全 文 ：收稿日期:2008-10-15;　修订日期:2008-12-01
基金项目:国家科技支撑计划(No.2008BAI68B02);
国家自然科学基金(No.30660060)
作者简介:胡朗吉(1983-),女(土家族), 湖南张家界人 ,现为南昌大学医
学部在读硕士研究生 ,江西省人民医院住院医师 ,学士学位 ,主要从事心
脏电生理研究工作.
＊通讯作者简介:葛郁芝(1950-), 男(汉族),江西高安人 , 现任江西省人
民医院心血管内科教授 ,博士学位 ,主要从事心血管疾病的防治和研究工
作.
甘松挥发油对大鼠心室肌细胞瞬时外向钾电流的影响
胡朗吉 ,葛郁芝＊ ,罗　骏 ,杨　涛 ,张淑华 ,吴志婷
(江西省人民医院 ,江西省心血管病研究所 ,江西 南昌　330006)
摘要:目的 研究甘松挥发油对大鼠心室肌细胞膜瞬时外向钾电流(Transientoutwardpotassiumcurrent, Ito)的影响 ,探讨
甘松挥发油抗心律失常作用的离子机制。方法 用急性酶解分离法获得单个大鼠心室肌细胞 ,采用标准的全细胞膜片钳
技术记录大鼠心室肌细胞膜瞬时外向钾电流(Ito)。结果 甘松挥发油可呈浓度依赖性和电压依赖性抑制 Ito。在 +70mV
时 , 3 μg/g, 6μg/g, 10 μg/g和 20μg/g甘松挥发油分别抑制 Ito峰值电流的抑制率为 (27.01±6.93)%(n=5), (51.13
±9.82)%(n=5), (80.86±4.63)%(n=5)和(94.81±4.30)%(n=5)。甘松挥发油对 Ito的电流密度 -电压关系曲
线(currentdensity-voltagecurve, I-V曲线)的影响:在 +70 mV时 , 6μg/g甘松挥发油使 Ito峰电流从(23.081 ±0.74)
pA/pF减少到(11.232±1.47)pA/pF(n=5, P<0.05),给药后电流密度减少约 50%,给药前后电流密度变化有统计学
意义。甘松挥发油对 Ito激活和失活曲线的影响:在甘松挥发油 6 μg/g灌流法给药后 , 激活曲线显示给药前后半数激活
电压(V1/2)为:(36.063 ±1.792)mVvs(34.788±3.029)mV(P> 0.05, n=5);斜率因子(S)为:(22.972±1.491)mVvs
(30.791±2.899)mV(P<0.05, n=5)。给药前后半数激活电压变化无显著差异。失活曲线显示甘松挥发油使失活曲线
明显左移 , 差异有显著统计学意义:给药前后半数失活电压(V1/2)为(-33.738±0.476)mVvs(-40.536±0.696)mV(n
=5, P<0.01);斜率因子(S)为:(5.001±0.396)mVvs(8.420±0.620)mV(n=5, P<0.01)。结论 甘松挥发油可
呈浓度和电压依赖性抑制大鼠心室肌细胞 Ito, 使 I-V曲线下移 ,但对激活曲线无明显影响 , 同时 ,使失活曲线明显左移 ,
使心室肌细胞复极化减慢 ,这可能是其抗心律失常作用的重要机制之一。
关键词:甘松挥发油;　膜片钳技术;　瞬时外向钾电流;　心室肌细胞
中图分类号:R962　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2009)08-1843-03
EffectsoftheVolatileOilofNardostachyschinensisonTransientOutwardPotassiumCur-
rentinIsolatedVentricularMyocytesinRats
HULang-ji, GEYu-zhi＊ ,LUOJun, YANGTao, ZHANGShu-hua, WUZhi-ting
(DepartmentofCardiology, JiangxiProvincialPeoplesHospital, Nanchang, 330006 , China)
Abstract:ObjectiveToobservetheeffectsofthevolatileoilofNardostachyschinensis(VONC)ontransientoutwardpotassium
curentinisolatedventricularmyocytesinrats.MethodsSingleventricularmyocyteofratswereobtainedbyenzymaticdissocia-
tion.Thewhole-cellpatchclamprecordingtechniquewasusedtorecordthechangeofItocurrentbytheeffectofthevolatileoil
ofNardostachyschinensis.Results 1.ThevolatileoilofNardostachyschinensiscouldreducetheItocurrentwithdose-depend-
entblockmanner.Atconcentrationsof3, 6, 10 and20μg/g, thepeakItocurrentwasrespectivelyreduced(27.01±6.93)%
(n=5, P<0.05), (51.13±9.82)% (n=5, P<0.05), (80.86±4.63)% (n=5, P<0.05)and(94.81±4.30)%(n
=5, P<0.05).2.ThevolatileoilofNardostachyschinensisalsocouldreduceItocorrentinvoltage-dependentblockmanner.
