全 文 ：文章编号: 0465-7942( 2004) 04-0090-05
二苯脲延缓紫萍半叶状体衰老的作用
⒇
朱晔荣　吕宪禹　田宝静　江兵泽　王淑芳　王宁宁　王　勇
( 南开大学 生命科学学院 , 天津 300071 )
　　摘要: 在长日照条件下 , 10- 7mol / L的二苯脲对紫萍半叶状体就有保绿的作用 , 10- 5～ 2× 10- 4mol / L的二
苯脲还可以明显地促进叶绿素的合成和干重的增加 ,提高丝氨酸:乙醛酸转氨酶的活性 ,延缓半叶状体的衰老 .
实验结果表明 ,二苯脲本身具有细胞分裂素的活性 ,能代替内源细胞分裂素起到抗衰老的作用 ;二苯脲同时也能
推迟半叶状体中内源细胞分裂素含量的降低 .另外 ,在培养液中加入外源 L-丝氨酸 ,可以抗拮二苯脲对紫萍半
叶状体衰老的延缓作用 ,说明二苯脲抗衰老的机制类似于其它细胞分裂素 .
关键词: 二苯脲 ; 紫萍 ; 半叶状体 ; 延缓衰老 ; 作用机制
中图分类号: Q94　　　　　　　　　　文献标识码: A
0　引　　言
二苯脲及苯脲类衍生物作为一类化合物 ,其化学结构与氨基嘌呤类的细胞分裂素很不相同 ,却具有细
胞分裂素的各种功能 .但苯脲类化合物的作用机理的研究还有待深入 .有关苯脲类的作用机理 ,至少有三
种观点 . 1:具有促进细胞分裂素合成的作用 [ 1] ; 2: 是细胞分裂素氧化酶的抑制剂 [2～ 4 ] ; 3: 能与细胞分裂素
受体相结合 ,通过一系列信号转导途径而发挥调节功能 [5、 6 ] .前期工作表明 ,紫萍半叶状体 (无根和分生组
织 )缺乏合成细胞分裂素的能力 ,在长日照条件下培养时 ,数天内开始衰老 ,进而死亡 ,但是当培养液中含
有一定浓度的 6-BA时 ,不但半叶状体的衰老受到抑制 ,而且活力明显增加 ,半叶状体的寿命与完整植株
相当 [ 7] ,说明细胞分裂素对于维持半叶状体的生命活动是必需的 .本实验采用紫萍半叶状体实验体系 ,针
对上述三种观点对二苯脲的作用进行了研究 ,得到一些有意义的结果 .另外对二苯脲保绿和延缓衰老的作
用机理进行了初步的探讨 .
1　材料与方法
1. 1　紫萍的培养和处理
实验材料为浮萍科 ( Lemnaceae) ,紫背浮萍属 ( Spirodela ) S. polyrrhiza种的 P143品系 .具体的培养
方法参见文献 [8 ] .
将生长一致的叶状体一切两半 ,然后将不带有根和囊的半叶状体继续进行培养和研究 .按照每一实验
的具体要求 ,培养不同时间后 ,分别收集半叶状体 ,除去表面水分 ,然后称取鲜重或干重 ,同时提取叶绿素
或测定酶活 .
1. 2　主要试剂
2, 4-二硝基氟苯、 L-丝氨酸 , L-甘氨酸均购自 Sigma公司 ;二苯脲、 HPLC所用试剂和其它试剂均为国
产分析纯 .
1. 3　二苯脲的处理方法
用乙醇将二苯脲溶解 ,配制成 12. 5 mmol /L溶液 .然后按浓度要求 ,取一定量的溶液点在滤纸上 ,待乙醇
充分挥发完以后 ,再放入紫萍培养液 ,配成所需浓度.这种方法巧妙地解决了二苯脲难以溶解的问题.
