免费文献传递   相关文献

垂花百合花器官离体培养



全 文 :1894-1898
12/2012
草 业 科 学
PRATACULTURAL SCIENCE
29卷12期
Vol.29,No.12
垂花百合花器官离体培养
刘 芳1,2,王晓丽1,3,张彦妮1,杨青杰1,周蕴薇1
(1.东北林业大学园林学院,黑龙江 哈尔滨150040;2.黑龙江八一农垦大学农学院,黑龙江 大庆163319;
3.呼伦贝尔市蚕业科学研究所,内蒙古 呼伦贝尔162650)
摘要:以垂花百合(Lilium cernum)的花器官(花瓣、花托、子房)为外植体进行组织培养,结果表明,3种花器官外
植体的愈伤组织的诱导能力和分化能力各不相同,花瓣愈伤组织的诱导率及分化率最高,分别可达57.65%和
81.12%;诱导愈伤组织由易到难依次为花瓣>花托>子房;花瓣外植体诱导愈伤组织的最适培养基为 MS+
6-BA 2.0mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1,子房外植体诱导愈伤组织的最适培养基为 MS+6-BA 1.0mg·L-1+
NAA 0.5mg·L-1,花托外植体诱导愈伤组织的最适培养基为 MS+6-BA 1.0mg·L-1+NAA 0.2mg·L-1;
最适生根培养基为1/2MS+IBA 1.0mg·L-1+ NAA 0.3mg·L-1+AC 0.5g·L-1。
关键词:垂花百合;花瓣;子房;花托;组织培养
中图分类号:Q943.1   文献标识码:A   文章编号:1001-0629(2012)12-1894-05

  百合(Liliumspp.)是世界著名的球根花卉,观
赏价值较高,培育高品质的新品种百合来满足日益
增长的市场需求已迫在眉睫。而野生种百合则是品
种选育的重要资源,野生种百合的微繁研究对于野
生资源的驯化及新品种选育和遗传性状的改良等都
极为重要[1-2]。垂花百合(L.cernum)在我国主要分
布于吉林省长白山地区,在百合属植物中属珍稀耐
寒野生种。利用组培再生的方法能够保证原种的优
良特性和较高的繁殖系数[3]。目前,百合离体培养
大部分以鳞片[4]作为外植体,也有以花丝[5]、花
药[6]、子房[7]、叶片[8]、胚等作为外植体取得成功的
报道。垂花百合具有良好的观赏性状,同时也是具
较强抗性的野生种,是百合抗性育种的重要亲本。
对垂花百合进行不定芽诱导及植株再生试验,发现
中部或内部鳞片基部再生频率较高,再生植株叶片
基部分化能力最强[9];对其鳞茎进行诱导,发现鳞茎
诱导最适宜的培养基为N6+0.05mg·L-1 IAA+
0.50mg·L-1 KT,鳞茎萌发为完整植株的最佳培
养基为N6+0.01mg·L-1IAA+0.001mg·L-1
NAA[10]。但鳞茎作为地下贮藏器官,极易携带病
菌,表面消毒后仍会不同程度地带菌,不利于种质
长期保存和规模化生产;而花器官为幼嫩器官,污
染小,同时研究花器官的离体培养也是对垂花百
合生物学特性的有益补充。为此,本研究比较不
同的激素配比条件下垂花百合花瓣、花托、子房愈
伤组织的诱导和分化能力,筛选不同的愈伤组织
诱导和分化效果最佳的培养基,以期为垂花百合
的基因工程和细胞工程育种研究及百合产业发展
提供有益参考。
1 材料与方法
1.1实验材料 选择来源于长白山地区生长健
壮、无病虫害的垂花百合未开放的花作为外植体,进
行花器官离体培养。
1.2实验方法 将垂花百合未开放的花蕾在洗衣
粉水中漂洗10min后,在流水下冲洗30min,在超
净工作台上用75%的无水乙醇消毒30s,然后用
2% NaClO消毒10min,再用无菌水冲洗4~5次。
用镊子和刀将花蕾分成花瓣、花托、子房3部分,接
种于添加不同浓度的6-苄基腺嘌呤(6-BA)和萘乙
酸(NAA)MS培养基中。每处理30个外植体,重复
3次。45d时统计愈伤组织诱导率,65d时统计愈
伤组织分化率。
诱导率=(诱导愈伤组织外植体数/接种外植体
数)×100%;
分化率=(分化成苗外植体数/诱导愈伤组织外
植体数)×100%[11]。
*收稿日期:2012-04-18  接受日期:2012-06-19
基金项目:黑龙江省自然科学基金(C201137);黑龙江省博士后科研启动金(LBH-Q09188)
作者简介:刘芳(1980-),女,黑龙江双城人,实验师,硕士,研究方向为园林植物种质资源。E-mail:byndyl12345@163.com
通信作者:周蕴薇 E-mail:yunwei_zhou@yahoo.com.cn
12/2012 草 业 科 学 (第29卷12期)
  将由花瓣诱导出的芽经增殖培养后,切成单株接
入添加不同生长激素的生根培养基中,生根培养基成
分为1/2MS+AC 0.5g·L-1附加不同浓度的吲哚丁
酸(IBA)及NAA。每处理30个外植体,各处理3次重
复。30d后统计生根情况。培养条件为(25±2)℃,光
强为3 000lx,光周期为光培养14h,暗培养10h。
2 结果与分析
2.1不同激素配比条件下花瓣愈伤组织诱导
及分化情况 不同培养基对花瓣愈伤组织的诱导
