全 文 ：文章编号:1001 － 4829(2015)03 － 1130 － 05 DOI:10． 16213 / j． cnki． scjas． 2015． 03． 038
收稿日期:2015 － 03 － 24
基金项目:科技基础性工作专项“西南喀斯特地区特色微生物
资源及多样性调查”(2014FY120100)
作者简介:吴石平(1974 －)，男，副研究员，在读博士，从事植物
病理学研究，E-mail:gzwusp@ 126． com，* 为通讯作者。
八角金盘灰斑病的病原鉴定及其防治药剂筛选
吴石平1，2，陈小均2，刘作易2*
(1． 贵州大学 农学院，贵州 贵阳 550025;2． 贵州省农业科学院，贵州 贵阳 550006)
摘 要:为了探明八角金盘灰斑病的病原菌种类，便于对其进行有效防治，以从云南、重庆和贵州等地收集的灰斑病标样为研究材
料，通过分离、纯化，采用形态学结合分子系统学分析的方法，进行病原菌的鉴定，并在此基础上进行防治药剂室内筛选研究。结
果表明:引起八角金盘灰斑病的病原菌为中央叶点霉;10 %苯醚甲环唑水分散粒剂、50 %多菌灵可湿性粉剂和 10 %多抗霉素粉
剂等 3 种杀菌剂对该菌有较强的抑制作用，其 EC50分别为 1． 9298、2． 1805 和 6． 0194 mg /L;80 %代森锰锌可湿性粉剂和 6 %春雷
霉素可湿性粉剂对该菌的抑制效果较差，其 EC50分别为 103． 2997 和 161． 1234 mg /L。
关键词:八角金盘灰斑病;病原菌;鉴定;杀菌剂;筛选
中图分类号:S432． 1;Q938 文献标识码:A
Identification of Fatsia japonica Grey Spot Pathogen and Screening of Fungicides
WU Shi-ping1，2，CHEN Xiao-jun2，LIU Zuo-yi2*
(1． College of Agriculture，Guizhou University，Guizhou Guiyang 550025，China;2． Guizhou Academy of Agricultural Sciences，Guizhou
Guiyang 550006，China)
Abstract:The samples of grey spot disease collected from Yunnan，Chongqing and Guizhou were identified by isolation，purification，mor-
phology and molecular systematics analysis，and then the fungicides to control pathogen of Fatsia japonica grey spot disease were screened in
a laboratory to probe pathogenic species of Fatsia japonica grey spot disease and its effective control by fungicides． The results showed that
the pathogen to cause atsia japonica grey spot disease is Phyllosticta capitalensis． 10 % Difenoconazle WDG，50 % Carbendazim WP and 10
% Polyoxins have the strong inhibition effect against pathogen to cause Fatsia japonica grey spot disease and EC50 of 10 % Difenoconazle
WDG，50 % Carbendazim WP and 10 % Polyoxins is 1． 9298，2． 1805 and 6． 0194 mg /L，respectively． EC50 of 80 % Mancozeb WP and
6 % Chunleimeisu WP is 103． 2997 and 161． 1234 mg /L separately，which indicates 80 % Mancozeb WP and 6 % Chunleimeisu WP have
weak inhibition effect against pathogen of Fatsia japonica grey spot disease．
Key words:Fatsia japonica grey spot;Pathogen;Identification;Fungicide;Screening
八角金盘(Fatsia japonica Dcne ＆ Planch)是一
种重要的极耐阴、常绿、丛生观叶灌木，其叶片掌状，
宽大，四季青翠，花黄白色，为圆锥状顶生聚伞花序;
可种植于庭园门前、窗边栏下，也可成片地种植于草
