全 文 ：龙舌兰麻， 是龙舌兰科（Agavaceae）所属单子
叶植物的统称， 俗称剑麻， 是中国乃至全球热区最
重要的麻类经济作物。 龙舌兰科植物在全世界共有
21 个属约 670 个种[1]， 主要分布于美洲、 非洲、 亚
洲、 太平洋以及大西洋、 印度洋的一些岛屿。 中国
目前保存下来的有 4 属 40 多份种质， 有些是从国
外引进的。 近 40 a 来， 中国种植的剑麻当家品种
为 H.11648（Agave hybrid No.11648） ， 此品种虽
然高产， 但不抗斑马纹病（Phytophthora nicotianae
Breda.）， 造成幼苗期大量缺株， 产量大幅降低，
严重影响剑麻生产的发展， 而且早花、 早衰现象愈
来愈明显。 据剑麻种植区的开花调查结果表明， 剑
麻早花植株占到 20％以上， 而且纤维抽出率有逐
年下降的趋势， 严重影响到剑麻的高产稳产 [2]。 种
种迹象表明， H.11648 的正常生长正面临着严重威
胁， 单一品种所具潜在的风险已经显露， 培育抗病
剑麻新品种已成当务之急。 目前对剑麻亲缘关系及
遗传多样性的研究较少， 给剑麻育种工作带来困
难， 妨碍了剑麻种质资源的发掘和利用。
AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）
技术对植物种质资源鉴定非常灵敏， 能检测分辨出
很小的种质遗传差异， 可从分子水平上准确地开展
种质资源遗传多样性分析。 荧光 AFLP 是 AFLP 的
改进方法， 其在选择性扩增引物的 5′端标记了荧
热带作物学报 2011， 32 （1）： 105-109
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期： 2010-08-17 修回日期： 2010-10-18
基金项目： 中央级公益性科研院所基本科研业务费项目（No. ITBBZD0828， ITBBZD0827）； 农业部 “948” 项目（No. 2010-Z6）； 海南省自
然科学基金项目（No. 80510）； 国家支撑计划项目（No. 2007BAD48B06-05）。
作者简介： 张世清（1974年—）， 男， 在读博士。 研究方向： 剑麻分子遗传育种。 *通讯作者： 易克贤， E-mail： yikexian@21cn.com。
中国剑麻种质资源的 AFLP分析
张世清 1，2， 郭朝铭 1， 高建明 1， 陈河龙 1， 郑金龙 1， 刘巧莲 1， 易克贤 1*
1 中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物技术重点开放实验室 海南海口 570208
2 海南大学农学院， 海南海口 570208
摘 要 利用荧光标记 AFLP 技术研究剑麻种质遗传多样性及亲缘关系。 筛选 8 个多态性高、 分辨力强的 Pst I
/Mse I 引物组合对 40 份供试材料的基因组 DNA 扩增， 共获得条带数 785 条， 多态性条带数 507 条， 扩增效率
64.58％， 平均每对引物扩增条带数 98.13 条。 其中， 以 P-GAC/ M-CAC 引物的扩增效率最高， 达到 78.63％；
其次是 P-GTG/M-CTC， 达到 71.28％； 扩增效率最低的引物是 P-GTA/M-CTT， 为 52.94％。 表明供试材料在
DNA 水平上， 酶切位点的分布存在广泛的变异。 各供试材料相似系数介于 0.44～0.83， 在相似系数 0.51 处可将
40 份种质划分为 4 大类。 8 组引物在 40 份供试材料中检测到数目不等的特异带型， 这些特异带型对供试剑麻种
质具有一定的鉴别价值。
关键词 剑麻； AFLP； 遗传多样性； 亲缘关系
中图分类号 S563.8 文献标识码 A
AFLP Analysis of Sisal Varieties in China
ZHANG Shiqing1,2, GUO Chaoming1, GAO Jianming1, CHEN Helong1
ZHEN Jinlong1, LIU Qiaolian1, YI Kexian1
1 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural SciencesKey Laboratory of Tropical Crop Biotechnology, Ministry of Agriculture Haikou, Hainan 571101, China
2 College of Agronomy, Hainan University, Haikou, Hainan 570208, China
Abstract The genetic diversity and relationship of si sal were analyzed by fluorescent AFLP technology. AFLP
fingerprinting of 40 accessions with eight pairs of Pst I/Mse I primers revealed a total number of 785 unambiguous
bands including 507 polymorphic bands, and the polymorphism frequency was 64.58％ . Each pair of primers
produced 98.13 polymorphic bands on average. The primer P-GAC/M-CAC had the highest polymorphism frequency
（ 78.63％ ）, followed by the primer P -GTG/M -CTC （71.28％ ）. The primer P -GTA/M -CTT had the least
polymorphism frequency（52.94％）. These show there are abundant diversities about enzyme digestion sites in the
accessions. The similarity coefficient of the 40 accessions ranged from 0.44 to 0.83. The 40 accessions were
divided into 4 groups at the similarity coefficient of 0.51. Moreover, some specific bands were detected from the
40 accessions by using 8 pairs of primers, and could be used to distinguish the accessions under test.