效果存在显著差异(表 1)。在 MS+6-BA 2.0
mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1激素组合的培养基
上,愈伤组织诱导及分化效果最好,诱导率可达
57.65%,分化率可达81.12%。当NAA浓度升高,
愈伤组织的诱导率及分化率相应提高,在NAA 0.1
mg·L-1水平上,花瓣未见愈伤组织形成,说明低浓
度NAA不利于诱导愈伤组织。随着6-BA浓度的
升高,愈伤组织分化成苗的分化率相应升高,说明较
高浓度的6-BA有利于愈伤组织进行分化。
表1 不同激素配比条件下花瓣愈伤组织诱导及分化情况
Table 1 Petals,ovary,and receptacle explants calus induction and differentiation of
Lilium cernumunder different hormone combinations
器官
Organ
浓度
Concentiation/
mg·L-1
6-BA  NAA
接种外植体数
Number of
explants
形成愈伤组织
的外植体数
Number of explants
forming calus
诱导率
Calus
induction rate/

分化成苗的
外植体数
Number of explants
of differentiated seedings
分化率
Differentiation
rate/%
花瓣
Petal
0.5  0.1  30  0d 0d 0d 0c
1.0  0.1  30  0d 0d 0d 0c
2.0  0.1  30  0d 0d 0d 0c
0.5  0.2  30  3.27±0.61c 10.37±0.02c 1.00±0.59c 30.19±0.15b
1.0  0.2  30  5.72±0.96bc  20.51±0.03bc  3.00±1.16bc  47.36±0.14ab
2.0  0.2  30  8.51±1.01bc  27.84±0.04bc  6.55±1.00b 76.67±0.04a
0.5  0.5  30  10.89±2.21b 36.27±0.06b 5.46±1.53bc  49.43±0.07ab
1.0  0.5  30  11.70±1.61b 38.39±0.05b 7.06±2.42b  61.33±0.14ab
2.0  0.5  30  16.91±2.80a 57.65±0.09a 12.20±1.54a 81.12±0.04a
子房
Ovary
0.5  0.1  30  0e 0e 0d 0b
1.0  0.1  30  1.04±0.60d 3.54±0.02d 0d 0b
2.0  0.1  30  0e 0e 0d 0b
0.5  0.2  30  1.00±0.60d 3.50±0.02d 0d 0b
1.0  0.2  30  3.00±0.63cd  10.50±0.02bcd  1.06±0.00c 36.11±0.08a
2.0  0.2  30  2.16±0.58d 6.98±0.02cd  1.06±0.00c 60.28±0.01a
0.5  0.5  30  5.41±1.10bc  17.50±0.04bc  2.11±0.59bc  42.86±0.17a
1.0  0.5  30  10.68±1.18a 35.22±0.04a 6.29±0.61a  61.11±0.21a
2.0  0.5  30  6.57±1.68b 21.00±0.05a 3.29±1.02b 46.83±0.07a
花托
Receptacle
0.5  0.1  30  0e 0e 0c 0b
1.0  0.1  30  2.12±0.60cd  6.67±0.02cd  0c 0b
2.0  0.1  30  1.06±0.00d 3.33±0.00d 0c 0b
0.5  0.2  30  3.06±0.60cd  10.00±0.02cd  1.04±0.00b 36.11±0.08a
1.0  0.2  30  11.92±1.62a 36.67±0.05a 5.31±1.23a  44.34±0.05a
2.0  0.2  30  4.10±1.18c 13.33±0.04c 1.04±0.61b 19.44±0.11a
0.5  0.5  30  2.05±0.60cd  6.67±0.02cd  1.06±0.61b  38.89±0.22a
1.0  0.5  30  7.06±1.24b 23.33±0.03b 3.20±0.61ab  42.43±0.02a
2.0  0.5  30  1.02±0.00d 3.33±0.00d 0c 0b
注:同一列不同小写字母代表0.05水平上存在显著差异。
Note:Different lower case letters within the same column for the same organ mean significant difference at 0.05levels.
