全 文 ：武汉植物学研究 2009, 27(5):455～ 460
JournalofWuhanBotanicalResearch
短命植物东方旱麦草 Rubisco大亚基基因
(rbcL)的克隆及表达分析
李秀明＊ , 刘 彭＊ , 谷丽丽 , 姚世响 , 油天钰 , 兰海燕＊＊ , 张富春
(新疆大学生命科学与技术学院 , 新疆生物资源与基因工程重点实验室 , 乌鲁木齐　 830046)
摘　要:利用 PCR、DNA重组 、原核与真核生物表达等技术从新疆短命植物东方旱麦草(Eremopyrumorientale)基因
组中扩增出 Rubisco大亚基基因 rbcL(GenBank登录号为 FJ346562),并构建了原核与真核表达载体 pGEX4T-1-rbcL
和 pcDNA3-rbcL,随后分别在原核宿主 BL21(DE3)和小鼠中进行了表达 , 并利用真核表达载体和纯化蛋白制备的
抗体 ,对表达产物的特异性进行了 Western印迹检测。结果表明:东方旱麦草的 rbcL基因可读区包含 1431bp, 与旱
麦草 rbcL基因的同源性达 99.86%, 推测编码 476个氨基酸 , 分子量 56 kD。该基因在 BL21中以融合蛋白 GST-
RBCL形式表达并存在于包含体中 ,融合蛋白大小约为 82kD。 RT-PCR检测到该基因在小鼠肝脏中的表达。利用
真核表达载体与纯化融合蛋白进行联合免疫制备的 RBCL抗体可与 RBCL特异性地结合 ,这为短命植物东方旱麦
草基因后续的免疫定位检测奠定了基础。
关键词:短命植物;东方旱麦草;1, 5-二磷酸核酮糖羧化酶;rbcL基因
中图分类号:Q786;Q949.71+4.2　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-470X(2009)05-0455-06
CloningandExpressionofrbcLGeneofRubiscoLargeSubunitfrom
EphemeralPlantEremopyrumorientaleL.
LIXiu-Ming＊ , LIUPeng＊ , GULi-Li, YAOShi-Xiang, YOUTian-Yu, LANHai-Yan＊＊ , ZHANGFu-Chun
(XinjiangKeyLaboratoryofBiologicalResourcesandGeneticEngineering, ColegeofLifeScienceand
Technology, XinjiangUniversity, Urumqi, Xinjiang　830046, China)
Abstract:TherbcL(largesubunitofribulose-1 , 5-bisphosphosphatecarboxylase/oxygenase)geneof
ephemeralplantEremopyrumorientaleL.wasamplifiedfromthegenomicDNAandthecorrectgenese-
quencewasregisteredinGenBank(AccessionNo.FJ346562).TherbcLgenewasclonedintoprokaryotic
expressionvectorpGEX4T-1(harboredwithgeneencodingGSTandwilformafusionproteinwithforeign
gene)andeukaryoticexpressionvectorpcDNA3 , andthenexpressedintheBL21(DE3)andmouse, re-
spectively.TheexpressedRBCLproteinwasdetectedbyWesternblot.TheresultsshowedthattheORFof
rbcLincluded1431 nucleotidesandencoded476 putativeaminoacids.Itshares99.86% homologywith
thatofEremopyrumtriticeum.ThefusionproteinGST-RBCLwiththesizeof82 kDwasexpressedinin-
clusionbodyinBL21(DE3);therbcLgenewasshownbeingtranscribedinthemouseliverbyRT-PCR
analysis.WesternblotresultsshowedthatthepurifiedRBCLwasabletospecificalybindtoitsantibody.
ThesepreliminaryresultswouldprovideevidenceforfurtherimmunohistochemistryassayinE.orientale.
