全 文 ：第 23 期
收稿日期：2016－06－30
基金项目：国家自然科学基金项目（81160500）
作者简介：杨 妮（1988－），女，广西融安人，药师，硕士，主要从事中药分析和临床药学研究，（电话）15296500906（电子信箱）
642413556＠qq．com；通信作者，王 建，教授，（电话）13217810893（电子信箱）15296500906＠163．com。
第 55 卷第 8 期
2016 年 4 月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 55 No.7
Apr.，2016
2
1
1
Jan
3期
2月
Vol． 5 No.23
Dec.，
广西莪术（Curcuma kwangsiensis S．G．Lee et C．
F．Liang）为姜科姜黄属植物，以干燥根茎入药，其味
辛、苦，性温，具有行气破血、消积止痛的作用，是临
床上较为常用的活血化瘀药物 ［1］。 莪术挥发油有较
好的抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒作用［2］，尤其在治疗
肿瘤方面莪术具有很大的开发潜力［3－5］。广西莪术习
称“桂莪术”，是广西主产道地药材，产区面积大，是
中国药典规定品种，但长期以来广西莪术的品种选
育和改良未受到足够的重视，广西莪术育种侧重于
常规技术，在分子水平上的研究有待开展 ［6］。 近年
广西莪术 SSR－PCR反应体系优化和引物筛选研究
杨 妮 1，苏伟敏 2，靳雅慧 2，王 建 2
（1．柳州市妇幼保健院药剂科，广西 柳州 545000；2．广西中医药大学药学院，南宁 530001）
摘要：以广西莪术（Curcuma kwangsiensis S．G．Lee et C．F．Liang）嫩叶为材料，采用单因素和正交试验设计
建立和优化 SSR－PCR 反应体系和反应程序，对最适宜退火温度（Tm）进行筛选优化，对 17 对已公布的姜
黄属通用性引物进行扩增试验，筛选出多态性好、条带清晰的引物。 结果表明，建立了适合广西莪术 SSR
分析的反应体系和扩增程序，即在 15 μL 体系中，DNA 模板为 30 ng ／μL，3 μL，Mix（包含 DNTP、Mg2＋、1×
buffer、Taq 酶）为 5 μL，ddH2O 为 6 μL，引物为各 0．5 μL 时，分析效果较好，扩增程序为 94 ℃预变性 5
min；94 ℃变性 30 s，根据不同引物的退火温度复性 30 s，72 ℃延伸 1．5 min，共 35 个循环；最后 72 ℃延伸
5 min；反应结束后，4 ℃保存。同时筛选出在试验材料中能产生较清晰主带的引物共 12 对，初步验证了应
用 SSR 分子标记分析在广西莪术遗传多样性的可行性。
关键词：广西莪术（Curcuma kwangsiensis S．G．Lee et C．F．Liang）；SSR；PCR 反应体系优化；引物筛选
中图分类号：R283．6；R282．5 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2016）23－6271-05
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.067
Establishment of SSR－PCR Reaction System And Primers
Screening for Curcama kwangsinesis S.G. Lee C.F.Liang
YANG Ni1，SU Wei－min2，JIN Ya－hui2，WANG Jian2
（1．Liuzhou Maternity and Child Healthcare Hospital，Liuzhou 545000，Guangxi，China；
2．Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530001，China）
Abstract： The single factor analysis and orthogonal experimental design were used to establish and optimize SSR－PCR reaction
system andprocedures of Curcuma kwangsiensis S．G．Lee et C．F．Liang，and optimum annealing temperature （Tm） optimization．
