全 文 ：TC及 FFA的代谢异常 ,提示纠正血脂代谢紊乱可能
是西洋参改善 IR的作用机制之一。
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独角莲乙醇提取物体外抗肿瘤实验研究
段玉敏 ,刘书鑫 ,张洪娟＊ ,谷长秀
(黑龙江省中医研究院 ,黑龙江 哈尔滨 150036)
摘　要:目的:通过独角莲 20%乙醇提取物对人胃腺癌 MGC-803、肝癌 Hep-2、肺癌 A549、乳腺癌
MCF-7细胞杀伤率 、半数抑制浓度的测定 ,确定对独角莲 20%乙醇提取物的最佳敏感瘤株并通过透射
电镜观察药物作用后该肿瘤细胞形态的变化。方法:1.采用体外细胞培养技术用 MTT法 ,检测药物对
各肿瘤细胞的生长抑制作用。 2.透射电镜观察药物作用 96h的肿瘤细胞形态 。结果:独角莲 20%乙醇
提取物对胃癌 MGC-803、肝癌 Hep-2、肺癌 A549、乳腺癌 MCF-7细胞的生长有抑制作用 ,与细胞作
用 72h时的 IC50分别为 (74.14 ±5.29)mg/mL、(81.61 ±6.14)mg/mL、(128.26 ±11.43)mg/mL、
(120.26±9.46)mg/mL,与细胞作用 48h时的 IC50分别为(94.55±6.85)mg/mL、(108.94±8.69)mg/
mL、(187.78±9.87)mg/mL、(280.54±14.51)mg/mL;透射电镜观察结果表明独角莲 20%乙醇提取物
能使 MGC-803细胞发生凋亡。结论:独角莲 20%乙醇提取物对胃癌 MGC-803瘤株最敏感且可使该
瘤细胞发生凋亡 。
关键词:独角莲;半数抑制浓度;细胞杀伤率;MTT
中图分类号:R285.5　　　文献标识码:A　　　文章编号:1002-2392(2010)03-0020-04
收稿日期:2010-01-06　　修回日期:2010-01-20
基金项目:黑龙江省科技厅自然科技基金(200669)
作者简介:段玉敏(1974-), 女 , 助理研究员 , 主要从事中药抗肿瘤
研究。
＊通讯作者:张洪娟(1962-),女 ,教授 ,硕士研究生导师。
　　独角莲(TyphoniumgiganteumEngl)为天南星科植
物 ,是一种清热解毒中草药 ,在中医临床中已被广泛应
用于治疗多种恶性肿瘤疾病 [ 1, 2] ,且疗效较好 。药理
实验证明该药具有抗结核和消炎作用 。近年来研究表
明该药水煎液具有抗肿瘤作用[ 3] ,动物模型研究表明
独角莲可明显抑制肿瘤生长 [ 4] 。本研究所用独角莲
20%乙醇提取物 S180动物模型实验已得到较好的抑
瘤效果 。本实验研究目的在于验证该药具有明显的细
胞毒作用和筛选出对独角莲最敏感的人癌细胞株 ,为
临床筛选真正切实有效 、作用明确抗肿瘤新药提供科
学的理论依据。
1　实验材料
受试药物　独角莲 20%乙醇提取物由黑龙江省
中医研究院中药所提供。
试剂与药品 RPMI-1640细胞培养基干粉　美国
GIBCO公司产品
胰蛋白酶　购于晶美深圳分公司
胎牛血清　购于晶美深圳分公司
噻唑蓝(MTT)　美国 Sigma公司
二甲基亚砜(DMSO)　美国 Sigma公司
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2　方法与结果
2.1　MTT法测定独角莲 20%乙醇提取物对胃腺癌
MGC-803、肝癌 Hep-2、肺癌 A549、乳腺癌 MCF-7
细胞的生长抑制作用将单层贴壁且呈对数生长期的胃
癌 MGC-803、肝癌 Hep-2、肺癌 A549、乳腺癌MCF-
7细胞 ,用 0.25%Trypsine-0.02%EDTA消化液消化
后 ,用含 10%胎牛血清的 RPMI-1640培养基稀释成
单细胞悬液 ,根据不同细胞生长速率 ,调细胞浓度 1 ～
3×104个 /mL,将上述细胞悬液加入 96孔细胞培养板
中 , 100ul/孔 ,将培养板移入 CO2培养箱中 ,在 37℃、
5% CO2及饱和湿度条件下培养 24h后加入不同浓度
的受试药物 100μL/孔 ,每个浓度设 3个平行孔 ,另设
空白对照组 ,分别培养 48h和 72h后弃上清液 ,每孔加
入 50μL新鲜配制的含 0.2mg/mLMTT无血清培养液 ,
37℃继 续 孵 育 4h。 小 心 弃 上 清 液 , 并 加 入
150μLDMSO,轻轻震荡使结晶溶解 ,选择 570nm波长
在酶标仪上测定各孔光密度(OD)值 。以每组 3个孔
的平均值作为各孔的平均 OD值 ,根据下列公式计算
20%乙醇提取物对各肿瘤细胞的生长抑制率(GIR),
并由 Origin软件求出半数抑制浓度(IC50)。实验结果
见表 1、2、3、4。
