全 文 ：Methods:To induce the painful diabetic peripheral neuropathy，STZ was applied to make diabetic peripheral neuropathy and 15 days after，
three different doses (40mg /kg，20mg /kg，10mg /kg，po)of asiaticoside and Minocycline (80mg /kg，ip)were administrated for 7 days．
The threshold of rats to noxious heat (hot plate)and innocuous mechanical stimulation were tested after the STZ administration and the effects
of asiaticoside on morphology and functions of spinal microglia were tested with immunohistochemistry and ELISA． Ｒesults:Painful diabetic
peripheral neuropathy was fully induced by STZ administration． Compared to control group，Minocycline and asiaticoside (40mg /kg，20mg /
kg)significantly upregulated the thresholds of pain to heat and mechanical stimulation． Moreover，the administration of Minocycline and asi-
aticoside significantly suppressed the activation and proliferation of spinal microglia and decreased the cytokine release． Conlusion:Asiatico-
side can suppress Painful diabetic peripheral neuropathy induced by Diabetic Peripheral Neuropathy and the mechanism perhaps be involved
in its affecting on Pathological changes of spinal microglia．
Key words asiaticoside(积雪草苷) ;painful diabetic peripheral neuropathy;microglia
保护性自噬对吉祥草皂苷 ＲCE-4 诱导的人宫颈癌 Ca Ski细胞凋亡的抑制作用*
王桂萍1，付雪娇1，邹 坤1，2，张 秀1，陈剑锋1，2＊＊
(1三峡大学化学与生命科学学院，宜昌 443002;2天然产物研究与利用湖北省重点实验室，宜昌 443002)
摘 要 目的:明确甾体皂苷 ＲCE-4 处理 Ca Ski 细胞后诱导细胞发生自噬，并探讨自噬对 ＲCE-4 诱导的细胞凋亡的影响。
方法:光学显微镜观查自噬抑制前后细胞形态的变化，透射电镜观察 ＲCE-4 诱导 Ca Ski 细胞自噬以及凋亡之后细胞形态的变化;
MTT法检测自噬活性抑制之后 ＲCE-4 细胞毒活性变化;流式细胞仪检测自噬抑制之后细胞凋亡率的变化。结果:MTT结果表明，自
噬抑制剂 3-MA存在的情况下，ＲCE-4 的细胞毒活性明显增强，ＲCE-4 浓度为 5μM时，自噬抑制之后，抑制率由 93%降低至 66%，Ca
Ski细胞的 IC50由 5． 1μM下降至 2． 6μM，流式细胞仪检测自噬抑制之后细胞凋亡率的变化发现，细胞凋亡率由 12． 1%增加到 23．