Key words Sisal； AFLP； Genetic diversity； Relationship.
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2011.01.022
第 32 卷热 带 作 物 学 报
编号 种质或品种名称 学名 产地 资源类型
1 弧叶龙舌兰 A.attenuata 中美洲 野生种
2 金边弧叶龙舌兰 A.attenuata var. 中美洲 野生种
3 假菠萝麻 A.angustifolia Hew 墨西哥 野生种
4 银边假菠萝麻 A.angustifolla Haw.var.marginata Frel. 墨西哥 野生种
5 多叶普通剑麻 A. sisalana Perrine var.Yuexi 中国 选育品种
6 东 2 号 A.hybrid No.487 东非洲 选育品种
7 番麻 A.americana.L 中美洲 野生种
8 灰叶剑麻 A.fourcroydes Lem. 墨西哥 野生种
9 H.11648 A.hybrid No.11648 东非洲 选育品种
10 东 26 不详 中国 选育品种
11 桂幅 4 号 A. hybrid No.11648radation Guang xi No.4 中国 选育品种
12 假 7 不详 不详 不详
13 南亚 1 号 A.hybrid nanya NO.1 中国 选育品种
14 南亚 2 号 A.hybrid nanya NO.2 中国 选育品种
15 蓝剑麻 A. amaniensis 东非洲 野生种
16 粤西 114 A.hybrid Yuexi No.114 中国 选育品种
17 普通剑麻 A. sisalana Perrine 中美洲 野生种
18 粤西 75 号 A.hybrid Yuexi No.75 中国 选育品种
19 马盖麻 A.cantala Roxb. 东印度 野生种
20 东 16 A.hybridDongfang hong No.16 中国 选育品种
21 广西 76416 A.hybrid 76416 中国 选育品种
22 东 368 A. hybrid D.h.No.368 中国 选育品种
23 粤西 117 A.hybrid Yuexi No.117 中国 选育品种
24 东 292 不详 中国 选育品种
25 东 74 A.Potalorum var.a.h ‘DongfanghongNo.74’ 中国 选育品种
26 东 109 A.Potalorum Var.a.h ‘Dongfang hong No.109 中国 选育品种
27 雷神 A.potatorum Zucc.var.verschaffeltii Bgr. 墨西哥 地方品种
28 金边番麻 A.americana var.marginata Frel 中美洲 野生种
29 金边东 1 号 不详 中国 选育品种
30 小刺番麻 A.americana L.var. 中美洲 野生种
31 墨引 1 不详 墨西哥 不详
32 墨引 2 不详 墨西哥 不详
33 墨引 4 不详 墨西哥 不详
34 墨引 5 不详 墨西哥 不详
35 墨引 6 不详 墨西哥 不详
36 墨引 7 不详 墨西哥 不详
37 墨引 8 不详 墨西哥 不详
38 墨引 10 不详 墨西哥 不详
39 墨引 11 不详 墨西哥 不详
40 墨引 12 不详 墨西哥 不详
表 1 材料及来源
光物质， 在测序仪上电泳时， 激发的荧光能被测序
仪自动收集生成图像， 具有数据收集自动化、 定量
化、 灵敏性更好、 速度更快、 效率更高等优点 [3]。
本文旨在利用荧光 AFLP 技术， 对中国现存的 40
份剑麻种质进行遗传多样性研究， 从分子水平确定
它们的遗传类型， 为找到最适合的杂交亲本进行杂
交或细胞融合， 以培育出抗病剑麻新品种。
1 材料与方法
1.1 材料
40 份剑麻种质取自中国热带农业科学院南亚
热带作物研究所剑麻种质资源圃（表 1）。