The 17 published universal primers of Curcuma longa L. were used for amplification test，screened polymorphic and clear
bands of primers． The results showed that the establishment of a suitable Curcuma kwangsiensis S．G．Lee et C．F．Liang SSR
analysis of the reaction system and amplified procedure，namely in 15 μL system，DNA template 30 ng ／μL，3 μL，Mix（containing
DNTP，Mg2＋，1×buffer，Taq enzyme） of 6 μL，ddH2O to 5 μL，primers for the 0．5 μL，the analysis is better，amplification program
was 94 ℃ for 5 min，94 ℃ denaturation 30 s，depending on the primer annealing temperature annealing 30 s，72 ℃ extension 1．5
min，35 cycles，and finally 72 ℃ for 5 min，after completion of the reaction，4 ℃ preservation． While filtering out the test mate-
rial can produce clearer master with a total of 12 primer pairs validated the application of SSR markers in Curcuma
kwangsiensis S．G．Lee et C．F．Liang feasibility analysis of genetic diversity．
Key words： Curcuma kwangsiensis S．G．Lee et C．F．Liang；SSR；SSR－PCR reaction system；primers screening
湖 北 农 业 科 学 2016 年
表 2 广西莪术 SSR-PCR 反应体系浓度梯度
浓度梯度
1
2
3
4
5
模板 DNA //ng
20
30
40
50
60
引物//μmol/L
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
2×Taq PCR Master Mix//μL
4
5
6
7
8
表 1 SSR 分子标记所用引物
引物名称
SSR-01
SSR-02
SSR-03
SSR-04
SSR-05
重复单位
（CT）15
（CCT））12
（ATT）8
（AAAC）6
（CCTCTT）5
引物序列（5′－3′）
FP-TTTGAGATGGCGAGTAGAAC RP-ATGAGGGAAGAGAGGAGAAG
FP-ACCGTAGCAAAGAAATAGGAC RP-AAGGTGGAAGGAAACTCG
FP-AGGGAAAATAGAGTAGGCAAG RP-TGAAGGATTACAGTCAGCAAA
FP-ACACAACATTCAGTTTAGCAC RP-TCCCTATTCTTTCCTCTCG
FP-TATCCTCCCTGGTCGTTT RP-GATTCCCTTTCCTTTCTTTTG
退火温度 Ta//℃
60
62
62
58
65
产物大小//bp
189-157
204-152
188-172
185-175
199-191
来， 随着分子标记技术在植物遗传育种中的应用，
研究者在药用植物分子生物学研究领域已取得显
著成绩 ［7，8］，其中一个重要的方向是应用 DNA 分子
标记技术研究药用植物的遗传多样性、系统发育和
遗传连锁作图［9，10］。
微卫星（Microsatellites）或简单序列重复（SSRs）
是以 1～6 个碱基为基本单元的串联重复序列，具有
数量丰富、多态性高、信息含量丰富、共显性遗传等
优点，是一种较为理想的分子标记技术［11］。 近年来，
SSR在药用植物遗传育种中成为研究药用植物遗传
结构，进行分子标记辅助育种和种质资源保护研究
的重要工具。 由于 SSR 是一种基于 PCR 技术的分