Keywords:Ephemeralplant;EremopyrumorientaleL.;Rubisco;rbcL
　　绿色植物对碳的同化主要有 C3途径(卡尔文
循环)和 C4途径 [ 1] 。目前对于植物光合碳同化途
径的鉴别方法主要有:形态解剖 、稳定性碳同位素 、
酶学研究以及 14CO2示踪 [ 2]等 ,许多研究结果表明 ,
C3、C4光合作用生化途径的关键不是花环结构 [ 3] ,
而是酶 [ 4, 5] 。 1, 5-二磷酸核酮糖羧化酶(简称 Rubi-
sco)是 C3途径的关键酶 ,主要存在于叶肉细胞中 ,
约占叶片可溶性蛋白的一半 [ 6] ;而在 C4植物中则
主要分布于维管束鞘细胞 [ 7-9] ,可以根据这一特性
对植物的碳同化类型进行鉴别 。植物和一些原核生
　　　收稿日期:2008-11-04 ,修回日期:2009-05-11。
　基金项目:国家教育部留学回国人员启动基金(2006～ 2008);教育部科学技术基础条件平台建设项目(505016);新疆生物资源与基因
工程重点实验室开放基金(XJDX0201-2005-03)。
　作者简介:李秀明(1983-),女 ,硕士研究生 ,主要研究方向为分子生物学。刘彭(1982-),女 ,硕士 ,目前从事生物教学工作。
　 ＊ 两作者对本文的工作有同样贡献。
　＊＊ 通讯作者:兰海燕(1969-),女 ,博士 ,教授 ,硕导 ,主要从事植物抗逆分子生物学机制的研究(Authorforcorrespondence.E-mail:lanhaiyan
@xju.edu.cn)。
物 Rubisco全酶由 8个大亚基(50 ～ 60 kD)和 8个
小亚基(12 ～ 18 kD)组成(L8S8)[ 10] ,植物的大亚基
在碳的固定方面发挥着至关重要的作用 [ 11] ,且从很
多植物中克隆到的 Rubisco大亚基的基因(rbcL)同
源性很高 ,不同科属之间可以达到 70%以上 ,最高
的可达 90%以上 [ 3, 12] ,无内含子 ,这就为直接从基
因组扩增获得 rbcL基因提供了方便 。
东方旱麦草(EremopyrumorientaleL.)是一类分
布于新疆干旱荒漠区的禾本科短命植物 ,其在荒漠
早春季节利用春季融雪和降雨 ,迅速在地面形成一
定的覆盖度 ,并在 2个月左右完成生活史。其营养
体含较多粗蛋白;叶片维管束具有 “花环 ”结构[ 13] ,
被认为是 C4植物类型 。邱娟等的研究结果表明 ,
东方旱麦草具有较高的光合速率 [ 14] ,但关于其对应
的光合相关酶类的研究至今未见报道。为进一步探
讨此类短命植物的高光效机理及光合地位 ,我们从
东方旱麦草基因组中克隆了 rbcL基因 ,并对其进行
了原核及真核的表达分析 ,以期为今后利用 Rubisco
的免疫定位结果鉴定东方旱麦草的碳同化类型奠定
基础 。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　菌种和质粒　DH5α、BL21(DE3)、pcDNA
3.0、pGEX4T-1由本实验室保存;克隆载体 pMD18-T
购自 QIAGEN公司 (北京)。昆明白小鼠购自新疆
医科大学动物中心 。
1.1.2　主要试剂　DNA凝胶回收试剂盒(DNAGel
ExtractionKit)、T4 DNA连接酶 、DNAMarker、限制
性内切酶和 ExTaq酶均购自宝生物工程有限公司
(大连)。 IPTG购自 Promega公司(北京代理)。羊
抗鼠 IgG-HRP购自博奥森生物技术有限公司(北
京)。 Western印迹显色底物 DAB购自博普欣生物
科技有限公司(北京)。 GSTBindResin购自 Nova-
gen公司 (北京代理)。常规化学试剂为国产分析
纯。
1.2　方法
1.2.1　基因组 DNA提取　东方旱麦草基因组
DNA提取按照文献 [ 3, 12]中的 CTAB法进行。
1.2.2　rbcL基因的 PCR扩增及测序　根据 Gen-
Bank上 已 发 表 的 旱 麦 草 rbcL基 因 序 列
(AY836165),利用引物设计软件 Primer5设计特异
引物 ,并分别在上下游引入 BamHI和 XhoI两个酶
切位点。
上游引物 P1:5′-CTCGGATCC(BamHI)ATGT-
CACCACAAACAGAAAC-3′;
下游引物 P2:5′-CCGCTCGAG(XhoI)TTAAT-
CAATAGTATCTACCG-3′。
以东方旱麦草基因组为模板 , PCR扩增目的片
段的反应条件为:95℃预变性 5min, 95℃变性 30s,
57℃退火 30 s, 72℃延伸 1 min,进行 35个循环后 ,