106- -
第 1 期
1.2 方法
1.2.1 DNA 的分离 采用改进的 CTAB 法[4-5]从剑
麻幼叶中提取总 DNA。
1.2.2 AFLP 分析 选用北京鼎国生物技术公司
FISH-AFLP试剂盒（Pst I/Mse I 型）， 实验参照 Vos
等[6]的程序。 各样品基因组 DNA的酶切和接头的连
接在同一反应中进行。 在 20 μL 反应体系中含有
DNA 模板 4 μL（50 ng/L）， Pst I和 Mse I 接头 1 μL，
Pst I（4 U/μL）和Mse I（4 U/μL）2 μL， 10×Reaction
buffer 2.5 μL， 10 mmol/LATP 2.5 μL， T4 Ligase
（3 U/μL）1 μL， 超纯水 7 μL。 将上述混合液混匀
离心数秒。 37℃保温 5 h， 8℃保温 4 h， 4℃过夜。
预扩增反应： 用预扩增引物组合进行预扩增。
反应体系为 25 μL。 含酶切-连接产物 2 μL， Pst I
和 Mse I 预扩增引物 1 μL， dNTPs1 μL， 10×PCR
buffer 2.5 μL， Taq DNA 聚合酶 （2 U/μL）0.5 μL，
超纯水 18 μL。 预扩增反应程序为： 94 ℃预变性
2 min， 94 ℃变性 30 s， 56 ℃复性 30 s， 72 ℃延伸
80 s， 循环 30 次， 72 ℃延伸 5 min。 预扩增产物稀
释 20倍， -20℃保存备用。
选择性扩增反应： 用荧光标记的经过筛选的 8
对引物（表2）进行正式选择性扩增。 其中 Mse I 引
物的 5端用荧光染料进行标记， 反应体系为 25 μL。
含预扩增产物稀释（1 ∶ 20）后的 DNA 样品 2 μL， 10
×PCR buffer 2.5 μL， dNTPs 0.5 μL， Pst I 引物（5
ng/μL）1 μL， Mse I 引物 （30 ng/μL）1 μL， Taq 酶
（2 U/μL）0.5 μL， 超纯水 17.5 μL。 选择性扩增
PCR扩增程序为： 94℃ 30 s ， 65 ℃ （以后每轮循
环温度递减 0.7 ℃） 30 s， 72 ℃ 80 s， 扩增 12 轮；
然后 94 ℃ 30 min ， 55 ℃ 30 s， 72 ℃ 80 s， 再进
行 23个循环。
1.2.3 数据处理 用计算机 GeneScan 软件自动收
集数据， 用 Binthere 软件转换数据成 Excel 格式，
用 NTSYS-pc2.11f软件进行数据分析。 对原始矩阵
用 SimQual 程序求 Dice 相似系数矩阵， 并获得相
似系数。 用 SHAN 程序中的 UPGMA（非加权算术
平均法）方法进行聚类分析， 并通过 Tree plot 模块
生成聚类图。
2 结果与分析
2.1 AFLP多态性
用 8 对引物对 40 份剑麻种质进行了鉴别， 每
对引物都产生了清晰的 AFLP 指纹， 并且能够用于
区分 40 个品种， 其中引物组合 Pst I-GAG/Mse I-
CAG 形成的 AFLP 谱带效果如图 1。 8 对引物共产
生 785 条带， 其中多态性带数 507， 占总带数的
64.58％， 具体见表 2。
2.2 供试龙舌兰麻种质遗传类型的划分
根据 40 份剑麻种质材料 Dice 相似系数， 应用
UPGMA 法进行聚类， 获得的聚类树状图如图 2。
可以看出， 40 份剑麻种质之间的相似系数为 0.44～
0.83。 其中墨引 2 与其它种质的相似系数最小， 为
0.44， 表明两种质之间的亲缘关系最远； H.11648
和桂幅 4 号间的相似系数最大， 为 0.83， 表明两种
质之间的亲缘关系最近。 在相似系数为 0.51 处，
40份剑麻种质可分为以下 4 组：
第 I 组包括从弧叶龙舌兰到南亚 2 号在内的
19 份种质。 主要为弧叶龙舌兰、 金边弧叶龙舌兰、
灰叶剑麻、 马盖麻 4 个种及普通剑麻和番麻与 H.