子标记，其反应条件中的诸多因素都会对结果产生
影响，为保证 SSR－PCR 的重复性，建立和优化其反
应体系是十分必要的。 本研究主要目的是建立并优
化一种适用于广西莪术 SSR 分子标记研究的 PCR
反应体系和反应程序，筛选适用于广西莪术遗传多
样性分析的具有丰富多态性的 SSR 引物，以期为加
快广西莪术 SSR 分子标记的开发和分子遗传育种
的研究进程奠定科学基础。
1 材料与方法
1．1 材料
采自广西南宁市仙湖种植基地的同一批莪术
药材，4 个有效样本，经广西中医药大学药用植物教
研室王建教授鉴定为姜科植物广西莪术。
1．2 试剂
2％ CTAB 提取缓冲液、PVP（聚乙烯吡咯烷酮，
BASF）、RNase A；氯仿－异戊醇（24∶1）、平衡酚－氯仿
（1∶1）、异丙醇、TE Buffer、无水乙醇、75％冰醋酸，
MixPCR Mix 购自博瑞克生物技术公司， 试验试剂
均为国产分析纯。
1．3 仪器
FA1004 型电子天平（上海精科天平仪器厂），
Biospec－nano 型紫外－可见分光光度计（广州科能仪
器设备有限公司），Mini spin 型高速离心机（德国艾
本德公司），9700 型 PCR 扩增仪（北京利超兴业科
技有限公司）。
1．4 DNA提取方法
取广西莪术健康嫩叶 0．5～1．0 g， 采用改良的
CTAB法提取基因组 DNA［12］。 并用紫外分光光度计
检测 DNA 质量和浓度。 所用仪器为岛津紫外可见
分光光度计（BioSpec－nano），取 DNA 样品 1 μL 进
行测定，检测所提取样品 DNA 的纯度和浓度，再分
别计算产率。 每个样品重复 3 次，取平均值。 DNA
产率＝DNA 浓度×提取液体积 ／原材料质量。
1．5 PCR扩增反应体系优化
1．5．1 引物筛选 所用引物为已公布的姜黄属 17
对通用引物 ［13］，EST SSR－01～EST SSR－17，引物信
息见表 1。引物由上海生工生物技术有限公司合成。
1．5．2 PCR 反应体系单因素浓度梯度分析 在其
他试验条件一定的情况下 ， 对 PCR 反应体系的
DNA 模板浓度、 引物用量，2×Taq PCR Master Mix
用量进行浓度或用量梯度试验，分析不同处理条件
对 SSR引物扩增结果的影响。 反应体系浓度梯度见
表 2。 反应体系：DNA 模板 3 μL，Mix （包含 DNTP、
Mg2＋、1×buffer、Taq 酶）5 μL，ddH2O 6 μL， 引物 F、R
各 0．5 μL。 反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃
30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环；72 ℃ 8 min。 PCR 产物
扩增完成后于 4 ℃保存备用。
1．5．3 PCR 反应体系优化正交试验 采用 L9（34）正
交试验（表 3），对 DNA 模板浓度、引物浓度、2×Taq
PCR Master Mix 含量进行筛选。 试验各组合反应体
系均加 ddH2O补足至 15 μL。试验设 3次重复。正交
试验能减少重复试验次数，具有方法科学、试验结
果反映全面情况等优点［8］。
1．6 PCR扩增程序优化
1．6．1 SSR－PCR 扩增程序的单因素试验 PCR 扩
6272
第 23 期
增程序的关键因素包括变性时间、退火时间、延伸
时间、循环次数，对其进行梯度试验，分析不同处理
条件对 SSR引物扩增结果的影响（表 4）。
1．6．2 SSR－PCR扩增程序优化的正交试验 扩增程
序参照文献［14］进行设计，94 ℃预变性 5 min；94 ℃
变性 30 s，55 ℃（按特定引物特定温度）退火 30 min，
72 ℃延伸 45 s，共 35 个循环；72 ℃延伸 10 min，4 ℃
保存。 影响 SSR－PCR扩增的关键因素变性时间、退
火时间、延伸时间、循环次数作为筛选因素设计正
交试验， 采用优化后的反应体系进行 PCR 扩增，扩
增程序优化选用 L16（44）正交试验（表 5）。
1．6．3 退火温度筛选 在建立并优化后的 SSR－
PCR反应体系基础上，利用梯度 PCR对退火温度进行
优化筛选。设定退火温度为 51、53、55、57、59、61 ℃。
1．6．4 引物多态性筛选 采用优化的反应体系和
扩增程序进行 PCR反应扩增，从 17对公布的姜黄属
通用引物中，初步筛选获得在试验材料中能产生较
清晰条带的引物，观察产生多态性条带的情况，筛选
出能产生多态性的引物。
