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棕竹灰斑病病原菌生物学特性及化学防治研究



全 文 :棕竹灰斑病病原菌生物学特性及化学防治研究
赵金萍1,王炳文2* ,孙 琪3 (1.宁夏贺兰山国家级自然保护区管理局,宁夏银川 750001;2.中交四航工程研究院有限公司,广东广
州 510230;3.中山大学生命科学学院,广东广州 510006)
摘要 [目的]研究棕竹灰斑病菌[Pestalotiopsis palmarum(Cke.)Stey.]的生物学特性并对其杀菌剂进行筛选。[方法]采集具有典型症
状的病害标本,根据柯赫氏法则分离病原物和病原菌纯化后进行病原菌鉴定及生物学特性测定。同时,测定了 4 种供试杀菌剂在 3 种
不同浓度下对病原菌的抑菌作用。[结果]菌丝生长最适温度、pH、碳源、氮源分别为 25 ℃、pH 6、葡萄糖、硝酸钾;黑暗条件有利于菌丝
的生长,而光照条件则有利于孢子的产生。供试药剂中以 70%甲基托布津和50%使百功防效最为明显,分别在2 000和500 μg /ml时防
效高达 100%。[结论]为棕竹灰斑病的防治提供了理论依据。
关键词 棕竹;灰斑病;生物学特性;杀菌剂药效
中图分类号 S763. 7 文献标识码 A 文章编号 0517 -6611(2011)26 -16013 -04
Study on the Biological Characteristics and Chemical Control of Pestalotiopsis palmarum(Cke.)Stey.
ZHAO Jin-ping et al (Helan Mountain State Natural Reserve Administration Bureau of Ningxia Province,Yinchuan,Ningxia 750001)
Abstract [Objective]To study the biological characteristics of Pestalotiopsis palmarum(Cke.)Stey. and screen effective fungicides. [Method]
Disease samples with typical symptom were collected,their pathogens were isolated based on Koch’s rule,and then the biological characteristics
of the pathogen were determined. Meanwhile,the inhibition effect of four tested fungicides with three different concentrations against the pathogen
was detected. [Result]The optimum temperature,pH,carbon source and nitrogen source for hyphal growth were 25 ℃,6,dextrose and potas-
sium nitrate respectively;darkness favored the hyphal growth,while light conditions promoted the production of spores. Of all the fungicides,
70% mildothane and 50% prochloraz manganese had the best control effect,which could reach as high as 100% at 2 000 and 500 μg /ml. [Con-
clusion]The study provided theoretical support for the control of Pestalotiopsis palmarum(Cke.)Stey. .
Key words Rhapis excelsa;Pestalotiopsis palmarum(Cke.)Stey.;Biological characteristics;Efficacy of fungicide
作者简介 赵金萍(1956 - ) ,女,宁夏银川人,助理工程师,从事植物病
害研究,E-mail:suyukou6012365@ 163. com。* 通讯作者,助