第 37卷　第 4期
2004年 12月 南 开 大 学 学 报 (自然科学版 )Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Nankaiensis 　Vo l. 37　№ 4　 Dec. 2004
⒇收稿日期: 2003-05-31　基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 39970077)　作者简介:朱晔荣 ( 1973- ) ,女 ,内蒙古呼和浩特人 ,博士研究生 .
1. 4　叶绿素的提取和测定
把半叶状体放在冰浴的研钵中 ,分三次加入 96%乙醇 ( 2. 4μL乙醇 /片半叶状体 ) ,充分研磨后转入
7 mL离心管 , 12000 r /min离心 5 min,取上清 ,在分光光度计上测 OD值 .根据 Wintermans, De Mo ts的
方法 [ 9 ] ,依照以下公式计算叶绿素含量:稀释倍数× ( 20. 04× OD649+ 6. 1× OD665 )×提取液的体积 /片数 ,
单位为μg /片 .
1. 5　氨基酸和 SGAT酶的提取
将待测的半叶状体先在液氮中速冻 ,然后加入氨基酸提取液 ( 6. 7μL提取液 /片半叶状体 ) ,充分研
磨 ,收集研磨液 , 12000 r /min离心 5 min,取上清 ,同样转速再次离心 20 min,小心吸取上清液 ,即为转氨
酶的初提液 ,也是氨基酸初提液 .氨基酸初提液为 0. 05 mol /L的磷酸钾缓冲液 ,含有 1. 5 mg /m L DTT,
pH值为 7. 4[10 ] .
1. 6　氨基酸和 SGAT酶活性的测定
将来自同一样品的酶反应混和物和氨基酸初提液分别用 2, 4-二硝基氟苯 ( FDN B)柱前衍生化以后 ,
用 Kromasi l生产的十八烷基硅烷 ( C-18)柱 ,反相高效液相色谱法 ,通过测定衍生化甘氨酸 ( DN P-Gly)含
量的增加 ,来分析 SGAT酶的活性 .流动相是乙腈与醋酸盐缓冲系统 ;线性梯度冼脱 ;检测波长是 360 nm.
酶反应和衍生化反应体系参照文献 [ 10, 11]进行 ,取 5μL衍生化反应产物进行分析 .
2　结果与讨论
2. 1　二苯脲对紫萍半叶状体的作用
当在液体培养液中加入不同浓度的二苯脲培养紫萍的半叶状体时 ,在 10- 7～ 2× 10- 4 mol /L浓度范
围内 ,二苯脲的作用效果有所不同 . 10- 6 mo l /L和 10- 7 mo l /L的二苯脲仅具有保绿作用 ,而 10- 5～ 2×
10- 4 mo l /L的二苯脲则具有明显的促进叶绿素合成 ,增加干重 ,延缓衰老的作用 ,而且 DPU的作用浓度
和作用效果呈正相关 (如图 1所示 ) .
为了比较 DPU和 6-BA的作用效果 ,用不同浓度 DPU和 6-BA(浓度为 10- 6 mol /L )分别对紫萍半叶
状体处理 2, 4, 8, 12 d,各自取样 ,按上述条件称取鲜重和干重 ,提取叶绿素分析 .结果表明 5× 10- 5 mol /L
的 DPU与 10- 6 mol /L的 6-BA作用效果相当 (结果见图 2) ,说明 DPU的作用效果比其它细胞分裂素的
低 ,与文献报道一致 [ 12, 13] .所以选择 5× 10- 5 mo l /L为最佳作用浓度 .