ThecurrentdensityofItowasimpactedbytheconcentrationat6μg/gofthevolatileoilofNardostachyschinensis.Thepeakcur-
rentdensityofItowasreducedto11.23±1.47pA/pFfrom23.08±0.74pA/pF(n=5, P<0.01)atmembranepotentialof+
70 mVaftertreatmentwiththevolatileoilofNardostachyschinensisat6μg/g.Itwasreducedabout50%.3.Theactivitycurve
hadnosignificantchangeaftertreatmentwiththevolatileoilofNardostachyschinensis(6μg/g).TheirV1/2were(36.063 ±1.
792)mVvs(34.788±3.029)mV(n=5, P>0.05)andslopewere(22.972±1.491)mVvs(30.791±2.899)mV(n=5,
P<0.05).TheinactivationcurvewasshiftedtowardsthenegativedirectionaftertreatmentwiththevolatileoilofNardostachys
chinensis(6μg/g).TheirV1/2 were(-33.738±0.476)mVvs(-40.536±0.696)mV(n=5, P<0.01)andSlopewere(5.
001±0.396)mVvs(8.420±0.620)mV(n=5, P<0.01).ConclusionThevolatileoilofNardostachyschinensisexercutes
theblockedfunctiontoItoindosedependentandvoltagedependentmanners, anditsdosagealterstheI-Vcurve, butdoesnot
altertheactivecurve.
Keywords:ThevolatileoilofNardostachyschinensis;　Patch-clamprecordingtechnique;　Transientoutwardpotassium
curent;　Myocardium
　　甘松 Nardostachyschinensis又名香松 , 甘香松 , 为败酱科植物
甘松 NardostachyschinensisBatal或匙叶甘松 Nardostachysjata-
mansiDC的干燥根及根茎 [ 1]。它具有多种药理作用。实验与临
床研究证明 ,甘松是一种安全有效的抗心律失常药物 [ 2, 3] 。甘松
挥发油是甘松有效浓缩成分 [ 4] 。有研究报道 , 甘松挥发油对大
鼠单个心室肌细胞有明显的内向电流阻滞作用 [ 5 , 6] 。但是甘松
挥发油对单个心室肌细胞其他离子通道的影响目前还未有报道。
本实验采用全细胞膜片钳技术 ,通过动物实验观察甘松挥发油对
大鼠心室肌细胞膜瞬时外向钾电流(Transientoutwardpotassium
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curent, Ito)的影响 ,并进一步探讨甘松挥发油抗心律失常作用的
离子机制。
1　材料
1.1　动物 体重 250 ～ 350 g成年 Wistar大鼠 , 雌雄兼用 , 由南昌
大学医学院动物中心提供。
1.2　药物及试剂 甘松挥发油经称取阴干后的甘松样品 1 000
g, 按《中国药典》(Ⅰ部)甲法 [ 7]进行水蒸馏提取 , 经 6 h后停止
加热 , 静置过夜 ,油水相分离后得浅绿色油状液体 ,用双向溶剂二
甲基亚砜 , 按 1:200的比例进行稀释 。 I型胶原酶(collagenase
