全 文 ：［收稿日期］ 20150908(017)
［基金项目］ 国家自然科学基金项目(81360650，81560811) ;贵州省留学人员科技活动项目(黔人资合［2013］02 号) ;教育部科学技术研
究重点项目(21116) ;贵州省中药现代化专项(黔科合中药字［2012］5051 号) ;贵州省高等教育科技创新团队项目(黔教合
人才团队字［2014］31) ;贵州省高等学校创新能力提升计划项目(黔教合协同创新字［2013］04) ;贵州省高层次创新型人才
项目(黔科合人才［2015］4029) ;贵州省科技创新团队项目(黔科合人才团队［2015］4025 号)
［第一作者］ 文波，在读硕士，从事心血管药物药理研究，Tel:15085969694，E-mail:562940926@ qq． com
［通讯作者］ * 陈妍，博士，副教授，从事天然药物活性研究，Tel:0851-88416160，E-mail:457335071@ qq． com;
* 沈祥春，教授，博士生导师，从事中药民族药活性及效应机制研究，Tel:0851-88416149，E-mail:shenxiangchun@ 126. com
艳山姜挥发油抑制 JNK1 /2 /3 磷酸化对 ox-LDL诱导的
HAECs损伤的影响
文波，令狐克刚，徐旖旎，张彦燕，罗红，陶玲，陈妍* ，沈祥春*
(贵州医科大学 天然药物资源优效利用重点实验室，贵阳 550025)
［摘要］ 目的:研究艳山姜挥发油对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导人主动脉内皮细胞(HAECs)损伤的保护作用，并分析
可能的作用机制。方法:实验分为空白组(无血清内皮细胞培养基) ，模型组(200 mg·L －1 ox-LDL) ，艳山姜挥发油高剂量组(200
mg·L －1 ox-LDL +100 μg·L －1艳山姜挥发油)和低剂量组(200 mg·L －1 ox-LDL +10 μg·L －1艳山姜挥发油)共 4组。艳山姜挥发油
预保护1 h，继续加入 ox-LDL共同作用24 h，采用噻唑盐(MTT)法分析细胞存活率，苏木精-伊红(HE)染色法进行形态学观察;采
用酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养上清液乳酸脱氢酶(LDH)外漏量，Western blot 分析 c-Jun 氨基末端激酶(JNK)1 /2 /3，
p-JNK1 /2 /3蛋白表达，实时荧光定量聚合酶链式反应分析 JNK1 /2 /3 mＲNA表达水平。结果:艳山姜挥发油能显著提高 HAECs
的存活率，改善细胞的病理损伤，减少 LDH外漏量，抑制 JNK1 /2 /3蛋白磷酸化，但对 JNK1 /2 /3 蛋白和 mＲNA水平无显著影响。
结论:艳山姜挥发油改善 ox-LDL诱导的 HAECs损伤，其作用机制与抑制 JNK1 /2 /3蛋白磷酸化相关。
［关键词］ 艳山姜;挥发油;氧化低密度脂蛋白;人主动脉内皮细胞;c-Jun氨基末端激酶
［中图分类号］ Ｒ285. 5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2015)22-0112-04
［doi］ 10. 13422 / j． cnki． syfjx． 2015220112
［网络出版地址］ http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /11． 3495． Ｒ． 20151022． 1345． 010． html
［网络出版时间］ 2015-10-22 13:45
Inhibitory Effect of Essential Oil from Fructus Alpinia zerumbet on HAECs Injury of ox-LDL-induced by
Down-regulation Phosphorylation of JNK1 /2 /3 WEN Bo，LINGHU Ke-gang，XU Yi-ni，ZHANG Yan-yan，
LUO Hong，TAO Ling，CHEN Yan* ，SHEN Xiang-chun* (Key Laboratory of Optimal Utilization for Natural