2. 2　二苯脲延缓紫萍半叶状体衰老的作用机制的探索
2. 2. 1　 DPU和 ZT的作用关系: Shudo认为苯脲及其衍生物发挥细胞分裂素的作用是通过抑制细胞分
裂素氧化酶的活性 [14 ] ,且在玉米中实验证明 ,苯脲及其衍生物是细胞分裂素氧化酶的竞争性抑制剂 [ 4 ] .对
于容易被氧化的天然玉米素 ( ZT) , 10- 8 mol /L的 ZT对紫萍半叶状体只有微弱的保绿作用 (图 3) .因此 ,
·91·　第 4期 朱晔荣等:二苯脲延缓紫萍半叶状体衰老的作用
在给予 DPU的同时 ,加入低浓度的 ZT( 10- 8 mol /L) ,以研究 DPU是否为细胞分裂素氧化酶的抑制剂 .将
半叶状体经过 ZT和 DPU单独或混合处理 ,提取叶绿素分析 ,结果如图 3所示 ,用 ZT和 DPU同时处理
的半叶状体与用二者单独处理的相比 ,延缓衰老的作用更显著 .当培养到第 8 d时 ,单位半叶状体叶绿素
含量比用 ZT单独处理的半叶状体增加了约 3倍 ,与用 DPU( 5× 10- 5 mol /L )单独处理的相比 ,增加了
20% .表现出一定的叠加效果 .因此推测 DPU可能具有抑制玉米素氧化酶活性的作用 .
2. 2. 2　不同时间加入 DPU后的作用: 为进一步说明 DPU是否仅是通过抑制细胞分裂素氧化酶起作用
的 ,将半叶状体先在不加有外源调节物质的培养液上分别培养 2, 4, 6, 8 d后 ,再转入含有 DPU ( 5× 10- 5
mol /L )的培养液上继续培养 ,在第 2, 4, 6, 8, 10, 12 d时 ,分别取样 ,测定叶绿素含量 .结果发现 ,半叶状体
在自然衰老 2, 4, 6 d以后 , DPU仍可以促进半叶状体叶绿素的合成 ,而且高于新鲜半叶状体叶绿素含量
(如图 4所示 ) .但是对于已自然衰老 8 d的半叶状体 ,则仅有保绿作用 .说明在半叶状体生物活性还没有
丧失的情况下 , DPU不仅具有保绿的作用 ,而且仍具有延缓衰老的作用 ,表明 DPU除通过抑制细胞分裂
素氧化酶活性起作用外 ,可能本身具有类似于天然细胞分裂素的作用 .
紫萍半叶状体在不含细胞分裂素的培养液上在长日照条件下很快衰老 ,说明半叶状体没有或只有很
低的合成细胞分裂素的能力 .因此 ,以上的结果暗示 , DPU并不可能通过促进内源细胞分裂素的合成而发
挥抗衰老功能 .另外我们对半叶状体内源细胞分裂素含量测定的初步结果也表明 , DPU的处理并没有引
起内源细胞分裂素含量的增加 (结果未附 ) .
2. 2. 3　与丝氨酸的关系: 早在 70年代 Thimann等报道 ,丝氨酸可拮抗激动素对离体的燕麦叶片切段延
缓衰老的作用 [15 ] .为了进一步明确 DPU在紫萍半叶状体的抗衰老中的作用机制 ,研究了 DPU与丝氨酸
的关系 .发现无论在长日照还是黑暗条件下 ,丝氨酸不仅能促进紫萍半叶状体的衰老进程 ,而且能拮抗
DPU延缓半叶状体衰老的作用 .图 5是将半叶状体经过丝氨酸单独或与 DPU同时处理的结果 .到第四天
时 ,丝氨酸单独处理的半叶状体已表现出明显的衰老症状 ,单位叶片的叶绿素含量与自然衰老的半叶状体
相比低 50% ,与新鲜半叶状体相比下降约 60% ;而且 DPU和丝氨酸同时处理的半叶状体 ,无论是与 DPU
单独处理的还是与自然衰老的相比 ,叶绿素的含量也都有所降低 .
