全 文 ：网络出版时间:2015 －11 －18 10:12:34 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /KCMS/detail /34． 1065． Ｒ． 20151118． 1012． 010． html
乔松素预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用研究
周 甄1，马梦晴1，林先和2，刘和俊2
2015 － 07 － 07 接收
基金项目:安徽省自然科学基金(编号:1508085MH145)
作者单位:1安徽医科大学第二临床医学院，合肥 230032
2安徽医科大学第一附属医院心血管内科，合肥 230022
作者简介:周 甄，女，硕士研究生;
刘和俊，男，博士，教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，
E-mail:1981806821@ qq． com
摘要 目的 探讨不同浓度的乔松素预处理对大鼠心肌缺
血再灌注损伤(IＲI)的保护作用及其相关机制。方法 成年
SD大鼠 125 只，45 只用于前期筛选乔松素适宜用药浓度，另
80 只随机均分为假手术组，模型组，乔松素低、中、高剂量
(3、10、30 mg /kg)组。通过结扎大鼠心左冠状动脉前降支
30 min并解开结扎线释放血流 2 h 建立大鼠在体 IＲI 模型，
乔松素组于缺血前 1 h尾静脉给药，模型建立后 HE 染色观
察心肌组织形态学改变;免疫荧光染色法检测自噬标志物
LC3 的表达及定位;TUNEL原位标记凋亡心肌细胞;Western
blot法检测凋亡蛋白 Bax、Caspase-3 及自噬蛋白 LC3、p62 的
表达。结果 HE染色结果显示，合适浓度的乔松素能有效
改善心肌组织病理学改变，且呈剂量依赖性，但剂量较高时
可能具有毒性作用;免疫荧光染色显示乔松素组 LC3 表达
明显较模型组增多，在胞质中广泛表达，且呈剂量依赖性;
TUNEL染色结果显示，乔松素组与模型组比较，凋亡细胞均
明显减少，且高剂量组优于中、低剂量组;Western blot 结果
显示，乔松素组 Bax、Caspase-3、p62 蛋白表达水平较模型组
明显降低(P ＜ 0. 05) ，且高剂量组效果更佳(P ＜ 0. 01) ;乔
松素组 LC3 表达水平高于模型组(P ＜ 0. 05) ，且高剂量组增
高优于中、低剂量组(P ＜ 0. 01)。结论 乔松素预处理对大
鼠心肌 IＲI有保护作用，其主要作用机制可能与减少细胞凋
亡和激活自噬有关。
关键词 乔松素;心肌缺血再灌注;细胞凋亡;自噬
中图分类号 Ｒ 542． 2;Ｒ 932
文献标志码 A 文章编号 1000 － 1492(2015)12 － 1729 － 05
冠心病是一种常见心血管疾病，随着医学技术
的发展，溶栓疗法、经皮腔内冠脉介入、冠状动脉旁
路移植等再灌注疗法取得了良好的治疗效果，但针
对治疗中出现的心肌缺血再灌注损伤(ischemia /
reperfusion injury，IＲI)却没有理想的预防和治疗方
法［1］，其损伤机制可能与细胞凋亡、氧自由基过多、钙
超载、炎症反应等有关［2］。乔松素是一种存在于植物
和蜂胶中的含量较高的黄酮类天然化合物，具有抗
菌、抗原虫、抗诱变、抗氧化、抗凋亡等多种药理学活
性［3］。研究［4］证实在大鼠脑 IＲI模型中，乔松素参与
抑制凋亡和激活自噬拮抗 IＲI，但对于心肌 IＲI 是否
有效尚未见报道。该研究通过建立大鼠心肌 IＲI 模
型，以细胞凋亡和自噬为研究对象，研究乔松素预处
理对大鼠心肌 IＲI的干预作用及相关机制。
1 材料与方法
1． 1 药品与试剂 乔松素购自北京莱耀生物公司
(产品编号:LY0734) ;荧光二抗、HＲP-羊抗小鼠 IgG、
DAPI购自上海碧云天生物技术研究所;鼠源抗鼠
p62、Caspase-3、Bax 抗体均购自美国 Abcam 公司;
LC3-B 购自德国 Sigma 公司;鼠源抗鼠 GAPDH、
TUNEL染色试剂盒购自南京凯基生物公司;兔抗 ac-
tin抗体购自武汉博士德生物公司;ECL发光试剂盒、
BCA-100蛋白质定量试剂盒购自美国 Thermo公司。
1． 2 实验动物 125 只成年健康雄性 SD 大鼠，SPF
级，重 200 ～250 g，购自安徽医科大学实验动物中心。
1． 3 动物模型制备及给药方案 125 只大鼠中将
45 只均分为 9 组，分别为假手术组、IＲI 组(模型
组)、乔松素(1、3、10、20、30、40、50 mg /kg)组。用
药组浓度参考相关文献［4 － 5］设置，用于前期筛选乔
松素合适的用药剂量。剩余 80 只随机均分为 5 组，