Medicine Ｒesources，Guizhou Medical University，Guiyang 550025，China)
［Abstract］ Objective:To investigate protective effect of essential oil from Fructus Alpinia zerumbet
(EOFAZ)on human aortic endothelial cells (HAECs)injury induced by oxidized low density lipoprotein (ox-
LDL) ，and explore its possible mechanism． Method:Experiment was randomly divided into 4 groups as
following:blank group (serum free ECM) ，model group (200 mg·L －1 of ox-LDL) ，EOFAZ with high dose group
(200 mg·L －1 of ox-LDL +100 μg·L －1 of EOFAZ)and low dose group (200 mg·L －1 of ox-LDL + 10 μg·L －1 of
EOFAZ)． Pretreated with EOFAZ for 1 h and continue added ox-LDL for 24 hours． Then 3-(4，5-dimethyl-2-
thiazolyl)-2，5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)method was employed to analyze cell survival rate and
HE staining was used to observe morphology． Leakage of lactate dehydrogenase (LDH)was detected by enzyme-
linked immunosorbent assay (ELISA)． Expression of c-Jun N-terminal kinase 1 /2 /3 (JNK1 /2 /3) and
phosphorylation-JNK1 /2 /3 (p-JNK1 /2 /3)protein was detected by Western blot analysis and JNK1 /2 /3 mＲNA
level was detected by quantitative real time polymerase chain reaction (qＲT-PCＲ)． Ｒesult:EDFAZ could
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significantly enhance survival rate of HAECs，ameliorate pathological injury of cells，decrease LDH leakage
content and inhibit phosphorylation of JNK1 /2 /3，but it had no effect on expression level of JNK1 /2 /3 protein and
mＲNA． Conclusion:EDFAZ can ameliorate HAECs injury status induced by ox-LDL，and its mechanism may be
related to inhibition of phosphorylation of JNK1 /2 /3.
［Key words］ Alpinia zerumbet;essential oil;oxidized low density lipoprotein;human aortic endothelial
cells;c-Jun N-terminal kinase
血管内皮细胞已成为在生理、病理过程中发挥
重要作用的多功能“器官”，其结构和功能异常与各
种心血管系统疾病的发生密切相关［1-2］，主要表现
为舒张和收缩因子、促凝和抗凝物质、生长抑制和生
长促进物质的生成释放不平衡等。这些不平衡与氧
化应激反应密不可分。据文献［3-5］报道氧化低密度