1．7 PCR扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳
7％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测：PCR 扩增
产物中加入 3 μL Loading Bufer （98％甲酰胺 ，10
mmol ／ L EDTA，0．05％溴酚蓝，0．05％二甲苯青）。 每
样品各取 1 μL 上样于 7％变性聚丙烯酰胺凝胶上，
在恒定 200 V 电泳 1．0 h。 用扫描仪扫描凝胶，得到
分析图片。
2 结果与分析
2．1 DNA 模板质量检测
对所提取 DNA 质量 ， 紫外可见分光光度计
（BioSpec－nano）进行检测纯度和浓度，检测结果表
明，试验提取的 DNA OD260/OD280值在 1．8～2．0之间，
浓度在 50 μg ／ mL左右，质量符合 PCR反应需要。
2．2 模板浓度对 PCR体系扩增的影响
在 SSR－PCR 扩增反应中，DNA 模板浓度是一
个重要的影响因子 ［15］。 DNA 模板质量浓度过低，无
法扩增出清晰条带或者扩增不稳定， 模板浓度过
高，则出现非特异性扩增，均无法达到很好的扩增
效果。本试验设置了 20～60 ng ／μL 5个 NDA模板浓
度进行优化，扩增结果见图 1。 从图 1 可以看出，模
板浓度在 20～50 ng ／μL 时均可以成功扩增出条带，
模板浓度为 30、40 ng ／μL时最为稳定； 当模板浓度
低于 30 ng ／μL时扩增条带较浅，而当模板质量浓度
大于 50 ng ／μL时，无法扩增出条带。因此，在单因素
研究中，最佳模板浓度为 30～40 ng ／μL。
表 3 SSR 反应体系正交试验
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
DNA 模板//ng
30.0
30.0
30.0
40.0
40.0
40.0
50.0
50.0
50.0
2×Taq PCR Master Mix//μL
4.0
5.0
6.0
4.0
5.0
6.0
4.0
5.0
6.0
引物//μL
0.4
0.5
0.6
0.4
0.5
0.6
0.4
0.5
0.6
表 4 SSR-PCR 扩增程序中各因素水平
水平
1
2
3
4
退火时间//s
15
30
45
60
变性时间//s
15
30
45
60
延伸时间//s
30
45
60
75
循环次数
30
35
40
45
因素
表 5 SSR-PCR 反应程序的正交试验因素
编号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
退火时间//s
15
15
15
15
30
30
30
30
45
45
45
45
60
60
60
60
变性时间//s
15
30
45
60
15
30
45
60
15
30
45
60
15
30
45
60
循环数
30
35
40
45
30
35
40
45
30
35
40
45
30
35
40
45
延伸时间//s
30
45
60
75
30
45
60
75
30
45
60
75
30
45
60
75
因素
图 1 DNA 模板浓度梯度 PCR 扩增结果
1 2 3 4 5
杨 妮等：广西莪术 SSR－PCR 反应体系优化和引物筛选研究 6273
湖 北 农 业 科 学 2016 年
2．3 SSR－PCR 正交反应体系的优化结果
根据 L9（33）正交试验设计的 9 个反应体系进行
优化，依照 SSR－PCR 反应扩增条带清晰度强弱、出
带情况，得出 2、3、4、5反应体系扩增出的条带比较清
晰（图 2），而反应体系 2 扩增效果最优。 即 DNA 模
板为 30 ng ／μL，3 μL，Mix（包含 DNTP、Mg2＋、1×buffer、
Taq酶） 为 5 μL， 正反引物各 0．5 μL，ddH2O补足至
15 μL（即加入 ddH2O 6 μL）时，分析效果较好。
2．4 SSR－PCR 反应程序正交试验结果
SSR－PCR 反应程序 L16（44）正交设计的 16 个组
合扩增结果如图 3所示。 随着变性时间、退火时间、
延伸时间以及循环次数的变化组合，不同处理条件
下 PCR扩增条带的深浅不一，效果参差不齐。 结合
前期研究以及正交试验结果得出反应程序 6 为最
佳方案，即变性时间 30 s，退火时间 30 s，延伸时间
45 s，循环次数 35。
2．5 退火温度筛选结果