72℃延伸 9 min。用 0.7%的琼脂糖凝胶电泳分析
扩增产物 ,用 DNA凝胶回收试剂盒对 PCR产物进
行切胶回收。将回收获得的 PCR片段连接至
pMD18-T克隆载体 ,连接产物转化大肠杆菌 DH5α,
经蓝 /白斑筛选及酶切鉴定 ,获得重组质粒 pMD18-
T-rbcL,将鉴定正确的克隆送上海生物工程技术有
限公司(上海)测序。
1.2.3　rbcL基因的原核及真核表达载体的构
建　将测序结果确认的 rbcL基因从克隆载体上经
BamHI和 XhoI双酶切并纯化后 , 连入带有 GST
(谷光甘肽 -S-转移酶 )标签的原核表达载体
pGEX4T-1和真核表达载体 pcDNA3上相应的多克
隆位点 , 并经双酶切鉴定 , 筛选获得重组克隆
pGEX4T-1-rbcL和 pcDNA3-rbcL。
1.2.4　融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达及纯
化　将重组质粒pGEX4T-1-rbcL转化的 BL21(DE3)
菌接于LB液体培养基中(含氨苄青霉素 50 μg/mL),
37℃振摇(225r/min)培养至 OD600≈0.5 ,然后加入
IPTG至终浓度 0.4 mmol/L后继续在 37℃诱导培养
4 h, 8000 r/min离心 5 min,收集菌体 ,并用等体积
PBS缓冲液重悬洗涤菌体 3次 , 8000 r/min离心
5 min,收集沉淀 ,以 1/5体积 PBS重悬沉淀 ,于冰浴
中超声菌体直至菌液澄清 , 12000 r/min离心
10 min,分别取上清和沉淀各 30 μL加等体积上样
缓冲液 ,于 100℃煮沸 5 min后 , 12000 r/min4℃离
心 2 min,取 10 μL上样 , 25 mA恒流电泳 40 min。
SDS-PAGE中的浓缩胶和分离胶分别为 5%和
12%。表达的带 GST标签的 RBCL融合蛋白的纯化
按照 Sigma公司的谷胱甘肽 Sepharose4B纯化说明
书进行 ,从菌液中分离纯化的 GST-RBCL融合蛋白
用复性缓冲液(10 mmol/Lβ-巯基乙醇 , 1 mmol/L
还原型谷胱甘肽 GSH, 0.1 mmol/L氧化型谷胱甘肽
GSSG, pH8.5的 20 mmol/LTris-HCl, 10%蔗糖)透
析 48h,每 6 h换液 1次 ,复性后经以上 SDS-PAGE
分析纯度。
1.2.5　真核表达载体 pcDNA3-rbcL在小鼠中的表
达　以PEG8000纯化法大量制备重组质粒 pcDNA3-
456 武 汉 植 物 学 研 究　 　　　　　　　　　　　　　　　　第 27卷　
rbcL及对照质粒 pcDNA3,用生理盐水调整浓度至
1.0 g/L。采用水压转染法 [ 15, 16] ,对昆明白小鼠进行
尾静脉注射 ,注射量为 2 mL,每组 2只 ,注射后 8 h
断颈椎处死小鼠 ,取肝脏组织提取总 RNA,经 DNase
I处理后 ,将组内 2只小鼠的总 RNA等量混合后进
行反转录 ,并利用 rbcL基因的引物扩增目的片段
(长度为 1430bp)检测外源基因在小鼠肝脏中的转
录情况 ,以未转染小鼠为对照 。
1.2.6　抗血清制备及效价检测　将以上方法配制
的 pcDNA3-rbcL生理盐水溶液(质粒浓度 1.0 μg/
μL)注射小鼠进行 DNA免疫 ,每 2周注射 1次 ,每
次每只小鼠注射质粒 100 μL, 共注射 3次 。第 4
次 ,用已纯化的 GST-RBCL蛋白对小鼠进行加强免
疫 ,强化免疫的过程为:用等体积的弗氏佐剂将
GST-RBCL完全乳化后皮下多点注射免疫 ,每只小
鼠的注射剂量为 50 μg。未免疫及每次免疫 10 d后
的小鼠 ,每只由眼眶静脉采血 30μL并收集血清 ,用
间接 ELISA法测定抗体效价 ,具体为:50 μg/mL的
GST-RBCL融合蛋白做标准抗原蛋白包被 96孔酶
标反应板。以 1∶1000的 IgG-HRP标记的羊抗小鼠
抗体做第二抗体 ,以 BenchmarkPlus连续波长酶标
仪(Bio-Rad公司)测各孔 OD450/650值获得抗体水平。
1.2.7　表达蛋白的 Western印迹检测　将原核表
达载体 pGEX4T-1-rbcL诱导表达的产物进行 SDS-
PAGE凝胶电泳(条件同 1.2.4),采用 MiniProtean
3电转移装置(Bio-Rad公司), 80 V稳压低温转硝
酸纤维素膜(NC膜)3.5 h,将 NC膜用 5%脱脂奶粉
封闭 2 h,依次滴加稀释度为 1∶500的鼠抗 GST-