理工程师,硕士,从事园林绿化研究。
收稿日期 2011-06-03
棕竹(Rhapis excelsa)又称观音竹、筋头竹、棕榈竹,为棕
榈科棕竹属常绿观叶植物。原产我国广东和云南等地,日本
也有。同属植物约有 20 种以上,主要分布于东南亚。棕竹
为丛生灌木,它常繁生山坡、沟旁隐蔽潮湿的灌木丛中,喜温
暖潮湿、半阴及通风良好的环境,畏烈日,在有明亮散射光的
温室内生长良好。棕榈植物在中国有着广阔的发展前景,随
着棕榈植物的广泛种植,其病害种类及其危害的严重性也逐
渐增加,成为棕榈栽培与管理中不可忽视的问题[1]。而由拟
盘多毛孢属(Pestalotiopsis sp.)真菌引起的棕竹灰斑病是栽
培和养护过程中常见的一种病害,主要为害棕竹的叶片,引
起组织坏死,严重影响到棕竹的生长和观赏价值。为此,笔
者对棕竹灰斑病菌的生物学特性进行了研究,并对其杀菌剂
进行了筛选,旨在为该病的防治提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 供试菌株。棕竹灰斑病病株采自华南农业大学校
内,根据柯赫氏法则分离病原物和病原菌纯化,获得纯培
养菌。
1. 1. 2 供试培养基。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA) :马
铃薯 200 g,葡萄糖 20 g,琼脂 20 g,蒸馏水 1 000 ml。Czapek
培养液配方:KNO3 2. 00 g,K2HPO4 1. 00 g,KCl 0. 50 g,MgSO4
·7H2O 0. 50 g,FeSO4 0. 01 g,蔗糖 30. 00 g,蒸馏水 1 000 ml。
1. 1. 3 供试杀菌剂。70%甲基托布津可湿性粉剂由日本旁
达株式会社生产;70%代森锰锌可湿性粉剂由利民化工有限
责任公司生产;50%使百功可湿性粉剂由上海迪拜农药有限
公司生产;80%大生 M-45 可湿性粉剂由美国罗门哈斯公司
生产。
1. 2 方法
1. 2. 1 病原菌鉴定。拟盘多毛孢的鉴定主要参考 Nag Raj
拟盘多毛孢属真菌分类系统,具体还结合了《植物病害初步
鉴定》的描述、图及检索表。对纯化的菌株逐一进行鉴定,孢
子大小各计测 30个,统计其幅度,最后根据记载的总性状和
形态特征鉴定到种。菌落形态、颜色的测定:将纯化菌株分
别移植于 PDA培养基 24 ℃培养 3 ~ 5 d;将纯化菌株分别移
植于斜面 PDA培养基,24 ℃培养 4 d后取出放室内散射光
下培养 14 d,观察记载菌落形态、基质颜色等。同时将纯化
菌株接种到 5个 PDA培养基,24 ℃培养 10 d,然后在 5个培
养基中分别从 3 个不同的分生孢子盘取 3 组样品,每组 30
个孢子,分别测量其分生孢子的长度、宽度和顶端附属丝长
度,取平均数,将所得结果记录并显微照相。
1. 2. 2 棕竹灰斑病病菌生物学特性测定。
1. 2. 2. 1 温度对菌丝生长及孢子生长量的影响。将活化好
的灰斑病在 PDA培养基平板上培养 3 d,用打孔器从菌落边
缘切取同一菌龄、直径 7 mm的菌饼,接于直径 85 mm、含 20
ml PDA的培养皿中央,分别放入 5 ~ 40 ℃、梯度为 5 ℃的恒
温箱中培养,每天用十字交叉法测菌落直径,计算菌落生长
速率,10 d后用计数器计数法记录产生的孢子量,每个处理 5
次重复。孢子的计数采用 Neubauor血球计数板,它是一块很
厚的载玻片,上面画有毎边长为 0. 05 mm的小方格。加盖玻
片后,小格深度是 0. 1 mm。测数时,先将盖玻片放在计数器
上有刻度的位置,从盖玻片的一侧加小滴适当稀释的孢子悬
浮液(使每小格中只有 5 ~ 6 个孢子) ,然后在显微镜下观察
每小格的数目;观察 80 小格,以它的平均数乘以 4 × 106,即
为 1 ml悬浮液中孢子的数目[2]。而菌落形态描述上,“+ +
+ +”表示长势最好;“+ + +”表示较好;“+ +”表示差;
“+”表示最差;“-”表示不生长。
安徽农业科学,Journal of Anhui Agri. Sci. 2011,39(26):16013 - 16016 责任编辑 乔利利 责任校对 卢瑶
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2011.26.167
1. 2. 2. 2 pH对菌丝生长及孢子形成量的影响。在 PDA 培
养基灭菌后用1 mol /L NaOH和1 mol /L HCl将 pH分别调至
3 ~12,间隔梯度为 1。菌落生长速率的测定和孢子量的计数