GIR=(1-实验组 OD/对照组 OD)×100%
表 1　独角莲 20%醇提取液对人胃腺癌 MGC-803细胞的细胞毒作用
组别 剂量(ug/ml) 72h 48h
OD GIR IC50 OD GIR IC50
空白组 - 0.426±0.036 - 0.382±0.029 -
独提液 200.0 0.142±0.011＊ 66.7 0.152±0.016＊ 60.2
100.0 0.187±0.009＊ 56.1 0.189±0.031＊ 50.5
50.0 0.241±0.014＊ 43.4 74.14±5.29 0.223±0.027＊ 41.6 94.55±6.85
25.0 0.287±0.023 32.6 0.275±0.036 28.0
12.5 0.324±0.017 23.9 0.317±0.022 17.0
喜树碱 10.0 0.058±0.005＊ 86.4 0.071±0.009＊ 81.4
5.0 0.104±0.004＊ 75.6 1.58±0.21 0.114±0.013＊ 70.2 1.83±0.32
2.5 0.170±0.018＊ 60.2 0.151±0.017＊ 56.3
1.25 0.239±0.020＊ 43.8 0.204±0.024＊ 41.2
　　注:＊与空白对照组比较 , P<0.05。
表 2　独角莲 20%醇提取液对 Hep-2肿瘤细胞的细胞毒作用
组别 剂量(ug/ml) 72h 48h
OD GIR IC50 OD GIR IC50
空白组 - 0.625±0.027 - 0.564±0.029 -
独提液 200.0 0.242±0.013＊ 61.3 0.237±0.016＊ 57.8
100.0 0.285±0.010＊ 54.4 0.287±0.031＊ 49.1
50.0 0.367±0.017＊ 41.3 81.61±6.14 0.343±0.027＊ 39.2 108.94±8.69
25.0 0.438±0.032 29.9 0.431±0.036 23.6
12.5 0.552±0.025 11.7 0.504±0.022 10.6
喜树碱 10.0 0.125±0.007＊ 80.0 0.140±0.009＊ 75.2
5.0 0.193±0.006＊ 69.2 1.98±0.32 0.217±0.013＊ 61.6 2.51±0.29
2.5 0.290±0.012＊ 53.6 0.279±0.017＊ 50.5
1.25 0.371±0.024＊ 40.7 0.349±0.024＊ 38.2
注:＊与空白对照组比较 , P<0.05。
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表 3　独角莲 20%醇提取液对 A549细胞的细胞毒作用
组别 剂量(ug/ml) 72h 48h
OD GIR IC50 OD GIR IC50
空白组 - 0.431±0.016 - 0.385±0.019 -
独提液 200.0 0.189±0.012＊ 56.1 0.192±0.022＊ 50.1
100.0 0.223±0.023＊ 48.3 0.225±0.027＊ 41.6
50.0 0.284±0.035＊ 34.1 128.26±11.43 0.271±0.034 29.6 187.78±9.87
25.0 0.335±0.014 22.3 0.315±0.041 18.2
12.5 0.351±0.027 18.6 0.342±0.011 11.2
喜树碱 10.0 0.127±0.012＊ 70.5 0.141±0.011＊ 63.4
5.0 0.163±0.014＊ 62.2 2.19±0.21 0.182±0.017＊ 52.6 4.47±0.52
2.5 0.208±0.026＊ 52.2 0.224±0.009＊ 41.7
1.25 0.263±0.018＊ 39.0 0.244±0.021＊ 36.5
注:＊与空白对照组比较 , P<0.05。
表 4　独角莲 20%醇提取液对 MCF-7细胞的细胞毒作用
组别 剂量(ug/ml) 72h 48h
OD GIR IC50 OD GIR IC50
空白组 - 0.317±0.031 - 0.276±0.024 -
独提液 200.0 0.148±0.022＊ 53.3 0.143±0.015＊ 48.2
100.0 0.159±0.028＊ 49.8 0.159±0.029＊ 42.4
50.0 0.186±0.019＊ 41.3 120.26±9.46 0.172±0.026＊ 37.7 280.54±14.51
25.0 0.211±0.017 33.4 0.191±0.013 30.8