分别为假手术组，模型组，乔松素低、中、高剂量(3、
10、30 mg /kg)组。其中 8 只用于 Western blot 法检
测，另外 8 只用于免疫荧光检测。给药方案:乔松素
组于缺血再灌注前 1 h尾静脉给药。乔松素粉剂使
用 DMSO溶解后生理盐水稀释配置相应浓度药物;
其余各组给予等量生理盐水。模型制备:5%戊巴比
妥钠 40 mg /kg腹腔麻醉大鼠后，经口腔气管插管，
接 HX300 小动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司) ，
调整呼吸频率 75 次 /min，潮气量 6 ml。于大鼠四肢
皮下插入电极连接 BL-420E 生物机能实验系统记
录大鼠心电图变化。在大鼠左胸第 3、4 肋间处通过
2 ～ 2. 5 cm 切口长度逐步钝性分离打开胸腔暴露心
脏。于左心耳下方 1 ～ 2 mm处使用 6-0 缝线结扎大
鼠左冠状动脉前降支 30 min 并解开结扎线释放血
流 2 h建立大鼠在体 IＲI 模型。缺血模型建立成功
·9271·安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2015 Dec;50(12)
标志:结扎线下心肌组织发白，心电图显示 ST 段明
显抬高。再灌注成功标志:心肌局部充血，ST 段逐
渐下降。造模结束后，处死大鼠摘取心脏称重后于
平行房室环水平处横切，HE 染色标本放置于 4%福
尔马林溶液中，其余心肌组织放入液氮速冻，然后转
入 － 80 ℃冰箱进行长期保存。
1． 4 检测指标和方法
1． 4． 1 心肌组织形态学 HE 染色 取左心室前壁
心肌组织，制作石蜡切块，切片后脱蜡行 HE 染色，
封片后于光学显微镜下观察各组大鼠心肌组织形态
学的变化。
1． 4． 2 免疫荧光染色检测 LC3 蛋白表达 将冰冻
组织从 － 80 ℃冰箱中取出，OCT包埋组织，冰冻，制
备冰冻组织切片(厚约 3 μm)。切片在室温下晾干
1 h，冷丙酮固定 10 min 晾干后置于切片盒中 － 20
℃冰箱保存。取出切片，PBS洗涤 3 次，每次 3 min，
1%小牛血清室温封闭 15 min，同时加入 LC3 和 ac-
tin抗体(稀释浓度均为 1 ∶ 1 000) ，4 ℃冰箱过夜。
次日孵育荧光二抗，DAPI复染 1 min，蒸馏水冲洗后
烘干，抗荧光猝灭剂封片，荧光显微镜(日本 Nikon
公司)下观察。
1． 4． 3 TUNEL原位标记法检测心肌凋亡细胞 冰
冻切片按照 TUNEL 试剂盒说明书步骤进行检测，
DAPI复染，荧光显微镜下观察。
1． 4． 4 Western blot法检测凋亡及自噬相关蛋白表
达 取 100 mg心肌组织，加入 1 ml 裂解液(含 100
mmol /L PMSF 10 μl，蛋白酶抑制剂 10 μl )后，用 2
ml组织匀浆器匀浆数次后，置于冰上 5 min，重复若
干次，待组织匀浆充分后，用移液管将匀浆液转移至
1. 5 ml EP管中，4 ℃、12 000 r /min 离心 15 min，取
上清液，使用 BCA 试剂盒进行蛋白定量检测，各组
上清液用裂解液调至相同蛋白浓度，加入 5 × SDS
蛋白上样缓冲液，沸水煮 5 min，进行 SDS-PAGE 电
泳并转膜于 PVDF 膜上，PVDF 膜用含 50 g /L 脱脂
奶粉的 TBST室温封闭 3 h。然后依次滴加1 ∶ 1 000
的鼠抗 p62、抗 Caspase-3、抗 Bax、抗 LC3 和 GAPDH
抗体，4 ℃孵育过夜后 TBST 洗涤 5 次，每次 5 min，
使用 1 ∶ 10 000 山羊抗鼠二抗孵育 1 h，TBST洗涤 5
次，每次 5 min。最后用 ECL发光液进行曝光显影，
Bio-Ｒad照相系统拍照，并用 Image-J 软件分析蛋白
的相对表达量。
1． 5 统计学处理 采用 SPSS 13． 0 软件进行分析，
计量资料以 珋x ± s 表示。多组均数之间比较采用单
因素方差分析，两两比较采用 LSD-t检验。
2 结果
2． 1 乔松素预处理对心肌组织形态学变化的影响
各组心肌组织 HE染色结果显示:假手术组心肌细胞
排列整齐，胞膜完整，界限清晰，胞质染色均匀;模型
组及乔松素 1 mg /kg 组心肌细胞排列不齐，界限不
清，胞质肿胀，染色不均，有炎性细胞浸润，肌纤维溶
解，部分细胞空泡变性;乔松素 3 mg /kg 组心肌细胞
排列不齐，界限不清，胞质肿胀，染色不均，有炎性细
胞浸润，空泡变性较模型组减轻;乔松素 10 mg /kg 组
心肌细胞排列较不齐，界限较清晰，胞质染色稍不均，
少量炎性细胞浸润，细胞水肿不明显;乔松素 20、30