均同“1. 2. 2. 1”。
1. 2. 2. 3 不同碳源对菌丝生长及孢子形成量的影响。选用
8种碳源,分别为葡萄糖、蔗糖、木糖、乳糖、菊糖、麦芽糖、可
溶性淀粉和甘露醇。用量以 Czapek培养基中蔗糖的含碳量
(42. 07%)为基值,设置各碳源浓度(表 1)。于 25 ℃恒温箱
中培养,按照“1. 2. 2. 1”方法测量菌丝直径和孢子形成量。
表 1 供试碳源及其用量
Table 1 Category and dosage of test carbon sources
碳源
Carbon source
生产厂家
Nanufacturer
含碳量
Carbon content∥%
用量
Dosage∥g /L
蔗糖 Sucrose 广东广州化学剂二厂 42. 07 30. 00
葡萄糖 Dextrose 上海伯奥生物科技公司 36. 33 34. 73
木糖 Xylose 上海源聚生物科技公司 40. 00 31. 55
乳糖 Lactose 上海伯奥生物科技公司 40. 00 31. 55
菊糖 Synenthrin 上海伯奥生物科技公司 40. 00 31. 55
麦芽糖 Maltose 上海伯奥生物科技公司 42. 07 30. 00
可溶性淀粉 Tragantine 广东汕头市光华化学厂 44. 00 28. 40
甘露醇 Mannitol 上海伯奥生物科技公司 39. 60 31. 86
1. 2. 2. 4 不同氮源对菌丝生长及孢子形成量的影响。选用
6种氮源,分别为硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、L-精氨酸、L-赖氨
酸、L-天门冬酰胺。以硝酸钾的含量为基值(13. 86%) ,设置
各氮源浓度(表 2)。于 25 ℃恒温箱中培养,按照“1. 2. 2. 1”
方法测量菌丝直径和孢子形成量。
表 2 供试氮源及其用量
Table 2 Category and dosage of test nitrogen sources
氮源
Nitrogen source
生产厂家
Nanufacturer
含碳量
Carbon content∥%
用量
Dosage∥g /L
硝酸钾 Lopassium niruate 上海伯奥生物科技公司 13. 86 2. 000
硫酸铵 Ammonium sulphate 上海源聚生物科技公司 21. 21 1. 309
硝酸铵 Ammonium nitrate 上海伯奥生物科技公司 35. 00 0. 792
L-精氨酸 L-lysine 上海伯奥生物科技公司 18. 65 1. 486
L-赖氨酸 L-lysine 上海丽珠东风生物科技公司 19. 15 1. 488
L-天门冬酰胺 L-asparagine 广东汕头市光华化学厂 32. 15 0. 862
1. 2. 2. 5 光照对菌丝生长和孢子形成量的影响。接种菌丝
块后,将其放入不同的光环境中(荧光、荧光 /黑暗 12 h 交
替、黑暗) ,于 25 ℃恒温箱中培养,按照“1. 2. 2. 1”方法测量
菌丝直径和孢子形成量。
1. 2. 2. 6 室内抑菌测定。将 80%大生 M-45 可湿性粉剂和
70%甲基托布津可湿性粉剂、70%代森锰锌可湿性粉剂、
50%使百功可湿性粉剂分别按照 500、1 000、2 000 μg /ml 的
浓度配成含药培养基。将待测菌株接种在 PDA 平板上,25
℃恒温培养 3 d,用打孔器从菌落边缘切取同一菌龄、直径 7
mm的菌饼,移植到含有不同药剂的 PDA平板及不加任何药
剂的 PDA(空白对照) ,每个处理 5 次重复,3 d 后按照
“1. 2. 2. 1”方法测量菌落直径,计算抑制率。其计算公式为:
抑制率 =[(对照菌落直径 -处理菌落直径)/(对照菌
落 -7) ]×100%
1. 2. 3 数据处理。数据采用 DPS软件进行统计分析,采用
Duncan’s新复极差检验(DMRT)。
2 结果与分析
2. 1 棕竹灰斑病症状的描述与病原菌的形态特征 症状:
主要危害叶片,叶片染病初现橙黄色小斑点,后扩展为灰色
条斑,病斑中心灰白色至灰褐色,外围有黄色圈环,条斑融合
后形成不规则灰白色至灰色坏死大斑,重病叶干枯皱缩,后
期病斑中间散生黑色小斑点,为病原分生孢子盘。灰斑病菌
接种棕竹叶片后,叶片初期出现褐色坏死斑,后期病斑呈现
灰白色(图 1)。
图 1 棕竹灰斑病的致病性
Fig. 1 Pathogenicity of Pestalotiopsis palmarum(Cke.)Stey.