0%。结论:ＲCE-4 诱导的 Ca Ski细胞保护性自噬对其诱导的细胞凋亡具有抑制作用。
关键词 吉祥草皂苷 ＲCE-4;自噬;凋亡;自噬抑制剂
细胞有多种方式激活自我毁灭的过程，称为细胞程序性死
亡(programmed cell death，PCD)。目前研究较深入的是凋亡
(PCDⅠ) ，近年来发现除凋亡之外，还存在另外一种重要的程序
性死亡———自噬(PCD Ⅱ) ，自噬是细胞对内外环境压力变化的
一种保护性反应，能够在细胞缺乏营养及能量供应时，降解蛋
白质及细胞器重新获得营养和能量以维持细胞生存［1］。但在
肿瘤细胞中的自噬活动可以被一些治疗因素过度激活，导致自
噬性细胞死亡可以杀灭肿瘤细胞［2］。另有文献报道［3］自噬和
凋亡是动态相关的，抑制自噬会促使凋亡发生的时间提前，换
言之就是自噬的激活也会促进凋亡的发生。
甾体皂苷具有良好的诱导细胞凋亡的活性，本实验室采用
MTT法对实验室化合物库中的化合物进行肿瘤细胞毒活性筛
选，成功筛选出一个对人宫颈癌细胞 Ca Ski具有较强细胞毒活
性的化合物(1β，3β，5β，25S)-螺甾烷-1，3-diol1-［α-L-鼠李糖-
(1→2)-β-D-木吡喃糖苷］。该化合物从百合科吉祥草属植物
吉祥草(Ｒeineckia Carnea(Andr．)Kunth．)分离纯化获得，是一
种螺旋甾烷醇皂苷，分子式为 C38 H62 O12，命名为 ＲCE-4。该化
合物由 K． Miyahara［4］等首次从万年青根茎中分离得到，但未见
其抗肿瘤活性的报道。文献［5］报道知母皂苷与该化合物结构
相似，能够在促进细胞凋亡之前诱导细胞发生自噬。在本实验
中，利用自噬抑制 3-MA剂将 ＲCE-4 诱导的自噬抑制之后，观察
自噬对凋亡的影响。
1 材料和方法
1． 1 试验药物 取吉祥草干燥根茎烘干粉碎，95%乙醇 75℃
浸提 5 次，减压浓缩得浸膏，浸膏用水悬浮，依次用石油醚、乙酸
乙酯萃取，浓缩。乙酸乙酯部位过 200-300 目硅胶得 ＲCE-4 粗
提物，甲醇重结晶之后经 Sepdax 凝胶柱纯化得化合物 ＲCE-4，
结构如图 1 所示:
图 1 甾体皂苷 ＲCE-4 的化学结构
1． 2 细胞 CaSK细胞，武汉大学中国典型培养物保藏中心供
应。
1． 3 试剂 胎牛血清，杭州四季青生物材料有限公司;HEPES、
胰蛋白酶、丙烯酰胺、谷氨酸、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯
基四氮唑溴盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO) ，美国 Amresco 公
24 中药药理与临床 2013;29(5)
* 基金项目:国家自然科学基金面上项目( 31070313，21272136) ＊＊通讯作者
司;自噬抑制剂 3-MA:美国 sigma;其他试剂均为市售分析纯。
1． 4 主要仪器 ELX800NB 酶标仪(BioTek) ;倒置显微镜(O-
lympus CKX41) ;CO2 培养箱(Thermo 3111) ;超薄切片机(奥地
利莱卡 ULTＲACUT Ｒ) ;透射电子显微镜(日本日立 H-7500)。
1． 5 方法
1． 5． 1 MTT法检测自噬抑制之后 ＲCE-4 对 Caski细胞增殖的影
响 收集对数生长期 Ca Ski细胞，调整细胞悬液浓度并以1 ×105
的细胞浓度种 96 孔板，每孔加入 100μl，四周用 PBS 封，于 5%
CO2，37℃培养箱孵育，待细胞贴壁后分别添加①正常细胞组，细
胞培养孔中仅加入相同体积的完全培养基;②阳性药物组，于细
胞培养孔中加入终浓度为 50μg /ml 的丝裂霉素;③ＲCE-4 处理
组，于细胞培养孔中加入终浓度为 2、2． 5、3、3． 5、4、5、6、10μM;④
自噬抑制剂 3-MA处理组，设置 3-MA浓度梯度检测其安全使用