mg /kg组细胞排列较整齐，界限较清晰，胞质染色较
均匀，仅有部分心肌纤维波纹样改变;乔松素 40、50
mg /kg组心肌细胞排列不齐，界限较不清，胞质较肿
胀，有少量炎性细胞浸润，可能与药物本身毒性有关。
根据上述实验结果，本课题分别设置乔松素 3、10、30
mg /kg为乔松素低、中、高剂量组进行进一步机制研
究，其中 30 mg /kg为最佳用药剂量，见图 1。
2． 2 自噬标志蛋白 LC3 免疫荧光染色结果 乔松
素组 LC3 蛋白表达明显较模型组增多，广泛在胞质
中表达，呈剂量依赖性，假手术组几乎无表达。LC3
表达的心肌细胞为黄色(心肌 actin蛋白绿色荧光和
LC3 蛋白橙色荧光叠加效果) ，如图 2 箭头所示。提
示乔松素预处理能明显增加大鼠心肌 IＲI 时细胞自
噬水平。
2． 3 TUNEL染色结果 乔松素组凋亡细胞明显较
模型组减少，且高剂量组效果更佳。凋亡后的心肌细
胞染色为绿色，如图 3箭头所示。提示乔松素预处理
可能通过抑制心肌细胞凋亡减轻大鼠心肌 IＲI。
2． 4 乔松素预处理对大鼠心肌凋亡蛋白 Bax 和
Caspase-3 表达的影响 Western blot结果显示，与模
型组比较，乔松素组凋亡蛋白 Bax和 cleaved-Caspase-
3表达均明显减少(P ＜0. 05) ，其中，乔松素高剂量组
相对于低、中剂量组减少更明显(P ＜ 0. 01) ，表明乔
松素预处理能明显减轻大鼠心肌 IＲI 时细胞凋亡的
发生，与 TUNEL染色结果一致，见图 4。
2． 5 乔松素预处理对大鼠心肌自噬相关蛋白 LC3-
Ⅱ和 p62 表达的影响 Western blot结果显示，与模
型组比较，乔松素组自噬蛋白 LC3-Ⅱ表达均明显增
多(P ＜ 0. 05) ，其中，乔松素高剂量组 LC3-Ⅱ表达量
相对于低、中剂量组增加更明显(P ＜ 0. 01) ;与模型
组比较，乔松素组自噬相关蛋白 p62 表达均明显降
低(P ＜ 0. 05) ，其中乔松素高剂量组p62表达量相
·0371· 安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2015 Dec;50(12)
图 1 大鼠心肌组织形态学染色 HE ×400
A:假手术组;B:模型组;C ～ I:乔松素 1、3、10、20、30、40、50 mg /kg组
图 2 LC3 蛋白免疫荧光染色 × 400
A:假手术组;B:模型组;C ～ E:乔松素 3、10、30 mg /kg组
图 3 TUNEL法荧光染色标记凋亡心肌细胞 × 400
A:假手术组;B:模型组;C ～ E:乔松素 3、10、30 mg /kg组
对于低、中剂量组减少更明显(P ＜ 0. 01)。表明乔
松素预处理能明显激活并增加大鼠心肌 IＲI 时细胞
自噬水平，与免疫荧光染色结果一致，见图 5。
3 讨论
心肌 IＲI是导致心律失常、心肌梗死、慢性心力
衰竭难以逆转的最主要、最常见的病理损伤，如何有
效预防其发生已成为心血管系统面临的重要难题。
研究［3］表明，乔松素在大鼠全脑缺血模型中，能够
有效改善大鼠神经行为学评分，减少神经元死亡和
梗死面积，提高大鼠存活率，并通过提高线粒体内
ATP的生成，有效保护线粒体结构形态，减少活性氧
·1371·安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2015 Dec;50(12)
图 4 Western blot法检测凋亡蛋白 Bax和 Caspase-3 在大鼠心肌 IＲI中的表达
A:Bax;B:Caspase-3;1:假手术组;2:模型组;3 ～ 5:乔松素 3、10、30 mg /kg组;与模型组比较:* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01
图 5 Western blot法检测自噬相关蛋白 LC3 和 p62 在大鼠心肌 IＲI中的表达
A:LC3;B:p62;1．假手术组;2:模型组;3 ～ 5:乔松素 3、10、30 mg /kg组;与模型组比较:* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01
生成，从而保护神经细胞拮抗 IＲI。研究［6］还证实
了乔松素能够通过保护大鼠微血管内皮细胞，减少
脑水肿和血脑屏障通透性，以及减轻血脑屏障超微
结构的病理改变抵抗全脑 IＲI。本实验显示乔松素
能有效改善并减轻心肌 IＲI 病理学损伤，并在一定
浓度范围内呈剂量依赖性，但浓度过高时可能会因
其药物毒性而加重损伤发生，本实验最佳用药剂量
为 30 mg /kg尾静脉给药。TUNEL 染色结果显示乔
松素组心肌凋亡细胞数目明显少于模型组;Western