I)、HEPES(N-2 -羟乙基哌嗪 -N-2 -乙磺酸), CsCl(氯化
铯),谷氨酸 , TEA-Cl(氯化四乙胺), Na2ATP, EGTA为 Sigma公
司产品 , 其它试剂均为国产分析纯。
1.3　实验溶液 无钙台氏液为(mmol/L):NaCl136, KCl5.4,
MgCl2 1.0, NaH2PO4 0.33, HEPES10, Glucose10, 用 NaOH调 pH
至 7.4。 KB液为(mmol/L):KCl40, KH2PO4 20、MgSO4 3.0, KOH
80,谷氨酸 50, 牛磺酸 20, HEPES10, Glucose10, EGTA 0.5, 用
KOH调 pH至 7.4。 Ito细胞外液为(mmol):NaCl140, KCl4,
CaCl
2
1.5, CdCl
2
0.5, MgCl
2
1, HEPES5, Glucose10, 用 NaOH调
pH值至 7.4。 Ito电极内液为 (mmol/L):KCl140, MgCl
2
1,
HEPES10, EGTA5, K
2
ATP5, 用 NaOH调 pH值至 7.3。
1.4　仪器 膜片钳放大器(Axopatch200B)及 DigiData1200B型
数 /模(或模 /数)转换器均为美国 Axon公司。
2　方法
2.1　单个大鼠心室肌细胞的制备 以 5 U/g肝素钠对分离大鼠
进行腹腔内注射 , 10 ～ 15min后以 1%戊巴比妥钠 50 mg/kg腹腔
内注射麻醉 , 迅速开胸取出心脏 , 放入 4℃无钙液中 ,离体心脏修
饰后经主动脉挂在 Langendorf灌流仪逆行用无钙台氏液经主动
脉逆行灌流 5 min, 通以 100%纯氧。 10 min后以浓度分别为 0.6
～ 0.7g/LI型胶原酶 , 0.04 ～ 0.06 g/L蛋白酶 E, 0.3 ～ 0.5 g/L
牛血清白蛋白(BSA)和 50 μmol/L低钙酶液灌流心脏。 30 min
左右心脏松软后 , 改 180 ～ 200 μmol/L低钙台氏液灌流心脏 5
min,温度维持在 36 ～ 37℃,灌流过程中始终予以氧气饱和 , 氧流
量 0.3 ～ 0.5 L/min。 5 min后 , 将心脏从灌流装置上取下 , 剪除心
房和乳头肌 , 留下心室肌组织块置于盛有 KB液的烧杯中充分剪
碎 、轻轻吹打 、100目尼龙网过滤 ,以去除可能影响离子流记录的
组织碎片。过滤后置于 KB液中室温下孵育 1 ～ 2 h, 然后置于
4℃冰箱中保存。
2.2　膜片钳全细胞记录 选取纹理清晰 、杆状和大小适中的细胞
在室温下进行实验 , 将适量细胞加入体积约 1.5 ml平放于倒置
显微镜上的细胞池中 , 贴壁 10 min后 , 用灌流法加药 , 流速约 1.5
ml/min。在电极拉制仪分两部拉制电极 , 电阻 1 ～ 2 MΨ。电极内
灌以电极液 , 置于推进器上 ,通过三维操纵器驱动电极 ,并轻压在
细胞表面 , 用负压使电极与细胞表面形成高阻封接后 ,补偿快电
容并吸破细胞膜形成全细胞记录模式。 调节慢电容补偿和串联
电阻补偿 80% ～ 90%以减少瞬时充放电电流和钳位误差。信号
经截止频率为 1 kHz的四阶贝塞尔低通滤波器 , 采样率为 10
kHz。实验在室温(22 ～ 24℃)下进行。实验过程由 pCLAMP9.0
软件程序(AXON, 美国)控制 , 通过 AD/DA转换板(AXONDigi-
Data1200,美国),进行刺激发放和信号采集 , 并存储于计算机硬
盘中 , 供测量及分析用。 为消除细胞间误差 , 电流值以电流密度
(pA/pF)表示。
2.3　统计分析 采用 pCLAMP9.0软件对单个全细胞记录进行数
据和图形转换 , Origin7.0软件对数据进行曲线拟合及绘制浓度
-剂量曲线 , 离子通道电流密度 -电压曲线 , 电流密度(pA/pF)
=电流强度 /电容;激活 -失活关系曲线。 所有数据以 x±s表
示 , 用 SPSS13.0统计软件做统计分析 , 采用配对样本 t检验。
3结果