RBCL血清(室温反应 2 h、PBS洗涤 3次)及 1∶1000
的羊抗鼠 IgG-HRP(室温反应 1 h、PBS洗涤 3次),
最后加底物 DAB进行显色反应。
2　结果
2.1　rbcL基因的克隆及序列分析
rbcL基因由叶绿体基因组编码 ,属于非常保守
且无内含子的类型 ,因此可从基因组 DNA中直接扩
增获得。本实验利用基于旱麦草 rbcL基因所设计
的特异引物 ,以东方旱麦草基因组 DNA为模板 ,经
PCR扩增获得了一条约 1400 bp大小的片段 (图
1),图中第 2泳道中的条带与预计的 rbcL基因大小
一致 。
将此片段连入 pMD18-T载体中 ,以 BamHI、
XhoI双酶切鉴定重组质粒 pMD18-T-rbcL(见图 2),
得到了约 1400 bp的插入片段和大于 2500 bp的
pMD18-T线性片段 。对插入片段的测序结果显示 ,
此 DNA片段包含 1431 bp,与已发表的旱麦草 rbcL
基因序列的同源性达 99.86%,已将基因提交 Gen-
Bank注册 ,登录号为 FJ346562。此基因推测的氨基
酸序列包含 476 aa, 分子量为 56 kD, 等电点为
6.04。与同属旱麦草 rbcL基因相比 ,只在第 384位
氨基酸发生了改变 (图 3):旱麦草中为缬氨酸
(Val),东方旱麦草则为甘氨酸(Gly),而这两种氨
基酸都属于非极性 、疏水氨基酸 ,属保守改变 ,因此
对蛋白质的结构和功能应不会产生明显的影响 。
2.2　rbcL基因的原核表达及蛋白的纯化
经双酶切鉴定(图 4)确认获得了重组原核表达
质粒 pGEX4T-1-rbcL后 , 将该重组质粒转入宿主
BL21,并在 IPTG诱导下进行蛋白的表达 ,以 SDS-
PAGE分析蛋白表达的结果 (图 5:A)。图中显示:
带有 pGEX4T-1空载的菌体在约 26 kD处诱导出一
条特异表达带正符合 GST蛋白大小 (图 5:A,第 2
泳道);而经 0.5mmol/LIPTG诱导 4 h的重组菌与
诱导的空载菌体比较 (图 5:A, 第 2、3泳道),在
66 kD与 94kD之间有一特异蛋白表达条带 ,经分析
457　第 5期　　　　　　　李秀明等:短命植物东方旱麦草 Rubisco大亚基基因(rbcL)的克隆及表达分析
图 3　东方旱麦草与旱麦草 rbcL基因推测氨基酸的同源性比较
Fig.3　HomologycomparisonofputativeaminoacidsequenceofrbcLgenebetweenEremopyrumtriticeumandE.orientale
M:DNA标准DL15000+2000;1:重组质粒 pGEX4T-1-rbcL的
BamHI和 XhoI双酶切结果
M:DNAmarkerDL15000+2000;1:Doubledigestionofrecombi-
nantplasmidpGEX4T- 1-rbcLwithBamHIandXhoI
图 4　重组质粒 pGEX4T-1-rbcL的酶切鉴定
Fig.4　IdentificationofpGEX4T-1-rbcL
表明此带即为重组融合蛋白GST-RBCL(26 kDGST
蛋白 +56 kDRBCL蛋白共计 82 kD),且 GST-RBCL
主要存在于经超声波处理菌体的沉淀中 (图 5:A,
第 4、5泳道),显示重组菌表达的融合蛋白主要以
包含体的形式存在。经谷胱甘肽(GST)Sepharose
4B柱成功纯化出了GST-RBCL融合蛋白(图 5:B)。
A.M:蛋白质分子量标准;1:pGEX4T-1-rbcL/BL21未诱导总蛋白;
2:pGEX4T-1/BL21诱导总蛋白;3:pGEX4T-1-rbcL/BL21诱导总蛋
白;4:pGEX4T-1-rbcL/BL21诱导菌体超声上清蛋白;5:pGEX4T-
1-rbcL/BL21诱导超声菌体沉淀蛋白。 B.M:蛋白质分子量标准;
1:纯化的 GST-RBCL融合蛋白
A.M:Proteinmarker; 1:Totalproteinofnon-inducedpGEX4T-1-
rbcL/BL21; 2:TotalproteinofinducedpGEX4T-1/BL21; 3:Total
proteinofinducedpGEX4T-1-rbcL/BL21;4:Solubleproteininsuper-
natantofpGEX4T-1-rbcL/BL2afterultrasonictreatment;5:Insoluble
proteininpeletofpGEX4T-1-rbcL/BL21 afterultrasonictreatment.