blot结果也进一步提示乔松素组的凋亡蛋白 Bax 和
Caspase-3 表达水平均明显低于模型组，且高剂量组
效果更佳，表明乔松素可能通过抑制细胞凋亡拮抗
心肌 IＲI。
过去认为心肌细胞丢失的机制主要涉及心肌细
胞的坏死与凋亡，近年来，随着对细胞死亡方式的更
深层次的理解和探究，另一种细胞死亡方式 －自噬，
也参与该过程，其是细胞降解损伤的细胞器和多余
蛋白质等物质的主要途径［7］。乔松素已被证实在
脑 IＲI大鼠模型中能有效提高大鼠行为学评分，减
轻脑水肿及脑梗死面积，其保护机制可能与抑制凋
·2371· 安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2015 Dec;50(12)
亡和激活细胞自噬有关［4］。本实验中乔松素组的
自噬标志蛋白 LC3 表达明显高于模型组，p62 明显
低于模型组，并且呈剂量依赖性。免疫荧光染色提
示乔松素组 LC3 蛋白表达水平明显高于模型组和
假手术组，表明乔松素能有效激活细胞自噬，并呈剂
量依赖性，提示可能通过激活自噬参与拮抗心肌
IＲI，推测可能与改善能量平衡代谢障碍、清除代谢
废物、减少氧自由基形成及参与抑制细胞凋亡有关，
具体作用机制有待进一步研究。
参考文献
［1］ 潘国焰，林 荣． 心肌缺血 /再灌注损伤保护作用机制的研究
［J］． 医学综述，2013，19 (8) :1368 － 72．
［2］ 位 凯，王 飞，张 瑾，等． 天麻素预处理减轻大鼠心肌缺血
再灌注损伤的可能机制［J］． 安徽医科大学学报，2014，49
(6) :756 － 8．
［3］ 时丽丽，强桂芬，高 梅，等． 匹诺塞林对脑线粒体呼吸功能的
促进作用［J］．药学通报，2011，46 (6) :642 － 9．
［4］ Zhao G，Zhang W，Li L，et al． Pinocembrin protects the brain a-
gainst ischemia-reperfusion injury and reverses the autophagy dys-
function in the penumbra area［J］． Molecules，2014，19 (10) :
15786 － 98．
［5］ Wang S B，Pang X B，Gao M，et al． Pinocembrin protects rats a-
gainst cerebral ischemic damage through soluble epoxide hydrolase
and epoxyeicosatrienoic acids［J］． Chin J Nat Med，2013，11(3) :
207 － 13．
［6］ Meng F，Liu Ｒ，Gao M，et al． Pinocembrin attenuates blood-brain
barrier injury induced by global cerebral ischemia-reperfusion in
rats［J］． Brain Ｒes，2011，1391:93 － 101．
［7］ 赵红星，丁佩山，刘荣玉． 吞噬及饥饿诱导巨噬细胞自噬对其
吞噬功能的影响［J］． 安徽医科大学学报，2011，46 (5) :401 －
4．
The protective effect of pinocembrin pre-conditioning
on rats after myocardial ischemic-reperfusion injury
Zhou Zhen1，Ma Mengqing1，Lin Xianhe2，et al
(1The Second Clinical Medical College of Anhui Medical University，Hefei 230032;
2Dept of Cardiology，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022)
Abstract Objective To investigate the protective effect and its mechanism of pinocembrin pre － conditioning on
rats after myocardial ischemic － reperfusion injury(IＲI)． Methods 45 male sprague － dawley rats were used for
exploring the suitable concentration of the pinocembrin and 80 rats were equally divided into 5 groups:sham group，