浓度;⑤3-MA 与 ＲCE-4 共同作用组，3-MA 作用浓度为 8mM，
ＲCE-4浓度依次为 2、2． 5、3、3． 5、4、5、6、10μM。每组 3个复孔，药
物作用 24h后 OD 490测定吸光度，根据公式:抑制率 =(1 －给药
组 OD490 /正常组 OD490)×100%计算抑制率。
1． 5． 2 光学显微镜观查自噬抑制前后细胞形态的变化 用 6
孔板培养 Ca Ski细胞，待细胞贴壁生长之后，加入①ＲCE-4 对照
组，于细胞培养孔中加入终浓度为 10μM的 ＲCE-4;②自噬抑制
剂 3-MA与 ＲCE-4 共同作用组，3-MA 作用浓度为 8mM，ＲCE-4
浓度为 10μM;③设置空白对照，药物作用 24 小时之后，在光学
显微镜下观察细胞形态的变化并记录。
1． 5． 3 透射电镜观察 ＲCE-4 诱导 Ca Ski细胞自噬以及凋亡细
胞形态的变化 培养瓶培养 Ca Ski细胞，贴壁覆盖瓶底的 80%
左右时加入浓度为 10μM 的 ＲCE-4 以及 8mM 的 3-MA 于 5%
CO2，37℃培养箱培养 24h，同时设置空白对照以及 ＲCE-4、3-MA
单独处理组。移液枪轻轻吹打并用原培养基 1000rpm 离心
10min收集细胞，冷 PBS洗涤 2 次之后用 2． 5%戊二醛-1%锇酸
固定，然后用 1%醋酸铀块染 2h，再依次用 50%、70%、80%、
90%丙酮脱水各 10min，最后用 100% 丙酮脱水两次，每次
10min，然后用环氧树脂浸透、包埋样本，并制备超薄切片，最后
用醋酸铀染色并用电镜观察超薄切片，做好相关的观察记录和
底片号，洗片、扫描切片结果。
1． 5． 4 流式细胞仪检测自噬抑制之后细胞凋亡率的变化 细
胞瓶传代培养细胞，细胞贴壁生长至 80%左右时，加入①ＲCE-4
对照组，ＲCE-4 终浓度为 10μM;②自噬抑制剂 3-MA 与 ＲCE-4
共同作用组，3-MA作用浓度为 8mM，ＲCE-4 浓度为 10μM，设置
空白对照，药物作用 24h后用不含 EDTA 的胰酶消化收集(胰
酶消化时间不易过长，以防引起假阳性) ;用 PBS 洗涤细胞 2 次
(2000rpm，5min) ，调整细胞浓度至 1 × 105;用 400ml Binding
Buffer 悬浮细胞;加入 5ml Annexin V-FITC，混匀，加入 5ml Pro-
pidium Iodide，混匀之后室温避光反应 10 min;用流式细胞仪检
测细胞凋亡率。
2 结果
2． 1 ＲCE-4 对 Ca Ski细胞存活率的影响 单独使用 ＲCE-4 以
及 ＲCE-4 与 3-MA共同作用都能显著抑制 Ca Ski 细胞的增殖，
并在确定的作用时间内呈现一定的量效关系。单独使用 3-MA
处理细胞，与空白组比较没有显著性差异;当 ＲCE-4 浓度高于
6μM时，3-MA的存在对细胞抑制率没有影响，抑制率都能达到
95%以上;当 ＲCE-4 浓度在 2 ～ 4μM 之间时，随着 ＲCE-4 浓度
的增加，3-MA的存在显著地增强了 ＲCE-4 的细胞毒性，抑制率
明显高于 ＲCE-4 单独作用;3-MA存在下，ＲCE-4 对 Ca Ski 细胞
的 IC50由 5． 1μM减少到 2． 6μM，变化了接近 2 倍。实验结果表
明，ＲCE-4 诱导 Ca Ski细胞发生了保护性自噬，当自噬被抑制之
后，ＲCE-4 的细胞毒活性增强，结果见图 2。
图 2 ＲCE-4 和 3-MA对 Ca Ski细胞增殖的影响
2． 2 倒置显微镜观查抑制自噬增强药物的细胞毒性 采用倒
置显微镜观察药物处理 24h的 Ca Ski 细胞，发现对照组细胞呈
不规则长梭形或多角形，细胞排列紧密，边缘清楚，培养基内无
悬浮的细胞和碎片(图 3-A) ;单独使用 3-MA处理细胞，形态与
正常组相比没有明显的变化(图 3-B) ;单独使用 ＲCE-4 处理细
胞，细胞生长分裂受到抑制，部分细胞形态由正常的梭形变为圆