3.1　甘松挥发油对 Ito峰电流的影响 在形成全细胞状态后 ,在
电压钳模式下 , 细胞钳制电位(holdingpotential, HP)在 -40 mV,
从指令电位(commandpotential, CP)-40 mV逐步除极至 +70
mV,阶跃 +10 mV, 钳制时间(clamptime, CT)40 ms, 刺激频率
0.5Hz,记录 Ito。然后 , 用灌流法给药 , 分别以含甘松浓度 3, 6,
10, 和 20 μg/g的细胞外液灌流细胞 5 min。在 +70 mV时 ,不同
浓度的甘松挥发油分别阻断 Ito峰电流(27.01 ±6.93)%,
(51.13±9.82)%, (80.86 ±4.63)%和(94.81±4.30)% (n=
5)。
将算出的各浓度抑制率为纵坐标作图 , 并取其对数 , 得出剂
量 -抑制率的关系曲线(图 1 ～ 2), 然后采用 I=ImaxCn/(Cn+EC50n)方程进行拟合 , 得出半数有效浓度(EC50)和斜率因子(S)。半数有效浓度(EC50)值为:(5.782 ±1.118)μg/g;斜率因
子(S)为:1.785±0.492。
通过分析甘松挥发油对 Ito作用的量 -效曲线 ,可以表明甘
松挥发油可呈浓度依赖性抑制大鼠心室肌细胞 Ito峰值电流。
a-用药前　b-甘松挥发油 6μg/g灌流 5min
c-细胞外液灌流冲洗 5min
图 1　甘松挥发油 6μg/g对大鼠心室肌细胞 Ito的影响
图 2　甘松挥发油 6μg/g抑制大鼠心室肌细胞Ito的量 -效曲线
3.2　甘松挥发油对 Ito的电流密度 -电压关系曲线的影响 以膜
电位为横坐标 ,其相应的 Ito峰值电流为纵坐标 , 绘制电流 -电压
曲线(I-V曲线)。电流密度(pA/pF)=电流强度 /膜电容。 对
心室肌细胞用含 6 μg/g甘松挥发油细胞外液灌流 , 发现含 6μg/
g甘松挥发油浓度的细胞外液使 I-V曲线下移(见图 3)。 在
+70 mV时 ,甘松挥发油(6 μg/g)使 Ito峰电流从(23.081±0.
74)pA/pF减少到(11.232±1.47)pA/pF(n=5, P<0.05), 给药
前后抑制率约为 50%,差异有统计学意义。
图 3　甘松挥发油(6μg/g)对大鼠心室肌细胞 Ito
电流密度 -电压曲线的影响
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时珍国医国药 2009年第 20卷第 8期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2009VOL.20NO.8
3.3　甘松挥发油对 Ito激活动力学的影响 观察 Ito的激活动力
学特征 , 将 I-V曲线的结果转换为膜电导 , 对条件刺激电压作
图 , 然后采用 Boltzmanne方程 I/Imax=1/{1 +exp-(V-V1/2)/K}进行拟合 ,式中得到 Ito激活曲线(图 4), 然后求得半数激活
电压(V1/2)和斜率因子(S)。 6 μg/g甘松挥发油灌流给药后 ,激
活曲线显示给药前后半数激活电压(V1/2)为:(36.063 ±1.792)mVvs(34.788 ±3.029)mV(P>0.05, n=5);斜率因子(S)为:
(22.972±1.491)mVvs(30.791±2.899)mV(P<0.05, n=5)。
给药前后半数激活电压变化无显著差异。
图 4　甘松挥发油(6μg/g)对 Ito激活曲线的影响
3.4　甘松挥发油对 Ito失活动力学的影响 稳态失活曲线 采用
双脉冲刺激法 , HP=-40mV, 条件脉冲 -100 ～ +20 mV, 钳制时
间 250 ms,阶跃 10mV, 每次条件脉冲后紧跟一固定的去极化到
+60mV的测试脉冲 ,持续时间 250ms,刺激频率 0.5Hz(图 5a)。
以相对电流 I/Imax为纵坐标 ,膜电位为横坐标绘制失活曲线 ,也采
用 Boltzmanne方程 I/Imax=1/{1 +exp(V-V1/2)/K}进行拟合 ,