2. 2. 4　与丝氨酸:乙醛酸转氨酶的关系: DPU和丝氨酸的作用关系与 Thimann报道的现象类似 ,说明丝
氨酸含量的变化与细胞分裂素和衰老之间有某种关系 ,所以有必要研究与丝氨酸代谢相关的酶 .丝氨酸:
乙醛酸转氨酶 ( SGAT)是光呼吸途径中重要的酶之一 ,催化丝氨酸和乙醛酸发生转氨反应 ,生成甘氨酸和
羟基丙酮酸 .光呼吸途径与植物的衰老可能有着密切的关系 [16 ] .将半叶状体在含有和不含 DPU的培养液
上分别培养 4 d,然后分别测定 SGAT的活性 ,结果如图 6所示 .虽然第四天时 ,半叶状体间鲜重、干重和
叶绿素的含量没有明显差别 ,而 SGAT的活性却出现显著的差别 . DPU处理的半叶状体是自然衰老半叶
状体 SGAT酶活力的 2倍 ,比鲜新半叶状体 SGAT酶的活力还高 0. 5倍 . SGAT做为代谢丝氨酸的主要
酶 ,随着半叶状体趋向衰老 ,其活性降低 ,必然导致丝氨酸的积累 ;而丝氨酸的积累 ,可能是衰老的诱导因
·92· 　南 开 大 学 学 报 (自然科学版 ) 第 37卷
子 [17, 18 ] ,说明 DPU可能与其它细胞分裂素一样 ,通过保持 SGAT的活性而起到抑制紫萍半叶状体衰老的
作用 [18 ] .
3　小　　结
对于紫萍半叶状体 ,二苯脲能抑制叶绿素的降解和促进叶绿素的合成 ,具有很好的保绿和延缓衰老的
作用 .二苯脲可能主要是通过类似于 6-BA的细胞分裂素活性物质起作用的 [ 12] ,另外二苯脲也可能通过竞
争性抑制细胞分裂素氧化酶的活性 [4 ] ,减少了内源细胞分裂素的氧化 .因此 ,二苯脲可能通过与细胞分裂
素的受体相结合 [5 ] ,经过一系列信号转导途径而发挥调节作用 [6 ] .其中 ,至少通过调节 SGA T酶的活性以
保持半叶状体的内源丝氨酸处于较低的水平 ,从而抑制了半叶状体在光下的衰老 .
二苯脲对紫萍半叶状体保绿和延缓衰老作用的研究 ,在理论和实践中 ,都具有重要的意义 .理论上 ,为
进一步探索细胞分裂素类化合物作用的分子机制提供了基础 ;实践上 ,二苯脲作为一类化学合成的生长调
节剂 ,具有容易生产 ,价格低廉 ,又无毒副作用等优点 ,可开发为花卉保鲜剂 [19 ]等 .
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THE EFFECT OF N, N -DIPHENYLUREA
ON SP IRODEL A HALF-FRONDS
ZHU Yerong ,　 LV Xianyu,　 TIAN Baojing ,　 JIANG Bing ze,
WANG Shufang ,　WANG Ningning ,　W ANG Yong
( College of L if e Sciences , N ankai University , Tianjin 300071, China )
　　 Abstract: DPU a t a concentra tion of as low as 10- 7 mo l /L retained the chlorophyll of
Spirodela half-f ronds under long-day condi tions. From 10
- 5～ 2× 10- 4 mo l /L i t prompted the
synthesis of chloroph lly and the serine: gly oxylate amino t ransferase ( SGAT ) activi ty ,
increased dry w eigh t, and retarded the senescence o f half-f ronds. It w as demonst ra ted tha t
DPU itself acted as a kind o f cy tokinin in delaying senescence. How ever, it also postponed the
decline of endogenous cy tokinins of hal f-f ronds. L-serine added into the medium ( 10
- 3
mo l /L)
antag onized the ef fect of DPU, which show s the mechanism o f DPU in delaying senescence is
most likely simila r to o ther cy tokinins.
Key words: diphenylurea; Spirodela polyrrhiza; half-fronds; delaying senescence; r egula tion mechanism
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