菌落和分生孢子形态:菌落白色,背面黄色,有轮纹,以接
种点为中心成环状分布,培养后期产生黑色的粘孢团(图
2)。分生孢子盘为黑色,球形至椭圆形,分生孢子梗无色,圆
柱形至倒卵形。分生孢子纺锤形,直,极少弯曲,具有 4 个横
隔膜,中间3个褐色细胞,两端细胞为无色(图3) ,大小(18. 0
~25. 0)μm ×(5. 1 ~ 7. 4)μm。顶端细胞有无色纤细的附属
丝 3根,少数为 2或 4 根,长 11 ~ 23 μm,基部细胞也有短小
41061 安徽农业科学 2011 年
的附属丝(表 3)。由于孢子特征和寄主的相似,可判断为掌
状拟盘多毛孢[Pestalotiopsis palmarum(Cke.)Stey.][3]。
图 2 拟盘多毛孢菌落形态正反面
Fig. 2 Colonial morphology of Pestalotiopsis sp.
图 3 拟盘多毛孢分生孢子
Fig. 3 Conidia of Pestalotiopsis sp.
表 3 拟盘多毛孢分生孢子形态特征
Table 3 Morphological characteristics of the conidia of Pestalotiopsis
sp. μm
菌株
Strain
分生孢子长度
Length of
conidia
分生孢子宽度
Width of
conidia
顶端附属丝长度
Length of subapical
appendage
1 20. 2 6. 3 17. 8
2 19. 3 5. 7 16. 9
3 21. 4 5. 9 19. 6
4 23. 5 5. 1 21. 4
5 23. 1 7. 1 22. 2
平均 Mean 21. 5 6. 0 19. 6
表 4 温度对菌丝生长及孢子量的影响
Table 4 Effect of temperature on hyphal growth and Pestalotiopsis for-
mation
温度∥℃
Temper-
ature
菌落直径
Colony
diamete∥mm
生长速率
Growth
rate∥mm/d
孢子量
Amount of
pestalotiopsis
×106 个 /皿
菌落形态
Colonial
morphology
5 7. 0 0 fF 0 dD -
10 12. 0 1. 00 eE 0 dD +
15 37. 9 6. 18 cC 6. 00 cC + +
20 48. 5 8. 30 bB 33. 10 bB + + +
25 69. 7 12. 54 aA 89. 40 aA + + ++
30 24. 3 3. 46 dD 0 dD + +
35 12. 0 1. 00 eE 0 dD +
40 7. 0 0 fF 0 dD -
注:同列数据后不同小写字母表示在 0. 05水平差异显著;不同大写字
母表示在 0. 01水平差异显著。
Note:Different lowercase letters following the figures in the same columns
represent significant difference at 0. 05 level;while different capital
letters represent significant difference at 0. 01 level.
2. 2 温度对菌丝生长及孢子量的影响 棕竹灰斑病菌菌丝
生长温度范围很广,在 10 ~ 35 ℃均可生长,20 和 25 ℃条件
下菌丝生长速度明显大于其他温度处理,其中以 25 ℃菌丝
生长最快;菌丝在 15 ~ 25 ℃均可产生孢子,在 25 ℃时产生
的孢子最多(表 4) ,说明 25 ℃是最适合该病菌生长和繁殖
的温度。
2. 3 pH对菌丝生长及孢子量的影响 由表 5 可知,棕竹灰
斑病菌菌丝在 pH 3 ~11时均可生长,最适 pH为 6;当 pH为
4 ~8,菌丝的生长速度相近。可见,棕竹拟盘多毛孢适宜在
偏酸条件下生长。
表 5 pH对菌丝生长及孢子量的影响
Table 5 Effect of pH on hyphal growth and pestalotiopsis formation
pH
菌落直径
Colony diameter
mm
生长速率
Growth rate
mm/d
孢子量
Amount of
pestalotiopsis
×106 个 /皿
3 51. 3 8. 86 cC 56. 00 eE
4 61. 2 10. 84 aA 91. 60 cC
5 62. 4 11. 08 aA 94. 80 bB
6 62. 7 11. 14 aA 106. 20 aA
7 58. 5 10. 30 bB 89. 30 dD
8 59. 1 10. 42 bB 91. 25 cC
9 58. 6 10. 32 bB 40. 20 fF
10 50. 8 8. 76 cC 29. 25 gG
11 27. 5 4. 10 dD 25. 00 hH
12 0 0 eE 0 iI
注:同列数据后不同小写字母表示在 0. 05水平差异显著;不同大写字
母表示在 0. 01水平差异显著。
Note:Different lowercase letters following the figures in the same columns
represent significant difference at 0. 05 level;while different capital
letters represent significant difference at 0. 01 level.