B.M:Proteinmarker;1:PurifiedfusionproteinGST-RBCL
图 5　GST-RBCL融合蛋白的表达(A)与纯化(B)
Fig.5　Expression(A)andpurification(B)offusion
proteinGST-RBCL
458 武 汉 植 物 学 研 究　 　　　　　　　　　　　　　　　　第 27卷　
2.3　RBCL蛋白抗体的制备及检测
2.3.1　rbcL基因在小鼠中的表达　真核重组质粒
pcDNA3-rbcL经双酶切鉴定正确(图 6)后 ,用水压转
染法将此质粒注射小鼠并于 8 h后取其肝脏提取总
RNA,经反转录 PCR检测重组质粒的表达(图 7)。
泳道 1显示在注射重组质粒的小鼠肝脏中检测到一
条约 1400bp的 DNA特异条带 。而注射生理盐水
和对照空质粒的小鼠肝脏 RNA反转录 PCR结果呈
阴性(图 7,泳道 2、3)。这表明 pcDNA3-rbcL可在小
鼠中正确表达 ,并显示可利用此 DNA在小鼠体内产
生免疫反应 ,从而用于相应抗体的制备 。
2.3.2　Western印迹检测 rbcL基因的表达 　利用
rbcL基因的真核表达载体在小鼠体内表达所产生的
免疫应答和随后用 GST-RBCL蛋白加强免疫所获得
的抗血清 ,经 ELISA检测结果表明:抗血清在稀释
1∶500时效价仍可达到 1.299(数据未显示)。将此
抗血清用于原核表达产物的 Western印迹检测 ,结
果显示 ,在 GST-RBCL融合蛋白对应位置出现一条
特异印迹(图 8),表明所制备抗体对 RBCL蛋白具
图 8　Western印迹检测重组蛋白 RBCL的特异表达
Fig.8　Westernblotingofrecombinantexpression
有较高特异性。
3　讨论
Rubisco在光合作用和光呼吸中具有重要作用 ,
它一直是科学家们研究的焦点。 Rubisco在 C3和
C4植物叶片中具有不同的分布区域 ,可以用免疫胶
体金定位[ 12] 、免疫荧光定位 [ 17]等免疫组化的方法
对植物的光合同化类型进行判别。植物 Rubisco小
亚基由核 DNA编码 ,且小亚基基因(rbcS)变异较
大;而大亚基由叶绿体 DNA编码 , 且大亚基基因
(rbcL)相对保守 ,无内含子 ,在不同植物间的同源性
较高 ,已成为分子系统学研究中使用最为广泛的分
子指标之一 [ 18] 。近年来 , rbcL基因编码区序列资料
迅速增长 ,但关于短命植物东方旱麦草的 rbcL基因
相关信息至今尚未见报道 ,本研究从东方旱麦草基
因组中成功扩增出 rbcL基因 ,测序和 blast结果表明
东方旱麦草和同属植物旱麦草的 rbcL核酸序列同
源性高达 99.86%,且只有一个氨基酸不同。该基
因的获得为相应蛋白的定位提供了条件。
本研究在制备 RBCL抗体过程中 ,首先注入带
有 rbcL基因的真核表达载体并使其在小鼠体内表
达 ,由表达蛋白产生免疫反应后再用 GST-RBCL蛋
白加强免疫应答 ,从而获得抗血清。这种核酸免疫
与蛋白加强联合免疫的方法从一定程度上降低了成
本 ,减少了工序 ,并克服了仅核酸免疫效价低的不
足 ,使制备的抗体效价和纯度均较高 [ 19, 20] 。经
ELISA检测和 Western印迹结果显示 ,用联合免疫
方法制备的 rbcL抗血清 ,免疫反应效价高 ,与 RBCL
蛋白结合特异 ,为后续 Rubisco的免疫定位准备了
抗体。
459　第 5期　　　　　　　李秀明等:短命植物东方旱麦草 Rubisco大亚基基因(rbcL)的克隆及表达分析
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