5981
PRATACULTURAL SCIENCE(Vol.29,No.12) 12/2012
2.2不同激素配比条件下子房愈伤组织诱导
及分化情况 在 MS+6-BA 1.0mg·L-1+
NAA 0.5mg·L-1激素组合的培养基上,子房愈伤
组织诱导及分化效果最好,诱导率可达35.22%,分
化率可达61.11%(表1)。并且随 NAA浓度的升
高,愈伤组织的诱导率及分化率也相应提高,高浓度
NAA与低浓度 NAA的培养基对子房诱导愈伤组
织的效果存在显著差异;随着6-BA浓度升高,愈伤
组织的诱导率先上升后下降。
2.3不同激素配比条件下花托愈伤组织诱导
及分化情况 在 MS+6-BA 1.0mg·L-1+
NAA 0.2mg·L-1的激素组合的培养基上花托愈
伤组织诱导及分化情况最好,诱导率可达36.67%,
分化率可达44.34%。在 NAA 0.2mg·L-1与不
同浓度的6-BA的培养基中,花托愈伤组织诱导效
果差异明显(表1)。当NAA浓度增加时,愈伤组织
诱导率及分化率先增加后减少;随着6-BA浓度的
升高,愈伤组织的诱导率先上升后下降。由此可知,
花托诱导愈伤组织时,6-BA和NAA的浓度均不宜
过高也不宜过低。
2.4百合花器官愈伤组织诱导及分化的比较
2.4.1不同花器官外植体愈伤组织诱导及分化的比
较 垂花百合的花器官在离体培养过程中愈伤组织
的诱导及分化的时间较长,外植体诱导愈伤组织由
易到难依次为花瓣>花托>子房(图1)。
花瓣的分化率明显高于其他部位,且分化所需
时间最短。接种3d后花瓣颜色明显变深呈粉色
(图1A);20d后部分花瓣切口处开始膨大,沟壑变
明显,花瓣颜色变浅,35d后开始形成绿色愈伤组
织,40d开始形成不定芽(图2B);55d后每个外植
体上平均分化出芽4.8个,最多达14个(图1C)。
  子房的诱导率和分化率次之,且时间较花瓣长。
接种2d后子房明显膨大,颜色变成黄绿色(图
1D);40d时继续膨大,颜色变为绿色,部分子房切
口处产生带有绒毛的白色根状物(图1E);60d后开
始形成愈伤组织,65d后开始形成不定芽(图1F)。
花托的愈伤组织诱导和分化的能力介于花瓣和
子房之间,所需时间较花瓣长,较子房短。接种3d
后,花托明显膨大,表面变粗糙,颜色变为淡黄绿色
(图1G);45d后开始形成愈伤组织,并且产生带有
绒毛的白色根状物(图1H);60d后白色根状物也
形成愈伤组织并产生不定芽(图1I)。
2.4.2不同激素组合对花器官愈伤组织诱导及分化
的比较 在百合组培苗诱导过程中,适量添加NAA
对愈伤组织诱导及分化有明显的促进作用。6-BA
能诱导不定芽的产生,使其大量增殖,如果6-BA浓
度过高,同样也会诱导部分外植体产生大量的不定
根,从而抑制不定芽的形成,抽叶多,植株不能健壮
生长和发育[12]。本研究中,花瓣、子房、花托3种外
植体对低浓度的6-BA、NAA都不敏感,诱导花瓣愈
伤组织及分化的培养基中6-BA、NAA浓度都很高,
不同外植体诱导愈伤组织对激素配比浓度需求不
同,诱导愈伤组织及分化效果也有差异。这种差异
可能是由于百合品种及外植体的不同导致的。
2.5生根与移栽 将分成单株的小苗接于含有
0.5g·L-1活性炭,附加不同生长激素浓度的1/2
MS生根培养基中。结果表明,由花瓣诱导的小苗
在1/2 MS+IBA 1.0 mg·L-1 + NAA 0.3
mg·L-1+AC 0.5g·L-1的生根培养基中生根率
最高达71.11%,平均根长达2.03cm(表2)。随着
IBA浓度的增加,垂花百合的生根率也升高。在本
研究中,活性炭的加入有利于垂花百合的生根,使根
的长度增加,长势变壮(图1J)。将根长2~4cm的