坪边缘、林地之下，为城市绿化的常用植物。八角金
盘对二氧化硫等有害气体具有较强的抗性，所以也
是街道、工厂、矿区等区域的常用绿化植物［1 ～ 5］。八
角金盘也是一种重要的药用植物，对肝癌治疗的总
有效率达 90 %以上［6］，对延长食管喷门癌患者生
存期有明显的效果［7］。叶片含有皂甙、3-己烯醛等
活性物质［8］，花的精油对枯草芽孢杆菌有明显的抑
制作用［9］。叶片提取物对碳钢具有较好的缓蚀作
用，缓蚀效率为 80． 85 %［10］。研究发现［11 ～ 17］，八角
金盘的病害主要有灰斑病、炭疽病和斑点病等。其
中，八角金盘灰斑病在中国南方有一定程度的发生，
且常需要进行防治［13，18］。目前，对该病病原菌的分
类仅鉴定到属，尚未见有关该病病原菌种名的报道，
给该病的诊断及防治带来困难［12，15］。为此，笔者于
2012 和 2013 年在云南、重庆和贵州 3 个省(市)收
集灰斑病的标样 6 份，通过分离、纯化和病原性检
验，采用形态学结合分子系统学分析的方法对病原
菌进行鉴定，并在此基础上采用生长速率法对 10 %
苯醚甲环唑水分散粒剂等 8 种杀菌剂进行室内筛
0311
西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
2015 年 28 卷 3 期
Vol. 28 No. 3
选，以期探明八角金盘灰斑病病原菌的种类，筛选出
能有效抑制菌丝生长的药剂，为该病诊断和防治提
供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 供试材料
1． 1． 1 病害标本 病害标本采自云南、重庆和贵州
3 个省(市)，具有八角金盘灰斑病典型症状。
1． 1． 2 供试药剂 50 %多菌灵可湿性粉剂，江阴
市农药二厂有限公司;80 %代森锰锌可湿性粉剂，
美国陶氏益农公司;10 %苯醚甲唑水分散粒剂，广
东中迅农科股份有限公司;54 %百菌清悬浮剂，美
国世科姆公司;25 %咪鲜胺乳油，天津市东方农药
有限公司;6 %春雷霉素可湿性粉剂，汤普森生物科
技公司;43 %戊唑醇悬浮剂，标正作物科学有限公
司;1． 5 %多抗霉素粉剂，延边春雷生物药业有限公
司。
1． 2 病原菌的分离与验证
在体视显微镜下，从采集的八角金盘灰斑病病
斑上挑取分生孢子器，置于无菌水中，压碎，制成孢
子悬浮液，然后吸取孢子悬浮液涂布到水琼脂
(WA)平板上。48 h 后，在显微镜下挑取已经萌发
的单孢子转接到 PDA培养基上，25 ℃培养 5 ～ 7 d，
然后进行纯化和保存。
参照《植病研究方法》［19］用科赫氏原则对分离
得到的菌株进行致病性验证。将分离纯化的菌株转
接到 PDA培养基上，培养 14 d 后形成分生孢子器
和大量的孢子。挑取分生孢子器，制成 1 × 107CFU /
mL的孢子悬浮液，吸取 100 μl孢子悬浮液，接种到
八角金盘的叶背，同时用针在接种处穿孔造成伤口。
7 d后调查是否发病，并对病斑上形成的分生孢子
器及孢子进行观察，然后进行单孢分离。比较接种
后形成的分生孢子器、孢子等的形态特征及分离到
的菌株是否与接种菌株一致。
1． 3 形态特征观察与系统学研究
参照文献［20］的方法对病斑及分离纯化的病
原菌进行形态特征观察，记录并描述病斑及病原菌
的形态。采用 BioEide对分离纯化菌株及参考模式
菌株的 ITS、ACT、TEF 和 GPDH 等 4 个基因的序列
分别进行编辑，用 MAFFT 对各基因序列进行比对，
然后将 4 个基因进行组合;用 DAMBE 检验替换饱
和度，用 Gblocks 对无法比对或非同源的区段进行
删除;采用 PAUP以最大简约法进行系统树推断;采
用 Mrmodeltest进行进化模型分析，然后采用 raxML
和 Mrbayes 以最大似然法和 Bayesian 法构建系统
树;比较 3 种方法构建的系统树，然后将分枝的支持
率标注到最大简约法分析得到系统树。根据形态特
征和分子系统学结果对病原菌进行分析和鉴定。
1． 4 杀菌剂对病原菌的抑菌活性测定
随机选取 1 个菌株(GZAAS6． 1224)，参照《农
药室内生物测定试验准则》［21］，采用生长速率法进
行杀菌剂抑菌活性室内生物测定。
2 结果与分析
2． 1 病原菌的分离及科赫氏验证
从表 1 可见，对采自云南、重庆和贵州的标本进
行分离共得到 6 个菌株。其中，云南 1 株，重庆 2
株，贵州 3 株。在室内采用科赫氏原则进行回接、保
湿培养 7 d后，接种菌株 GZAAS6． 1208 等 6 个菌株
的叶片均表现灰斑病症状。对发病叶片的病原菌进
行分离，得到的菌株与接种菌株一致。说明，
GZAAS6． 1208 等 6 个菌株为八角金盘灰斑病的病
原菌。
2． 2 分离菌株的形态特征
从图 1 可见，八角金盘灰斑病发生在叶片上，病
斑中央灰白色，边缘褐色，边界明显，病斑上散生黑
色小点。病原菌在 PDA、MEA 和 OA 等 3 个培养基
上生长较好，生长速度分别为 0． 35、0． 5和 0． 6 cm/d。
表 1 八角金盘灰斑病标本分离的菌株及其采集地点