12.5 0.246±0.031 22.4 0.231±0.029 16.3
喜树碱 10.0 0.036±0.008＊ 88.6 0.052±0.005＊ 81.3
5.0 0.074±0.017＊ 76.5 1.34±0.19 0.079±0.011＊ 71.2 1.63±0.22
2.5 0.113±0.019＊ 64.3 0.111±0.012＊ 59.7
1.25 0.164±0.025＊ 48.2 0.159±0.018＊ 42.5
　　注:＊与空白对照组比较 , P<0.05。
　　结果显示 ,独角莲 20%乙醇提取物对 4类肿瘤细
胞株的生长有抑制作用 ,并与受试药物的浓度有关。
当提取物浓度较低(25.0μg/mL)时 ,药物对肿瘤细胞
作用不明显 ,与对照组比较无显著性差异。随着药物
浓度升高 ,药物对肿瘤细胞的抑制杀伤越来越明显 ,与
对照组比较无显著性差异 P<0.05。其中药物对胃癌
MGC-803细胞株较为敏感 。
2.2　透射电镜观察独角莲 20%乙醇提取物对胃癌
MGC-803细胞形态的影响
将 MGC-803细胞经不同浓度的独角莲 20%乙
醇提取物处理 96h, 0.25%胰酶消化后 ,磷酸缓冲液洗
涤弃上清。收集细胞 4℃条件下用 2.5%戊二醛固定 ,
二甲砷酸钠缓冲液冲洗(pH7.2)3次 , 1%锇酸固定 2
小时 ,双蒸水冲洗 3次 ,酒精脱水:50%酒精 10分钟 ,
70%酒精过夜 , 90%酒精 10分钟 , 100%酒精 2次各
15min,置换:环氧丙烷 2次 ,各 15min(室温),环氧丙
烷:树脂(1∶1)1h(室温),环氧丙烷:树脂(1∶4)1h,
纯树脂浸透 2h,环氧树脂 Epon812包埋 ,聚合:35℃
16h, 45℃8h, 55℃14h, 60℃48h,超薄切片:醋酸双氧
铀 ,枸橼酸铅染色 ,透射电镜观察 。实验结果见图 1 ～ 4。
图 1　空白对照组
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图 2　200mg/mL20%乙醇提取物组
图 3　100mg/mL20%乙醇提取物组
图 4　50mg/mL20%乙醇提取物组
透射电镜实验结果表明空白对照组胃癌肿瘤细胞
呈高度分裂状态 ,表面绒毛增加 ,伸出尾足样突起见图
1;独角莲 20%乙醇提取物 200mg/mL作用后的肿瘤
细胞表面绒毛消失 ,核固缩形成溶解状脱落到胞浆中
见图 2;100mg/mL作用后的肿瘤细胞核模消失 ,可见
到凋亡小体见图 3;50mg/mL作用后的肿瘤细胞核固
缩 ,细胞器消失 ,胞质被大量高密度颗粒填充见图 4。
3　讨论
目前随着分子肿瘤学研究的深入 ,抗肿瘤天然药
物研发过程中体外抗肿瘤实验已成为必不可少的一部
分 [ 5] 。四甲基偶氮唑盐法(MTT法)是建立于 20世纪
80年代初的一种测定细胞存活和增殖能力的四甲基
偶氮唑盐比色法 ,该方法快速简便现已被广泛用于体
外肿瘤药敏的测定 [ 6] 。用 MTT法体外研究独角莲
20%乙醇提取物对不同来源 、不同生长特性的细胞株
的作用 ,得到独角莲 20%乙醇提取物对人胃癌细胞株
(MGC-803)、肝癌细胞株 (Hep-2)、肺癌细胞株
(A549)、乳腺癌细胞株(MCF-7)体外均有非常好的
抑制作用 ,并且对肿瘤细胞毒性呈剂量依赖关系 ,其中
对胃癌细胞株和肝癌细胞株作用最强 , 抑制率高于
60%,表明独角莲 20%乙醇提取物可应用于消化系统
肿瘤的治疗 ,同时也为体内裸鼠抑瘤实验确定最佳瘤
株 ,为独角莲抗肿瘤作用新药开发提供依据。
文献报道独角莲具有诱导多种肿瘤细胞株凋亡的
作用 ,并具有时间及剂量依赖性一致 [ 2] 。目前诱导肿
瘤细胞的凋亡是肿瘤治疗研究中的主要目标与手
段 [ 7] 。凋亡和坏死是细胞死亡的两种方式 。凋亡是
受基因调控 、细胞主动参与且自身有一定程序的生理
性死亡过程 ,又称程序性细胞死亡或细胞自杀。坏死
是外界损伤因素直接破坏细胞的生物膜和能量代谢 ,
导致细胞生命的被动中断 ,形态学的改变是判断凋亡
或坏死的主要依据 [ 8] 。在细胞凋亡过程中 ,细胞发生
特征性形态学事件(核固缩 , 膜皱缩 ,染色质浓缩边
集 ,产生凋亡小体)和生化事件(DNA片断化断裂)。
细胞凋亡的发生往往是被阻滞在细胞周期的某一时
期 ,然后发生凋亡 [ 9] 。本实验通过透射电镜观察独角
莲 20%乙醇提取物作用 MGC-803肿瘤细胞 96小时
后 ,细胞核发生固缩 , 并可见凋亡小体 ,提示独角莲
20%乙醇提取物对肿瘤细胞有诱导凋亡作用 ,其对相
关凋亡基因作用通路有待于进一步研究。
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