11648 的杂交后代。 本组在相似系数 0.61处， 又可
以细分为 5 个亚组： 第 1亚组包括弧叶龙舌兰、 金
边弧叶龙舌兰两个种质； 第 2亚组包括多叶普通剑
麻、 普通剑麻、 粤西 114、 粤西 75、 东 16、 墨引
5； 第3 亚组包括灰叶剑麻、 马盖麻； 第 4 亚组包
括番麻、 东 292、 墨引 6、 东 368、 南亚 1 号、 南
亚 2 号、 广西 76416、 墨引 8； 第 5 亚组仅含墨引
7一个种质。
图 1 引物 Pst I-GAG/Mse I-CAG 的剑麻 AFLP 图谱
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 5558 61
5 200
4 625
4 045
3470
2890
2315
1735
1160
引物组合 总带数 多态性带数 多态性带率/％
P-GAA/ M-CAG 88 57 64.77
P-GAA/ M-CTC 81 56 69.13
P-GAC/ M-CAC 117 92 78.63
P-GAG/ M-CAG 96 54 57.45
P-GTA/ M-CTC 94 54 58.69
P-GTA/ M- CTT 102 54 52.94
P-GTG/ M-CAG 106 68 66.67
P-GTG / M-CTC 101 72 71.28
总计/平均 785 507 64.58
表 2 40 份种质 AFLP 选择性扩增结果
张世清等： 中国剑麻种质资源的 AFLP分析 107- -
第 32 卷热 带 作 物 学 报
3 讨论与结论
由于剑麻在染色体上倍性和遗传背景上的差异
较大， 以至在种间有性杂交过程中， 随杂交方式和
杂交代数的不同， 其后代遗传相似性会出现较大的
差异。 AFLP 标记聚类分析的结果清楚地揭示了龙
舌兰麻种质之间的亲缘关系。 如粤西 114、 粤西 75
和东 16 均是普通剑麻与 H.11648 的子代 ， 广西
76416 和东 368 是番麻与 H.11648 的子代， 南亚 1
号、 南亚 2号是粤西 114与 H.11648 的子代， 这些
都与 AFLP标记聚类分析的结果相一致。
通过 AFLP 标记聚类分析还表明， 有些在分类
学上相差甚远的， 其遗传差异其实很小， 象弧叶龙
舌兰、 金边弧叶龙舌兰。 通过 AFLP 标记聚类分
析， 还初步确定了 14 个缺乏引种背景资料的种质
的遗传类型和起源。 如墨引 5是普通剑麻的杂交后
代； 墨引 6 为番麻的杂交后代； 墨引 7、 墨引 8 均
为 H.11648 的杂交后代； 墨引 10、 墨引 11 可能与
小刺番麻和金边番麻有非常密切的亲缘关系； 墨引
1 为兰剑麻的杂种后代； 金边东 1 号与东 74、 东
109 同种， 可能是它们的一个变种； 东 292 与番麻
同源， 可能与番麻同种或为其变种； 假 7与假菠萝
麻同源； 东 26与 H.11648同源。
为了通过杂交育种技术选育出抗斑马纹病的剑
麻， 在选择和 H.11648 杂交的亲本时， 亲缘关系要
尽可能远一些， 从而有更好的杂交优势。 鉴于此，
查看图 1 可知， 似乎假 7、 墨引 7、 墨引 6、 马盖
麻、 番麻、 东 368、 墨引 12、 墨引 5、 墨引 4、 金
边弧叶、 东 109、 南亚 1 号、 弧叶龙舌兰更适合与
H.11648 杂交， 以培育出抗病的剑麻新品种。 当
然， 所选亲本还必须能够抗斑马纹病， 因此， 下一
第Ⅱ组包括墨引 10、 墨引 11、 小刺番麻、 雷
神、 金边番麻 5份种质。
第Ⅲ组包括假菠萝麻和墨引 4 在内的 15 份种
质。 在相似系数 0.62 处， 又可以分成 3 个亚组，
其中第 1 亚组有假菠萝麻、 银边假菠萝麻、 粤西
117、 假 7、 东 2 号、 H.11648、 桂幅 4 号、 东 26、
蓝剑麻、 墨引 1 共 10 个种质， 均为假菠萝麻、 蓝
剑麻及二者杂交后代； 第 2 亚组包括墨引 12、 东
74、 金边东 1号及东 109共 4个种质； 第 3 亚组只
有墨引 4号一个种质。 其中在这一组中有相似系数
最大的一对种质， 即 H.11648和桂幅 4号。
第Ⅳ组为墨引 2一个种质。
图 2 剑麻 AFLP 分析聚类树状图
Ⅰ
Ⅰ-1
Ⅰ-2
Ⅰ-3
Ⅰ-4
Ⅰ-5
Ⅱ-1
Ⅱ-2
Ⅲ-1
Ⅲ-2
Ⅲ-3
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
108- -
第 1 期
步的工作， 就是鉴定 40份剑麻种质的抗病性。
参考文献
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[2] 郭朝铭， 易克贤. 现代技术在剑麻育种上的应用前景[J]. 福建
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[3] Fang J， Twito T， Zhang Z， et al. Genetic relationships among
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（21）： 4 407-4 414.
责任编辑： 沈德发
张世清等： 中国剑麻种质资源的 AFLP分析 109- -