形，细胞膜完整，只有少量细胞破碎(图 3-C) ;用 ＲCE-4 和 3-MA
共同处理细胞，细胞全部变圆，大量细胞破碎(图 3-D)。实验结
果表明，采用抑制剂抑制了自噬能够影响并加强 ＲCE-4 的细胞
毒性。
A:空白对照; B: 8mM 3-MA处理; C: 10μM ＲCE-4 处理; D: 10μM ＲCE-4 与 8mM 3-MA 处理
图 3 倒置显微镜观察细胞形态变化( × 100)
2． 3 透射电镜观察 ＲCE-4 诱导 Ca Ski细胞凋亡和自噬 透射
电子显微镜是公认的检测凋亡和自噬最可靠的而且被广泛使
用的方法。电镜下可见正常细胞细胞膜、细胞核、微绒毛完整
(图 4-A) ;ＲCE-4 单独处理的细胞胞质浓缩，核皱缩，微绒毛丢
失，细胞内双层膜的自噬体 /自噬溶酶体大量形成(图 4-B) ，具
备细胞凋亡和自噬的典型特征;ＲCE-4 和 3-MA 共同处理的 Ca
34中药药理与临床 2013;29(5)
Ski细胞，细胞呈圆形，核固缩，表面微绒毛消失，细胞内只含有
少量的自噬体 /自噬溶酶体 (图 4-C) ;在高倍镜下观察细胞的
亚显微结构可见双层膜的自噬体与单层膜的空泡相互融合，形
成细胞内含物。实验结果表明，ＲCE-4 能够引起 Caski 细胞的
凋亡和自噬，使用抑制将自噬抑制之后，细胞仍然呈现凋亡状
态。
A:空白对照( × 6k) ; B: 10μM ＲCE-4 处理( × 6k) ; C: 10μM ＲCE-4 与 8mM 3-MA 处理( × 6k) ; D: 自噬泡( × 25k) ; t = 24h
图 4 透射电镜观察 Ca Ski细胞的凋亡和自噬
2． 4 流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化 Annexin Ⅴ和 PI 双
染检测凋亡率，FITC-/PI +为凋亡早期细胞。8mM 3-MA 单独处
理细胞 24h后凋亡率为 5． 9%，较阴性对照组(凋亡率 3． 5%)比
较无差异;10μM ＲCE-4 处理细胞 24h 之后，可见细胞凋亡增
加，凋亡率达到 12． 1%，较对照组有显著性差异;ＲCE-4 与 3-
MA共同作用的细胞凋亡率为 23． 0%，与 ＲCE-4 单独处理组相
比有显著性差异。实验结果表明，ＲCE-4 诱导了 Ca Ski 细胞凋
亡和自噬，自噬被抑制之后，ＲCE-4 诱导 Ca Ski细胞凋亡的活性
增强，说明 ＲCE-4 诱导 Ca Ski细胞发生的自噬具有细胞保护性
作用，结果见表 1。
表 1 Annexin Ⅴ和 PI 双染检测各组 Ca Ski 细胞凋亡情况及结果
分析(珋x ± s，n = 3)
组别 浓度 凋亡率(%)
空白对照 3． 5 ± 0． 60
3-MA处理组 8mM 5． 9 ± 1． 09
ＲCE-4 处理组 10μM 12． 1 ± 1． 25＊＊
ＲCE-4 /3-MA 10μM +8MM 23． 0 ± 1． 66＊＊##
对照组比较 ＊＊ P ＜ 0． 01;ＲCE-4 /3-MA联合处理组和 ＲCE-4 处理
组比较 ## P ＜ 0． 01
3 讨论
近年来，有关凋亡和自噬在抗癌药和肿瘤的关系中的研究
以及在新药研发中日益受到关注，通过调控凋亡和自噬的关系
在抗肿瘤药物的开发以及肿瘤治疗中具有广阔的前景［6］。自
噬是真核细胞所特有的涉及亚细胞膜重构的非选择性动力学
过程，利用溶酶体大量降解大分子物质如蛋白质以及自身受损
的细胞器［7］。双层膜包裹部分胞浆和细胞内待降解的受损细
胞器、蛋白质等物质形成自噬小体，自噬小体形成之后与溶酶
体融合形成自噬溶酶体并降解其内成分。自噬的形态学特征
为细胞质中出现大量的自噬体和自噬溶酶体，可作为形态学检
查的依据［8］。
本实验运用光学显微镜观察 ＲCE-4 单独处理的细胞以及
ＲCE-4 和 3-MA共同作用的细胞发现，前者细胞生长分裂受到
抑制，部分细胞形态由正常的梭形变为圆形，细胞膜完整，只有