脂蛋白(ox-LDL)能促进氧化应激反应的进行，通过
激活细胞特异性受体、诱导相关基因和蛋白的表达，
使内皮细胞受损或功能失调、脂代谢异常、内膜受
损、脂点脂纹形成，继而出现纤维斑块和粥样斑块，
导致心血管疾病的发生。艳山姜挥发油具有抗心肌
缺氧、抗动脉粥样硬化、抗溃疡等药理作用［6-7］。前
期研究发现艳山姜挥发油对内皮细胞损伤具有保护
作用［8-10］，但其作用机制尚不清楚。c-Jun 氨基末端
激酶(JNK)又被称为应激活化蛋白激酶，是哺乳类
细胞中丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)信号通路家族
成员之一，在细胞分化、细胞凋亡、应激反应等生理
和病理过程中起着重要作用。本实验基于前期研究
水平，探索艳山姜挥发油通过抑制 JNK1 /2 /3 蛋白
磷酸化发挥对 ox-LDL 诱导人主动脉内皮细胞
(HAECs)氧化损伤的改善作用，为该部位的临床开
发提供参考。
1 材料
ELX800 型酶联免疫检测仪(美国 GE 公司) ，
CFX型凝胶成像系统仪和 Universal Hood II 型实时
荧光定量聚合酶链式反应(PCＲ)仪(美国 Bio-Ｒad
公司)。
艳山姜采集自贵州省贞丰县连环乡，经贵州医
科大学陈祖云教授鉴定为姜科植物 Alpinia zerumbet
的干燥成熟果实，采用水蒸气蒸馏法提取艳山姜挥
发油，得率 1. 3%。人主动脉内皮细胞(HAECs) ，内
皮细胞培养基(ECM) ，胰酶消化液，中和液和冻存
液均购自美国 Sciencell 公司;氧化低密度脂蛋白
(ox-LDL，北京协生生物科技有限责任公司) ，乳酸
脱氢酶(LDH)试剂盒(齐一生物科技上海有限公
司) ，四甲基偶氮唑盐(MTT，美国 Sigma公司) ，抗 c-
Jun氨基末端激酶(JNK)1 /2 /3 和 p-JNK1 /2 /3 多克
隆抗体(美国 ImmunoWay 公司) ，甘油醛-3-磷酸脱
氢酶(GAPDH)抗体(美国 Bioworld公司) ，增强化学
发光法(ECL)试剂盒(美国 Bio-Ｒad公司)。
2 方法
2. 1 HAECs 培养 从超低温冰箱中取出 HAECs
后立即放入 37 ℃水浴中解冻，转入含 ECM(由 5%
灭活胎牛血清，100 U青霉素，100 mg·L －1链霉素配
制而成)3 mL的培养瓶中，于 37 ℃，5% CO2 恒温饱
和湿度的培养箱中培养，隔天换液 1 次，用 3 ～ 6 代
细胞进行实验。
2. 2 分组与处理 试验分为 4 组，包括空白组(无
血清 ECM) ，模型组(200 mg·L －1 ox-LDL) ，艳山姜
挥发油高剂量组(200 mg·L －1 ox-LDL + 100 μg·L －1
艳山姜挥发油)和艳山姜挥发油低剂量组(200
mg·L －1 ox-LDL + 10 μg·L －1艳山姜挥发油)。按上
述分组进行给药，处理结束后进行指标检测。
2. 3 MTT法分析细胞存活率 按 2. 2 项下方法分
组，加入艳山姜挥发油预处理 1 h，继续加 ox-LDL作
用 24 h。96 孔板中每孔加 5 g·L －1 MTT 20 μL 置于
培养箱孵育 4 h，小心吸去孔内液体，每孔加入二甲
基亚砜 150 μL，震荡 10 min 后于 490 nm 处测定各
孔吸光度 A，按(A试验组 － A调零组)/(A空白组 － A调零组)×
100%计算细胞存活率。
2. 4 艳山姜挥发油对细胞损伤形态学的改变 将
细胞接种于 6 孔板，按 2. 2 项下方法分组给药后进
行苏木精-伊红(HE)染色，按说明书指示方法稍微
进行改进，染色后于倒置相差显微镜下拍照观察。
2. 5 酶联免疫吸附剂测定法(ELISA)检测 LDH 外
漏量 将 HAECs 接种于 96 孔板，按 2. 2 项下方法
处理后收集培养液上清，于 － 20 ℃冰箱保存备测。
参照试剂盒说明书检测培养上清液中 LDH外漏量。
2. 6 Western blot检测 JNK1 /2 /3 和 p-JNK1 /2 /3 蛋
白的表达 各组细胞加入裂解液，冰上裂解约
20 min后离心(12 000 r·min －1，20 min)取上清，采
用 BCA试剂盒定量处理后上样，用 12%十二烷基磺
酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离总蛋