2. 4 不同碳源对菌丝生长的影响 棕竹灰斑病菌在不同碳
源培养基上生长特征各有差异,主要表现在菌落形态和生长
直径上。菌丝生长直径大小为葡萄糖、麦芽糖、乳糖 >蔗糖、
菊糖、可溶性淀粉 >甘露醇 >木糖;菌落形态表现为蔗糖、葡
萄糖、麦芽糖 > 可溶性淀粉、甘露醇、乳糖 > 菊糖、木糖
(表 6)。
表 6 不同碳源对菌丝生长的影响
Table 6 Effect of different carbon sources on hyphal growth
碳源
Carbon
sources
菌落直径
Colony
diameter
mm
生长速率
Growth rate
mm/d
菌落形态
Colonial
morphology
蔗糖 Sucrose 51. 8 8. 96 cC + + +
葡萄糖 Dextrose 62. 8 11. 16 aA + + +
菊糖 Synanthrin 51. 2 8. 84 dCD +
麦芽糖 Maltose 58. 4 10. 28 bB + + +
可溶性淀粉 49. 6 8. 52 dD + +
Tragantine
木糖 Xylose 25. 8 3. 76 fF +
甘露醇 Mannitol 45. 3 7. 66 eE + +
乳糖 Lactose 56. 4 9. 88 bB + +
注:同列数据后不同小写字母表示在 0. 05水平差异显著;不同大写字
母表示在 0. 01水平差异显著。
Note:Different lowercase letters following the figures in the same columns
represent significant difference at 0. 05 level;while different capital
letters represent significant difference at 0. 01 level.
2. 5 不同氮源对菌丝生长的影响 棕竹灰斑病菌在不同氮
源培养基上生长特征各有差异,也主要表现在菌落形态和生
长直径上。菌丝生长直径大小为硝酸铵 >硝酸钾 >硫酸铵、
5106139卷 26期 赵金萍等 棕竹灰斑病病原菌生物学特性及化学防治研究
L-赖氨酸 > L-精氨酸 > L-天门冬酰胺。菌落形态上,发现含
有铵根离子的培养基会发生变形,带有红色,且无孢子形成
(表 7)。
表 7 不同氮源对菌丝生长的影响
Table 7 Effect of different nitrogen sources on hyphal growth
氮源
Nitrogen
sources
菌落直径
Colony
diameter
mm
生长速率
Growth rate
mm/d
菌落形态
Colonial
morphology
硝酸钾 52. 4 9. 08 bcBC + + +
Lopassium niruate
硫酸铵 51. 6 8. 92 bBC +
Ammonium sulphate
硝酸铵 55. 0 9. 60 aA +
Ammonium nitrate
L-精氨酸 50. 8 8. 76 cC + +
L-arginine
L-赖氨酸 51. 6 8. 92 bB + +
L-Lysine
L-天门冬酰胺 41. 3 6. 86 dD + +
L-asparagine
注:同列数据后不同小写字母表示在 0. 05水平差异显著;不同大写字
母表示在 0. 01水平差异显著。
Note:Different lowercase letters following the figures in the same columns
represent significant difference at 0. 05 level;while different capital
letters represent significant difference at 0. 01 level.
2. 6 光照对菌丝生长的影响 结果显示,在黑暗环境中有
利于棕竹灰斑病菌菌丝的生长,而不利于菌核的产生;而光
照条件有利于孢子的产生(表 8)。
表 8 光照对菌丝生长及孢子量的影响
Table 8 Effect of light on hpyhal growth and pestalotiopsis formation
处理
Treatment
菌落直径
Colony
diameter
mm
生长速率
Growth rate
mm/d
孢子量
Amount of
pestalotiopsis
×106 个 /皿
荧光 Fluorescence 62. 0 11. 00 bB 154. 40 bB
黑暗 Darkness 71. 5 12. 90 aA 86. 40 cC
荧光 /黑暗 12 h交替 70. 5 12. 70 aA 187. 60 aA
12h fluorescence and
12 h darkness cycle
注:同列数据后不同小写字母表示在 0. 05水平差异显著;不同大写字
母表示在 0. 01水平差异显著。
Note:Different lowercase letters following the figures in the same columns
represent significant difference at 0. 05 level;while different capital
letters represent significant difference at 0. 01 level.