少量细胞破碎，具有细胞凋亡的宏观特征;而后者细胞全部变
圆，大量细胞破碎。实验结果表明，采用抑制剂抑制了自噬能够
影响加强 ＲCE-4 的细胞毒性。同时，利用透射电镜观察发现，
用 ＲCE-4 处理的细胞内膨胀圆形，胞质浓缩，核皱缩，微绒毛丢
失等特征，与文献［9］中描述的 SiHa细胞的凋亡形态一样;同时，
ＲCE-4 作用之后的细胞内出现大量的单层膜和多层膜的囊泡，
并且可见有融合现象，根据文献描述可知，这些都是自噬发生的
最显著的特征，即自噬体的产生以及它在细胞内的生理过程，继
而用自噬抑制剂 3-MA对 ＲCE-4 诱导发生了自噬的细胞加以处
理，发现自噬被显著性的抑制，由此可得，ＲCE-4 能够诱导 Ca
Ski细胞发生凋亡和自噬。
通过 MTT法检测 ＲCE-4 对 Ca Ski细胞的毒性发现，其 IC50
为 5． 1μM ，表明 ＲCE-4 能显著抑制 Ca Ski细胞的增殖，具有较
强的细胞毒性。与 ＲCE-4 和 3-MA共同作用下的 IC50(2． 6μM)
比较，3-MA抑制细胞自噬之后，ＲCE-4 的细胞毒性增强，流式细
胞仪检测细胞凋亡率发现，自噬抑制之后，凋亡率由 12． 1%上
升到 23． 0%，增加了近两倍，这些实验结果说明 ＲCE-4 诱导产
生的自噬具有细胞保护性，能够抑制 ＲCE-4 诱导的细胞凋亡。
徐玲［10］等发现 5-FU 不仅能诱导 MGC803 细胞凋亡，还能够诱
导其发生保护性自噬。
总之，ＲCE-4 在诱导 Ca Ski细胞凋亡时，也诱导了保护性自
噬。抑制自噬的发生能够增强 ＲCE-4 对 Ca Ski 细胞的杀伤作
用。但是 ＲCE-4 诱导 Ca Ski细胞自噬的机制尚不明确，仍需要
进一步实验来完善。
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Cytoprotective autophagy inhibits ＲCE-4-induced apoptosis in human cervical cancer cell line Ca Ski
Wang Guiping1，Fu Xuejiao1，Zou Kun1，2，Zhang Xiu1，Chen Jianfeng1，2
(1 College of Chemistry and Life Sciences，Yichang 443002;2 Hubei Key Laboratory of Natural Products
Ｒesearch and Development China Three Gorges University，Yichang 443002)
Objective:To investigate whether ＲCE-4 induces autophagy in human cervical cancer cell line Ca Ski and to identify the role of autoph-
agy in ＲCE-4-induced apoptosis． Methods:After cultured Ca Ski cells were treated with ＲCE-4，cell morphology was observed with trans-
mission electron microscopy and optical microscope;cell proliferation was measured using MTT assay;cell apoptosis was determined by flow
cytometry． Ｒesult:Apoptosis and autophagy，characterized by marked morphological changes in chromatin condensation，cell shrinkage，ap-