白，随后用湿转法转移至聚偏氟乙烯膜上，用 1%牛
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血清白蛋白(BSA)封闭 1 h，加入稀释比率为
1∶ 1 000的 JNK1 /2 /3，p-JNK1 /2 /3 抗体过夜后洗膜
加入相应的二抗(1 ∶ 5 000 稀释) ，室温孵育 1. 5 h，
ECL法显影，凝胶图像处理系统拍照并分析条带灰
度值。GAPDH用于蛋白内参标化。
2. 7 qＲT-PCＲ 分析 JNK1 /2 /3 mＲNA 表达水平
采用 Trizol 法裂解细胞提取总 ＲNA，逆转录合成
cDNA，加入上、下游引物进行 PCＲ 扩增反应。
JNK1 /2 /3 引物(100 bp)序列上游 5-TGGACTT
GGAGGAGAGAACC-3，下 游 5-CATTGACAGACG
ACGATGATG-3。GAPDH引物(138 bp)序列上游
5-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3，下 游 5-GAA
GGCTGGGGCTCATTT-3。PCＲ反应条件为 95 ℃预
变性 10 min，95 ℃变性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延
伸 30 s，循环 40 次。根据 2 － ΔΔCt法，选择 GAPDH 为
内参，对 JNK1 /2 /3 mＲNA水平进行分析。
2. 8 统计学处理 各组所得数据采用 SPSS 17. 0
统计学软件进行处理。两组间比较采用 t检验，P ＜
0. 05 表示差异具有统计学意义。
3 结果
表 1 艳山姜挥发油对 HAECs中 JNK1 /2 /3 及 p-JNK1 /2 /3 蛋白表达的影响(珋x ± s，n = 3)
Table 1 Effect of essential oil from Fructus Alpinia zerumbet on expression of JNK1 /2 /3 and p-JNK1 /2 /3 proteins in HAECs (珋x ± s，n = 3)
组别
质量浓度
/μg·L －1
蛋白量表达相对比值(归一化)
p-JNK1 /2 /3 /GAPDH JNK1 /2 /3 /GAPDH p-JNK1 /2 /3 /JNK1 /2 /3
空白 － 1 1 1
模型 2. 0 × 105 1. 876 ± 0. 2571) 1. 084 ± 0. 072 1. 556 ± 0. 3981)
艳山姜挥发油 100 1. 134 ± 0. 1393) 0. 852 ± 0. 187 1. 087 ± 0. 1133)
10 1. 428 ± 0. 3233) 0. 987 ± 0. 126 1. 387 ± 0. 2942)
注:与空白组比较1)P ＜ 0. 01;与模型组比较2)P ＜ 0. 05，3)P ＜ 0. 01。
3. 1 艳山姜挥发油对 ox-LDL 诱导的 HAECs 损伤
存活率的影响 ox-LDL 作用 24 h 后，空白组、模型
组和艳山姜挥发油高、低剂量组的 A 分别为
0. 438 ± 0. 033，0. 289 ± 0. 023，0. 405 ± 0. 039，0. 362 ±
0. 028，存活率分别为 100%，66. 0%，92. 5%，82. 6%。
模型组与空白组相比，A极显著降低;与模型组相比，
艳山姜挥发油高、低剂量组的 A明显提高，提示艳山
姜挥发油能明显提高细胞存活率。
3. 2 艳山姜挥发油对 HAECs 细胞形态的影响
HE染色后，胞核染成蓝色，胞浆染成淡粉红色。空
白组细胞数目较多，染色形态清晰，胞间连接紧密，
成多角形或梭型。模型组细胞数目明显减少，形态
模糊，细胞收缩变圆，胞间隙明显增大，核浓缩，包体
膨大，形态异于正常，表现出细胞损伤的典型病理学
改变。与模型组比较，艳山姜挥发油高、低剂量组细
胞形态不同程度地改善了 ox-LDL导致的细胞损伤。
提示艳山姜挥发油能明显改善 ox-LDL对 HAECs的
损伤形态，见图 1。
A．空白组;B．模型组;C．高剂量组;D．低剂量组(图 2 同)
图 1 不同剂量组艳山姜挥发油对 HAECs形态的影响(HE，× 200)
Fig． 1 Effects of essential oil from Fructus Alpinia zerumbet with