2. 7 杀菌剂对棕竹拟盘多毛孢病菌的毒力 4 种供试杀菌
剂中,50%使百功和 70%甲基托布津对棕竹灰斑病菌菌丝的
抑制效果较好,其中当 70%甲基托布津、50%使百功浓度分
别为 2 000、500 μg /ml时,抑制率均达到了 100%(表 9)。
3 结论与讨论
3. 1 病原菌 用从棕竹灰斑病组织中分离到的拟盘多毛孢
属真菌(Pestalotiopsis sp.)对健康棕竹植株进行人工接种,接
种植株发病症状与自然发病症状相同,从接种发病的叶片上
均可重新分离获得相同的病原菌。因此,证明该菌是引起棕
竹灰斑病的病原菌。病原菌可通过植株叶片受伤部分进行
侵染。根据病原菌培养性状、形态特征和寄主对象,将该病
原菌鉴定为拟盘多毛孢属,掌状拟盘多毛孢[P. palmarum
(Cke.)Stey.]。
表 9 不同杀菌剂对棕竹拟盘多毛孢菌丝生长的抑制作用
Table 9 Inhibition effects of different test fungicides against the
growth of Rhapis excelsa Pestalotiopsis sp. pathogen
杀菌剂
Test fun-
gicides
浓度
Concentration
μg /ml
菌落直径
Colony diameter
mm
抑制率
Inhibition
rate∥%
80%大生 M-45 2 000 20. 9 72. 35
80% dithane M-45 1 000 16. 0 86. 88
500 12. 7 91. 96
70%甲基托布津 2 000 7. 0 100
70% mildothane 1 000 18. 3 83. 53
500 28. 4 68. 80
70%代森锰锌 2 000 34. 3 60. 20
70% mancozeb 1 000 24. 8 74. 05
500 21. 8 78. 43
50%使百功 2 000 7. 0 100
50% prochloraz 1 000 7. 0 100
manganese 500 7. 0 100
CK 75. 6
3. 2 环境条件对病原菌的影响 试验结果表明,棕竹灰斑
病病菌菌丝在 10 ~35 ℃均可生长,其中以 25 ℃菌丝生长最
快。菌丝在 15 ~25 ℃均可产生孢子,同时在 25 ℃产生的孢
子最多,说明 25 ℃是最适合该病菌生长和繁殖的温度。菌
丝在 pH 3 ~11下均可生长且能产生孢子,其中最适合 pH为
6,在该 pH条件下产生的孢子也最多;从菌丝生长和孢子量
两方面综合来看,该菌菌落在光暗交替条件下生长最好,同
时发现在黑暗环境中有利于菌丝生长,不利于孢子生长;而
在光照条件下却是相反。菌丝在葡萄糖作为碳源的营养条
件下生长情况最好;在硝酸钾作为氮源的培养基上生长情况
最好。
3. 3 棕竹灰斑病病害防治 在化学药剂防治上,80%大生
M-45、70%甲基托布津、70%代森锰锌、50%使百功 4 种杀菌
剂在不同浓度下都对灰斑病病菌菌丝有不同程度的抑制作
用,其中 50%使百功对菌丝的抑制效果最好,在浓度为 500
μg /ml时,抑制率可达 100%;其次是 70%甲基托布津,在浓
度为 2 000 μg /ml时,抑制率亦可达到 100%。因此,在对棕
竹灰斑病的化学药剂防治上 50%使百功和 70%甲基托布津
的效果都相对较好,可根据实际需要以及成本和效益因素从
中进行选择。另外,由于棕竹灰斑病很大程度是基于其栽培
环境及条件引发的,所以要将化学药剂、栽培技术和栽培管
理共同结合来进行防治。
参考文献
[1]习平根,李敏慧,陈一新,等.棕榈科观赏植物真菌病害鉴定[J].华南
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61061 安徽农业科学 2011 年