optotic vacuoles and autophagic vacuoles (autophagosomes and autolysosomes)were observed by transmission electron microscopy． ＲCE-4
signiflcantly inhibited cell proliferation of cell lines in a dose-dependent manner，autophagy inhibitor 3-MA markedly enhanced Ca Ski cells
IC50 dropped from 5． 1μM to 2． 6μM． The rate of cell apoptosis increased from 12． 1% to 23． 0% after cells treated by autophagy inhibitor 3-
MA． Conclusion:ＲCE-4-induced cytoprotective autophagy prevents Ca Ski cells from apoptosis．
Key words ＲCE-4(吉祥草皂苷 ＲCE-4) ;autophagy;apoptosis;autophagy inhibitor
黄芪甲苷对脂多糖诱导心肌细胞肥大的保护作用
*
鲁美丽，王洪新＊＊，张 静，杨 娟
(辽宁省心脑血管药物重点实验室，锦州 121000)
摘 要 目的:探讨黄芪甲苷( ASIV) 对脂多糖( LPS) 诱导心肌细胞肥大的保护作用及机制。方法:利用体外培养模型，以脂
多糖 1 mg /L诱导心肌细胞肥大，观察不同剂量黄芪甲苷( 12． 5、25、50 mg /ml) 及环孢菌素 A( CsA) 对脂多糖诱导的心肌肥大的抑制
作用。用考马斯亮蓝法测心肌细胞蛋白质含量;消化分离法及计算机图像分析系统检测心肌细胞体积;倒置荧光显微镜下观察细
胞形态大小;电泳法测定钙调磷酸酶( CaN) 的表达。结果:与正常对照组相比，脂多糖模型组使心肌细胞总蛋白质含量增加，细胞
体积增大，钙调磷酸酶表达增加。与模型组相比，黄芪甲苷( 25、50 mg /ml) 可有效改善脂多糖诱导的心肌细胞肥大，抑制钙调磷酸
酶表达增加，并呈一定的剂量依赖性。结论:黄芪甲苷可通过抑制钙调磷酸酶信号通路抑制脂多糖诱导的心肌细胞肥大。
关键词 黄芪甲苷;脂多糖;心肌肥厚;钙调磷酸酶
黄芪甲苷(Astragaloside IV，ASIV)为黄芪的有效成分之一，
具有抗炎、抗氧化、抗病毒、及器官保护［1 ～ 4］等广泛的药理作用。
本实验室的前期研究发现黄芪甲苷可通过降低细胞内 Ca2 +抑
制异丙肾上腺素诱导的心肌细胞肥大［5］，通过改善心肌能量代
谢的状态抑制腹主动脉缩窄所致的心肌肥厚［6］，而黄芪甲苷对
炎症诱导心肌肥厚的保护作用，目前研究甚少。脂多糖为格兰
仕阴性菌的主要致病成分，研究发现其可诱导心肌细胞凋亡，
肥厚等病理性改变［7，8］。本实验以脂多糖诱导的心肌细胞肥大
为模型，观察黄芪甲苷以及钙调磷酸酶抑制剂环孢菌素-A的作
用，进一步明确了黄芪甲苷对心肌保护作用的机制。
1 材料与方法
1． 1 试验药物 黄芪甲苷为成都曼斯特生物科技有限公司，
经高效液相色谱法鉴定纯度为 98%，使用时采用二甲基亚砜溶
解至相应浓度。环孢菌素-A购自美国 Sigma公司。
1． 2 动物 出生 2 ～ 3 d 的 SD 大鼠乳鼠，♀♂不拘，由辽宁医
学院实验动物中心提供，动物合格证号:scxK(辽)2003-0007。
1． 3 试剂 脂多糖、环孢菌素-A、鬼笔环肽、胰蛋白酶和低糖
DMEM培养基均购自美国 Sigma 公司，小牛血清为杭州四季青
54中药药理与临床 2013;29(5)
* 基金项目:辽宁省自然科学基金( 201102141) ; 国家自然基金项目:基于 TLＲ4 受体及炎症信号通路 NF － κB，黄芪有效成分对心肌肥厚的作
用机制研究。项目编号: 81374008 ＊＊通讯作者