different dose on morphology of HAECs (HE，× 200)
3. 3 艳山姜挥发油对 HAECs 中 LDH 外漏量的影
响 空白组、模型组和艳山姜挥发油高、低剂量组的
LDH 外漏量分别为(68. 49 ± 11. 25) ，(102. 23 ±
13. 26) ，(77. 35 ± 15. 48) ，(83. 43 ± 12. 26)U·L －1。
与空白组相比，模型组 LDH 外漏量明显增加;与模
型组相比，艳山姜挥发油高、低剂量组的 LDH 外漏
量明显降低，提示艳山姜挥发油可抑制 ox-LDL诱导
损伤的 HAECs中 LDH外漏量的增加。
3. 4 Western blot分析 JNK1 /2 /3 和 p-JNK1 /2 /3 蛋
白的表达 Western blot分析结果显示，与空白组比
较，模型组 p-JNK1 /2 /3 蛋白表达显著增加，提示 ox-
LDL促进 JNK1 /2 /3 蛋白磷酸化。与模型组比较，
艳山姜挥发油高剂量组和低剂量组 p-JNK1 /2 /3 蛋
白表达显著降低，且差异分别具有极显著性和显著
性，提示艳山姜挥发油通过抑制 JNK1 /2 /3 蛋白磷
酸化发挥对细胞的保护作用。而各组 JNK1 /2 /3 总
蛋白量之间无统计学意义，提示各药物对 JNK1 /2 /3
总蛋白量无显著影响。见表 1 和图 2。
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图 2 艳山姜挥发油对 ox-LDL诱导 HAECs损伤的 JNK1 /2 /3 及 p-
JNK1 /2 /3 蛋白表达的影响
Fig． 2 Effect of essential oil from Fructus Alpinia zerumbet on
expression of JNK1 /2 /3 and p-JNK1 /2 /3 proteins in HAECs
induced injury by ox-LDL
3. 5 qＲT-PCＲ 分析 JNK1 /2 /3 mＲNA 水平 qＲT-
PCＲ分析显示，用艳山姜挥发油干预后，各组 JNK1 /
2 /3 mＲNA 水平均无统计学意义。提示各药物对
JNK1 /2 /3 mＲNA表达水平无影响，艳山姜挥发油仅
通过影响 JNK1 /2 /3 蛋白磷酸化发挥保护作用。
4 讨论
ox-LDL作用于动脉内皮细胞可引起多种损伤
因子产生和释放，刺激血管内皮受损或功能失调，脂
点和脂纹形成，导致脂代谢紊乱，继而出现纤维斑块
和粥样斑块，促进动脉粥样硬化形成［11］。LDH 是细
胞损伤标志物，其外漏量提示细胞损伤程度。JNK是
MAPK信号家族中的关键成员之一，与类风湿性关节
炎、哮喘、心血管疾病、癌症、神经退行性疾病、眼部等
疾病密切相关［12］。JNK信号通路可被不同的刺激或
刺激物所激活，如炎症细胞因子和应激因子缺血再灌
注、紫外照射、氧化损伤、高渗环境损伤等［13-14］，从而
导致 JNK磷酸化蛋白增加，一系列底物如转录因子、
蛋白激酶、胞浆和胞核蛋白等活化，引发炎症反应、细
胞分化、细胞周期停滞、凋亡、衰老及 ＲNA剪接调控
等。且这种活化作用通常具有组织细胞特异性，持续
长时间磷酸化会引起细胞凋亡。
前期研究发现艳山姜挥发油可通过 NO合成酶
(NOS)-NO系统发挥对血管内皮功能异常的调控作
用［15］，本文采用 ox-LDL 诱导活化体外培养的
HAECs，建立血管内皮细胞氧化损伤模型。采用艳
山姜挥发油进行干预，通过检测 JNK1 /2 /3 总蛋白
及磷酸化蛋白表达探索该部位的保护作用机制。结
果表明艳山姜挥发油显著提高了 ox-LDL 诱导
HAECs的存活率，改善其病理状态，减少 LDH 的外
漏量。此外，艳山姜挥发油还显著下调 JNK1 /2 /3
蛋白磷酸化水平而不影响 JNK1 /2 /3 总蛋白和
mＲNA的表达水平，发挥对 ox-LDL诱导损伤 HAECs
的保护作用，提示艳山姜挥发油通过影响 JNK 信号
转导通路减少 ox-LDL诱导 HAECs的损伤。
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［责任编辑 刘德文］
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