小苗炼苗3d,然后移栽至已灭菌的蛭石中,浸透水
后放入人工气候箱内缓苗,15d后移到温室。移栽
后的小苗生长良好,成活率可达80%(图1K)。方
差分析表明,不同浓度激素组合的培养基对百合生
根率及根长的影响均有不同程度的差异。
3 讨论
在百合的组织培养研究中,许多器官、组织都可
以用作外植体,其中以鳞片作外植体的频率最高,但
鳞片取材对母本伤害大,且消毒处理难度大、易污
染[4,10],未授粉的花器官培养和人工授粉后的花器
官培养对培育百合新品种和保持母本优良特性有重
大研究意义。
  本研究对垂花百合花器官(花瓣、花丝、花药、花
柱、子房、花托、花梗)进行了离体培养,其中花丝、花
柱、花梗开始时膨大,形成愈伤组织,但后期大量褐
化死亡,只有花丝在 MS+6-BA 2.0mg·L-1+
NAA 0.5mg·L-1培养基上有两个分化不定芽,花
药在培养期间未能形成愈伤组织及分化,表明垂花
百合诱导愈伤组织由易到难依次为花瓣>花托>子
6981
12/2012 草 业 科 学 (第29卷12期)
图1 垂花百合花器官外植体愈伤组织诱导及分化
Fig.1 Floral organ explant calus induction and differentiation of Lilium cernum
表2 不同激素组合对垂花百合生根的影响
Table 2 Effects of different hormone combinations on rooting of Lilium cernum
浓度Concentiation/mg·L-1
6-BA  NAA
转接苗/株
Number of shoot
生根苗数/株
Number of root
生根率
Rooting rate/%
平均根长
Root length/cm
0.3  0.3  30  7.31±1.03c 23.33±0.04c 0.98±0.10c
0.5  0.5  30  18.07±2.7ab  56.67±0.09ab  1.00±0.11c
1.0  0.3  30  22.78±1.45a 71.11±0.05a 2.03±0.05a
0.3  0.5  30  11.87±0.59c 36.67±0.02c 1.94±0.17a
0.5  0.3  30  10.83±0.71c 33.33±0.02c 1.47±0.11b
1.0  0.5  30  16.58±1.59b 53.33±0.05b 1.74±0.13ab
7981
PRATACULTURAL SCIENCE(Vol.29,No.12) 12/2012
房,但亚洲百合‘米丽拉’花器官组织培养再生植株
不同部位的分化率从高到低依次为花丝、花柱、子
房、花托、花瓣、花药[13],这可能是由供试品种的差
异性导致的。
植物生长调节剂在组织培养中发挥着重要的作
用,在含量极低时就可以影响植物细胞的分裂、分
化,以及植物体的生长、发育、形态建成等许多生理
生化过程。研究表明,NAA对外植体愈伤组织诱
导与分化起到一定的作用,较低浓度的 NAA不利
于诱导愈伤组织。这一结果与刘丽敏等[14]在百合
花器官的组织培养中的结果一致,适宜浓度的NAA
有利于百合花器官的初代诱导。
参考文献
[1] Loffler H J M,Merjer H,Straathof T P.Segregation of
Fusariumresistance in an interspecific cross between
Lilium longiflorum and Lilium dauricum[J].Acta
Horticulturae,1996,414:203-208.