式中得到 Ito失活曲线 (图 5), 然后求得半数最大失活电位
(V1/2)和斜率因子(S)。 6μg/g甘松挥发油使 Ito失活曲线明显
左移(P< 0.01, n=5)。对照组半数最大失活电位(V1/2)为:(-
33.738±0.476)mV, 斜率因子(S)为:(5.001±0.396)mV;6μg/g
甘松挥发油组半数最大失活电位(V1 /2)为:(-40.536±0.696)mV,斜率因子(S)为:(8.420±0.620)mV(图 5b)。
a-瞬时外向钾电流 Ito的稳态失活刺激方案
b-甘松挥发油(6μg/g)对大鼠心室肌细胞 Ito用药前后的稳态失活曲线
图 5　甘松挥发油(6ppm)对 Ito失活曲线的影响
4　讨论
本实验结果表明甘松挥发油呈浓度和电压依赖性抑制大鼠
心室肌细胞 Ito, 随着浓度增加阻断作用增强 , 且使失活曲线明显
左移 , 但对 Ito半数激活电压无明显影响。
心脏电活动表现为心肌动作电位(actionpotential, AP)形
成 , 包括除极和复极过程(0, 1, 2, 3和 4相)。 心肌动作电位的
形成需要多种离子通道的共同参与 , 0相是 INa激活 , 细胞除极;
1相是快速复极早期 , INa失活和 Ito激活;2相(平台期), 内向电流有 Ica-L、慢 INa等 , 外向电流有 Ik1、Ik。快速复极期 , Ica-L失活 ,
Ik和 Ik1逐渐增强。 3相复极的早期主要是 Ik的作用 , 后期 Ikl的
作用增强。 4期(静息期), 恢复到静息电位 , Ik1在维持静息电位
中起重要作用 [ 8] 。心肌细胞中各种钾通道电流是使心肌细胞动
作电位复极的主要电流 ,影响这些电流会明显改变复极过程 , 它
们在 0相除极以外的其他各项中均起到重要作用。
瞬时外向钾电流(Ito)是一种产生外向电流的电压依赖性钾
通道 , 在哺乳动物心肌细胞上存在明显的瞬时外向钾电流 , 它是
心肌细胞复极早期的重要离子流之一 ,其作用主要与动作电位的
复极 1相有关 , 该电流的大小对动作电位的形态和时程有较大影
响 [ 9] 。 Ito分两型:Ito1和 Ito2, Ito1对 4-氨基吡啶(4-aminopyr-
idine)敏感 , 又称 4-aminopyridine敏感型的瞬时外向钾电流;Ito2
依赖于肌浆网 Ca2+的释放 ,又称钙依赖性瞬时外向钾电流。 本
实验细胞外液中加入 CdCl2以阻断细胞外钙离子内流和电极内
液中含 EGTA螯合细胞内钙离子 , 从而达到阻断 Ito2而记录
Ito1。通常所指的 Ito为 Ito1, 与心律失常的发生关系密切。研究
表明 , Ito1虽分布于所有心肌细胞膜 , 但在心房肌和心室肌外膜
侧密度较高。在心室壁 ,从心内膜到心外膜 , Ito1密度逐渐增加 ,
引起从心室内膜到外膜动作电位 1相逐渐明显 ,导致两层细胞动
作电位形态截然不同 , 心外膜动作电位有明显的尖峰和圆穹
(spikeanddome), 而心内膜细胞则没有 [ 10] 。这种分布的异质性
是引起跨心肌壁复极不均一性的主要电流 ,也是引起 2相折返导
致室性心动过速和心室颤动的主要病理 、生理机制 [ 11] 。理论上
抑制 Ito应是治疗 2相折返性心律失常的有效措施。
本实验利用膜片钳技术 , 观察到甘松挥发油对心室肌细胞离
子通道 Ito有明显的抑制作用, 呈浓度和电压依赖性抑制大鼠心室
肌细胞 Ito, 使 I-V曲线下移, 同时 ,甘松挥发油对激活曲线没有
明显影响 ,而使失活曲线明显左移 , 给药前后半数失活电压和失活
斜率因子有显著统计学意义 , 提示甘松挥发油作用于通道的失活
态而非静息态或激活态 ,能加快钾通道的失活, 这样可能使心室肌
细胞复极化减慢 ,延长动作电位有效不应期(ERPdelay), 从而产
生抗心律失常作用 ,这也许是其抗心律失常作用机制之一。
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