model group，low，middle，high dose (3，10，30 mg /kg)group． The IＲI models were set up by ligating rat＇s left
anterior descending coronary artery for 30 minutes then loosing it for 2 hours． Pinocembrin was gave 1 hour via tail
intravenous injection before ischemic － reperfusion． The morphological changes of myocardial tissues were observed
by HE staining． The LC3 expression and position were measured by immunofluorescence． The apoptosis of myocar-
dial cells was measured by TUNEL staining． The expression of apoptosis － related protein such as Bax，Caspase-3，
p62 and autophagy-related protein，LC3 were detected by Western blot． Ｒesults HE staining showed that the path-
ological changes of myocardial tissues were improved by pinocembrin and presented a dose-dependence． However，
high-dose of drug might bring the drug toxicity． The expression of LC3 was more in the test group than the model
group as evidenced by immunofluorescence staining and in a dose dependent fashion． Compared with the model
group，the TUNEL-labeled myocardial cells were significantly decreased in pinocembrin groups，and the level of
apoptotic cells were negatively related to the pinocembrin concentration． Western blot results showed that Bax，
Caspase-3 and p62 in pinocembrin groups were significantly lower than in model group． The levels of apoptotic pro-
teins were negatively related to the pinocembrin concentration． In reverse，compared with the model group，the au-
tophagic-related protein，LC3，showed an increasing trend in the pinocembrin groups and presented a positive rela-
tion to drug’s concentration． Conclusion The results indicate that the pinocembrin pre － conditioning shows the
protective effect on rats after myocardial IＲI． The mainly protective mechanisms are possibly related to the inhibi-
tion of apoptosis and activation of autophagy．
Key words pinocembrin;myocardial ischemic － reperfusion;cell apoptosis;autophagy
·3371·安徽医科大学学报 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2015 Dec;50(12)