[2] 洪波.百合花卉的研究综述[J].东北林业大学学报,
2000,28(2):68-70.
[3] 王晓丽,韩立群,刘杰,等.活性炭和多效唑对垂花百合
试管鳞茎膨大的影响 [J].安 徽 农 业 科 学,2011,
39(19):11429-11430.
[4] 景艳莉,周蕴薇,张金玉,等.精粹百合的组织培养与快
速繁殖技术[J].东北林业大学,2006,34(6):46-47.
[5] 虞泓,陆永武,程治英.大百合的离体快繁和鳞茎的诱
导[J].植物生理学通讯,2005,41(2):192.
[6] 褚云霞,陈龙清,黄燕文,等.百合的花药培养研究[J].
园艺学报,2001,28(5):472-474.
[7] 李守丽,石雷,张金政,等.大百合子房的离体培养[J].
园艺学报,2007,34(1):197-200.
[8] Bacchetta L,Remotti P C,Bernardini C,et al.Adventi-
tious shoot regeneration from leaf explants and stem
nodes of Lilium[J].Plant Cel,Tissue and Organ Cul-
ture,2003,74:37-44.
[9] 李海云,王中伟,刘艳芝,等.松叶百合的组织培养及其
植株再生[A].中国球根花卉年报2008[C].北京:中国
园艺学会球根花卉分会2008年会暨球根花卉产业发
展研讨会,2008:160-164.
[10] 顾地周,赵淑玲,郭伟,等.条叶百合和垂花百合高效
快繁体系的建立[J].福建农林大学学报(自然科学
版),2009,38(3):243-247.
[11] 邢桂梅,毕晓颖,雷家军.君子兰花器官离体培养[J].
园艺学报,2007,34(6):1563-1568.
[12] 葛蓓孛,杨青杰,吴萍,等.细叶百合组织培养植株再
生[J].东北林业大学学报,2010,38(5):54-59.
[13] 姚绍嫦,杨美纯,凌征柱.亚洲百合花器官组织培养再
生植株研究[J].安徽农业科学,2010,38(7):3459-
3460.
[14] 刘丽敏,卢赛清,陈燕霞,等.百合花器官的组织培养
[J].广西农业科学,2007,38(3):219-222.
In vitro culture of floral organ of Lilium cernum
LIU Fang1,2,WANG Xiao-li 1,3,ZHANG Yan-ni 1,YANG Qing-jie1,ZHOU Yun-wei 1
(1.Colege of Landscape Architecture,Northeast Forestry University,Harbin 150040,China,
2.Colege of Agriculture,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319,China,
3.The hulunbuir sericultural science research institute,Hulunbuir 162650,China)
Abstract:The petal,ovary and receptacle of Lilium cernumwere used as explants for in vitro culture.The
results showed that the rates of calus induction and differentiation of three kinds of floral organ explants
were different.The petals had the highest calus induction and differentiation rates,with 57.65%and
81.12%,respectively.The order from easy to difficult of calus induction was petal>receptacle>ovary.
The optimum medium for petal explants calus induction and diferentiation was MS+6-BA 2.0mg·L-1+NAA
0.5mg·L-1.The optimum medium for ovary explants calus induction and differentiation was MS+6-BA
1.0mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1.The optimum medium for receptqacle explants calus induction and
differentiation was MS+6-BA 1.0mg·L-1+NAA 0.2mg·L-1.The optimum medium for rooting was
1/2MS+IBA 1.0mg·L-1+NAA 0.3mg·L-1+AC 0.5g·L-1.
Key words:Lilium cernum;petal;ovary;receptacle;tissue culture
Corresponding author:ZHOU Yun-wei E-mail:yunwei_zhou@yahoo.com.cn
8981