28-33.
[ 5] 李斌连 , 邱萃 ,刘金仙 , 等.南方红豆杉愈伤组织诱导和继代培养体系的建立 [ J] .福建农林大学学报:自然科学版 ,
2006, 35(5):515-518.
[ 6] 陈晓静 , 李梅婷 ,林馨.非洲菊的组培快繁 [ J] .福建农林大学学报:自然科学版 , 2006, 35(2):169-172.
[ 7] 方开泰.均匀设计—数论方法在试验设计的应用 [ J] .应用数学学报 , 1980, 3(4):363-372.
(责任编辑:施晓棠)
·247·　第 3期 顾地周等:条叶百合和垂花百合高效快繁体系的建立