Table 1 Strains isolated from Fatsia japonica grey spot samples and their collection sites
菌株号
No． of strains
标本号
Samples
采样地点
Sampling sites
GZAAS6． 1208 KM1201 云南省昆明市盘龙区云南农大校园
GZAAS6． 1224 GY1273 贵州省贵阳市花溪区贵州大学校园
GZAAS6． 1229 CQ1225 重庆市渝北区江北机场
GZAAS6． 1230 CQ1226 重庆市渝北区江北机场
GZAAS6． 1315 GY1304 贵州省贵阳市花溪区湿地公园
GZAAS6． 1355 GY1319 贵州省贵阳市云岩区贵州省植物园
13113 期 吴石平等:八角金盘灰斑病的病原鉴定及其防治药剂筛选
A为病斑症状，B为体视显微镜下的病斑(示分生孢子器)，C ～ D为分生孢子器纵切，E ～ G为产孢结构及未成熟分生孢子，H ～ J为分生孢
子，K为 PDA培养基上的菌落特征(标尺:5 μm)
A． Spot symptom;B． Pycnidia under a stereoscopic microscope;C － D． Pycnidium;E － G． Conidial structure and immaturity conidia;H － J． Conidia;
K． Colony characteristics on PDA medium(5 μm)
图 1 八角金盘灰斑病的病斑症状与病原菌形态特征
Fig． 1 Symptom of Fatsia japonica grey spot and morphological characteristics of pathogenic fungi
在 PDA培养基上经黑光灯照射诱导后能形成大量
的分生孢子器;分生孢子器着生在菌丝上，轮生，球
形、扁球形或不规则形，黑色，大小为 50 ～ 150 μm，
有孔口，成熟后分生孢子溢出;分生孢子器内壁无
色，其上着生瓶梗状至倒棍棒状的产孢结构，大小为
7 ～ 14 μm ×3 ～ 5 μm;分生孢子单细胞，无色，壁光
滑，大小为 8 ～ 11 μm ×5 ～7 μm，外表有 2 μm 左右
粘质层，尾部有 1 透明附属丝长度为 5 ～ 8 μm;其形
态特征与中央叶点霉(P． capitalensis)的形态特征一
致。
分支上面数值为分支的最简约树的自举支持率(MPBS)和最大似然法的自举支持率(MLBS)，未标注或 －表示自举支持率低于 50 %;加粗
的分支表示 Bayes推论的后验概率大于 0． 9;加注* 的菌株代表模式菌株
The values above a branch are bootstrap support value for maximum parsimony(MPBS)and bootstrap support value for maximum likelihood(MLBS)．
Thickened branches represent significance of Bayesian posterior probability(≥90 %)． － indicates that bootstrap support value is lower than 50 % ．
* indicates the model strain
图 2 八角金盘灰斑病病原菌及相关菌株多基因的分子系统树
Fig． 2 The polygenic molecular phylogenetic tree of Fatsia japonica grey spot pathogen and relative strains
2311 西 南 农 业 学 报 28 卷
表 2 8 种药剂对八角金盘灰斑病病原菌的抑制作用
Table 2 Inhibition effect of 8 fungicides on pathogen of Fatsia japonica grey spot
药剂名称
Fungicides
回归方程
Ｒegression equation
EC50(mg /L) EC90(mg /L)
10 %苯醚甲唑水分散粒剂 10 % Difenoconazle WDG y = 1． 3799x + 4． 6060 r = 0． 9905＊＊ 1． 9298 16． 3777
50 %多菌灵可湿性粉剂 50 % Carbendazim WP y = 1． 6253x + 4． 4498 r = 0． 9515＊＊ 2． 1805 13． 3991
1． 5 %多抗霉素粉剂 1． 5 % Polyoxins powder y = 1． 6800x + 3． 6903 r = 0． 9865＊＊ 6． 0194 34． 8623
43 %戊唑醇悬浮剂 43 % Tebuconazole SC y = 1． 5226x + 3． 3092 r = 0． 9891＊＊ 12． 8954 89． 5593