从图 4 可以看出， 退火温度对 SSR－PCR 扩增
有明显的影响，退火温度低于 53 ℃时，主带不明显，
且扩增产生许多浅色的杂带；当退火温度高于 57 ℃
时，扩增条带稳定性变差；在退火温度为 55 ℃时条
带的稳定性和重复性较好，扩增效果较好，这与理
论［16］上的值［Tm＝2（A＋T）＋4（G＋C）］相一致。因此，选
取 55 ℃为该引物最佳退火温度。
试验初期对多种引物退火温度进行了优化，发
现退火温度 53 ℃以下，杂带多，扩增效率差，退火温
度 65 ℃以上，则无法扩增出清晰条带，扩增效率下
降。 而大部分引物在退火温度为 54～56 ℃可以得到
清晰具有多态性的条带。 为了加快广西莪术 SSR标
记的开发速度，本研究对引物退火温度统一设定为
55 ℃。 这不仅一定程度上减少了杂带的干扰，也为
了保证引物在不同种质中目标条带的扩增效率。
2．6 SSR－PCR 引物筛选结果
从姜黄属 17 对 SSR 引物中初步筛选出 14 对
可用于广西莪术的 SSR引物，占全部引物的 82．35％，
并对利用这 14 对引物对 4 份莪术材料统一进行
PCR 扩增，采用优化的反应体系和扩增程序，进一
步筛选获得在试验材料中能产生较清晰条带的引
物共有 12 对，这些引物是有效引物，适用于广西莪
术材料。 图 5、图 6 为引物 SSR－01～SSR－16 在 4 种
种质资源上进行 PCR扩增后扫描得到的电泳图。
3 小结与讨论
SSR－PCR 反应体系和反应程序的建立、优化及
退火温度和引物的筛选是 SSR 多态性标记开发和
应用的基础。 由于本研究中 SSR－PCR 反应体系所
含组分多，且均可能对扩增的特异性、敏感性以及
产量变化产生影响，因此建立一套良好的反应体系
M 为 DNA－Marker；1－9 为处理编号
图 2 L9（33）正交反应体系扩增结果
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1～16 为处理编号
图 3 SSR－PCR 反应程序的正交试验电泳结果
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
1～3．51 ℃；4～6．53 ℃；7～9．55 ℃；10～12．57 ℃；13～15．59 ℃；16～18．61 ℃
图 4 不同引物退火温度的电泳结果
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
图 5 引物 SSR－01～SSR－08 PCR 扩增结果
图 6 引物 SSR－09～SSR－16 PCR 扩增结果
6274
第 23 期
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（上接第 6270页）
是保证分子标记开发稳定性的基础。 SSR 反应体系
优化的方法较多，常规的方法是进行多次单因素试
验，缺点在于当一种组分浓度发生变化时，其余几
种组分浓度往往靠经验确定，因此难以确定最佳组
合［16］。 正交试验反应体系设计可有效地解决单因素
试验次数繁多、工作量大、试验周期长等问题，将各
因素、各水平之间的组合均匀搭配、合理安排，同时
PCR 扩增产生高度特异灵敏度，因此具有科学性和
可行性。 本试验采用正交试验，优化后的 SSR－PCR
反应体系在后续 SSR 分析中得到了验证。
PCR 反应时，退火温度是影响 PCR 特异性的较
重要因素［17］。在理想状态下，退火温度足够低，以保证
引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少
非特异性结合。 退火温度和时间取决于引物长度及
碱基组成及其浓度，还有序列的长度［18］。 GC含量越
高退火温度越高，引物设计时的 Tm值减去 5～8 ℃即
是引物的退火温度， 本研究设计的引物序列长 16～
25 bp，G＋C 含量 40％～60％，发现合适的温度在 55～
58 ℃，退火时间一般是 30 s。 为了加快试验进度，因
此将 55 ℃做为最理想退火温度。 SSR 引物的筛选需
要经过 PCR 扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据出带
情况，经过重复试验，筛选出具有多态性，条带清晰
的引物，才能满足种质资源多态性分析要求。
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杨 妮等：广西莪术 SSR－PCR 反应体系优化和引物筛选研究 6275