54 %百菌清悬浮剂 54 % Chlorothalonil SC y = 1． 3466x + 3． 3769 r = 0． 9934＊＊ 16． 0425 143． 5274
25 %咪鲜胺乳油 25 % Prochloraz EC y = 1． 4755x + 2． 8447 r = 0． 9877＊＊ 28． 8886 213． 4351
80 %代森锰锌可湿性粉剂 80 % Mancozeb WP y = 1． 4203x + 2． 1395 r = 0． 9931＊＊ 103． 2997 824． 9618
6 %春雷霉素可湿性粉剂 6 % Chunleimeisu WP y = 1． 1459x + 2． 4709 r = 0． 9512* 161． 1234 2116． 2721
2． 3 分子系统学分析
采用 PAUP 分析得到 20 棵最简约系统树，经
Kishino-Hasegawa测试，各最简约树之间没有显著差
异，树长(TL)、一致性指数(CI)、保留指数(ＲI)和
复定指数(ＲC)分别为 857、0． 667、0． 685 和 0． 457。
从图 2 可见，6 株从八角金盘灰斑病上分离到的叶
点霉属真菌与中央叶点霉(P． captilensis)聚在 1 支，
构成单系群(monophyletic group)，最简约法(MP)和
最大似然法(ML)的自举支持率分别为 97 和 95，贝
叶斯推论的后验概率为 1． 0;与 P． mangifera-indica
构成姐妹群(sister group)，该分支最简约法(MP)和
最大似然法(ML)的自举支持率分别为 96 和 100，
贝叶斯推论的后验概率为 1． 0。说明，八角金盘灰
斑病病原菌与中央叶点霉为同一种真菌，与 P．
mangifera-indica为近缘种。
2． 4 杀菌剂对八角金盘灰斑病病原菌的抑制作用
从表 2 可见，8 种供试药剂对八角金盘灰斑病
病原菌均有抑制作用。其中，10 %苯醚甲唑水分散
粒剂、50 %多菌灵可湿性粉剂和 1． 5 %多抗霉素粉
剂抑制作用较好，抑制中浓度(EC50)分别为 1．
9298、2． 1805 和 6． 0914 mg /L。80 %代森锰锌可湿
性粉剂和 6 %春雷霉素可湿性粉剂的抑菌效果较
差，EC50分别为 103． 2997 和 161． 1234 mg /L。
3 结论与讨论
病原菌分类地位的准确界定是植物病理学研究
中的一个重要内容，传统的病原菌鉴定主要是通过
形态特征结合病状、病征和培养特性进行，由于病
状、病征和培养性状变异较大，部分病害症状较为相
似。近年来，随着分子系统学的发展，形态特征结合
分子系统学分析成为真菌鉴定中较为通用的方
法［22］，很多研究者采用形态特征结合分子系统学对
等病害进行鉴定［23 ～ 26］。笔者通过形态学观察和分
子系统学分析发现，采自云南、重庆和贵州等 3 省
(市)的八角金盘灰斑病标本上分离得到的病原菌
在形态上与中央叶点霉(P． capitalensis Henn．)相
似，在多基因构建的系统树上与中央叶点霉(P．
capitalensis Henn．)聚成 1 支，构成单系群，与其近缘
种 P． mangifera- indica 构成姐妹群。因此，将八角
金盘灰斑病病原菌鉴定为中央叶点霉(P． capitalen-
sis Henn．)。中央叶点霉是 Hennnings 于 1903 年在
奇唇兰属(Stanhopeae)叶片上发现，由于该病病斑
发生在叶片中央，遂命名中央叶点霉［27］。该菌以内
生真菌或病原菌的形式广泛存在于多种植物上，是
叶点霉属中最常见和分布最广泛的一个种［28］，本研
究分离的菌株符合该种的特性。
在八角金盘上已报道的叶点霉有 2 种，分别是
P． fatsia Hara［29］和 P． fatsia-japonicae Petrak［30］，其
孢子大小分别为 7． 7 ～ 9． 1 μm × 3． 0 ～ 4． 5 μm和 6
～ 9 μm ×2 ～ 3 μm，与本研究分离到的孢子(8 ～ 11
μm ×5 ～7 μm)差异较大，属不同的真菌。在 2003
年 Van der Aa 等［31］认为，P． fatsia 的数据太少，不
能为今后的分类提供足够多的信息，未接受该种;根
据 P． fatsia-japonicae的描述，该菌应该为茎点霉或
拟茎点霉属，但是由于缺少产孢细胞的描述，所以无
法更准确地鉴定到种。
八角金盘灰斑病是八角金盘叶片上较为重要的
病害，在部分地区需要进行化学防治。研究结果表
明:该试验的 8 种药剂对病原菌均有抑制作用，其
中，苯醚甲环唑、多菌灵和多抗霉素抑制效果最好，
EC50分别为 1． 9298、2． 1805 和 6． 0914 mg /L，可进行
田间药效试验后，在生产中交替使用。
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(责任编辑 王 海)
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