全 文 ：9 8 17 年 l 月 第 l 期 !荃种辑闰
B中
从棒头草 (Po 加。 g on uf g “ x N es e e XS t e“ d)
原生质体培养获得再生成熟植株
陈 东 方 夏 镇 澳
(中国科学院上海植物生理研究所 )
摘 要
本文报道从棒头草 (Po l 夕P 口go , f“ ga 二 N 。 “ 。 : lS 。 “ 内 原生质体培养获得体细胞
胚和再生成熟植株的试验结果 . 从悬浮细胞制备的原生质体 , 经培养获得了再生小
植株 ; 而从胚性愈伤组织直接制备的原生质体 , 经培养己再生了成熟植株 . 后一条途
径为其他禾本科植物原生质体培养提供了新的线索 . 本文还对有关的培养方法和培
养基进行了研究 .
植物原生质体培养是高等植物细胞工程和基因工程的重要基础之一 目前 , 已约有八十
余种植物可以从原生质体培养再生植株 1[, 2 , . 然而 , 在重要的禾本科和豆科植物中 , 从原生质
体培养再生植株仍很困难 . 特别是禾本科植物 , 目前尚未见到有再生成熟植株的 正 式 报道 .
oP tr y ku
s 等曾就此问题在培养条件 、 植物材料 、 营养和激素要求等做了八万余种不同处理 , 结
果未能获得持续的细胞分裂『31 . 在这前后 , 国内外其他研究者也做了大量努力 , 但仍然只获得
了愈伤组织「4一川 . v a isl 等报道了从珍珠粟原生质体培养获得了再生小植株山 , ; 以后 , 同一实
验室又报道了从羊草和象草原生质体培养获得了再生小植株 `l3, 川 .近来 , oC iul b al y 和 D e m盯行
报道了从水稻原生质体培养获得了再生小植株网 . 这些都是这个领域中的重大进展 , 但他们
未能获得再生成熟植株 . 本文报道从棒头草原生质体培养获得再生成熟植株的结果 .
一 、 材 料 和 方 法
1
. 材料 选用从棒头草 ( p o l夕P o g o o f“ g o x N e e s e x s , e “ d ) 幼穗培养获得 的胚 性 愈伤
组织 、 胚性细胞悬浮系和普通细胞悬浮系为制备原生质体的起始材料 . 胚性愈伤组织是将诱
发的愈伤组织每隔 2 5天在 M SI ( 2 , 4一 D Zm g /l , 椰 乳 5外 ) , M凡 ( 2 , 斗一D I nJ g /l , 椰乳 5多 )
及 M s 3 ( 2 , 4 一 D l m g八, K T .O , m g /1, 椰乳 5务 )培养基上依序传代 , 并周而复始 ; 到第 3一 5
代就可从不同类型的愈伤组织中选出 . 如果取接种 10 天后的胚性愈伤组织传代到 M s : 液体
培养基中 (每 10 一 12 天传代一次 ) , 4 代后即可得到胚性细胞悬浮系 。 取继代 10 个月的中凤
本文 19 8 6 年 2 月 3 日收到 , 1 9 8 6 年 5 月 1 7 日收到修改稿 .
第 1 期 陈东方等 : 从棒头草原生质体培养获得再生成熟植株
型愈伤组织传代到 M S, 液体培养基中 ( 2 , 4一 D l m g / 1 , 椰乳 5多 , 水解酪蛋 白 .0 59 / l) , 第
6 代以后得到普通细胞悬浮系 。
2
. 培养基 分别采用 M S〔 ,们 , 玖 [ , , , , K M , P` , , , , D u 〔, , , 和 W h i r e [, 0J 的无机盐 及有机成
分 , 附加蔗糖 3 0 , 0 0 0 , 肌醇 2 0 0 , 水解酪蛋白 5 0 0 , 2 . 4 一 D 0 . 5 , N A A O· 5 , 6 B A o . 2 , Z T O· l m g / 1 ,
椰乳 5务 , 葡萄糖 o . sm ol / L , p H S . 8 . 用 .0 2脚 的微孔滤膜抽滤灭菌 .
3
. 方法
( l ) 酶液配制 将自制的 E A 3一 5 6 7 纤维素酶 , o n o z u k a R 一 1 0 纤维素酶和 M a e e r o z y m e
R 一 10 离析酶溶于含 K H : P o 4 2 7 . 2 , K N o 。 10 1 , e a e l , · 2 H 2O 1 4 8 0 , M g SO ; · 7H 2 0 2 4 0 , K I O. 1 6 ,
e u s q
·
S H
Z o o
.
o 2 5 m g /l
`2 ` , , 甘露醇 o . 3m o l / L , 山梨醇 o . 3 m o l / L , 葡聚糖硫酸钾 0 . 3多 , M E S
缓冲剂 3 m m ol / L 的稳压剂中 ; 离心 , 取上清液 , p H 调至 , . 8 , 用 0 .斗知m 的微孔滤膜抽滤灭
菌 (各种酶的浓度见表 l ) .
表 1 原生质休制备
原生质体来源 酶组份 ( , n g /m l ) 酶解时间 每克细胞所得
( h ) 原生质体数R 一 1 0 R 一 10 E A 3一 5 6 7
纤维素酶 离析酶 纤维素酶
普通细胞悬浮系 l O 5 多 12 8 . 3丫 10 6
胚性细胞悬浮系 20 5 I 0 2 4 5 . 3 火 10 2
胚性愈伤组织 2 0 5 5 2 斗 6 。 8义 10 ,
( 2 ) 原生质体制备及纯化 用培养第 3一 4 夭普通细胞悬浮系或胚性细胞悬浮系中的
细胞 , 第 10 一巧 天的胚性愈伤组织 (切成碎片 ) ,各约 29 , 放人 ’ 10 一 15 ml 酶液内 , 27 ℃中保温
12 一 2 h4 即可得到原生质体 . 将带有原生质体的酶液用孔径为 42 拌m 的镍丝网过滤 , 除去残
留的细胞及细胞团 , 用 0 . 6 m ol /L 蔗糖溶液漂浮纯化 ( 2 0 09 离心 3一 s m i )n , 再用液体培养基洗
涤三次 , 然后进行培养 . 从胚性愈伤组织制备的原生质体用悬滴法培养 ;从普通悬浮细胞制备
的原生质体用固体平板 , 液体浅层及液体一固体双层等方法培养 , 密度均为 2 . 1一 2 . 5 火 1护/时 .
培养在 25 ℃恒温 , 4 50 一 5 0 uL x 散射光下进行 .
( 3) 原生质体脱壁情况及活力测定 用含有 0 . 2多荧光增白剂 (上 海助剂厂 、 V B L 型 )
的 0 . 6 m ol / L 甘露醇溶液与原生质体悬浮液等体积混合 , I Om in 后用 o . 6 m ol / L 甘露醇溶液洗
涤两次 ;在荧光显微镜下检查没有荧光 , 说明脱壁完全 . 换用含 0 . 02 % 荧光素双醋酸醋 ( 自己
合成 )的 0 . 6m ol / L 甘露醇溶液 (其他步骤同上 )检测原生质体的活力为 8 一 92 多 .
( 4 ) 继代培养 从原生质体培养再生了肉眼可见的小愈伤组织后 , 将它们转移到含 。 . 2
m ol / L 葡萄糖的 M S 培养基上 . 愈伤组织长大后 , 移到常规的 M S 培养基上 . 变换激素条件
(种类和浓度见结果部分 ) , 诱导体细胞胚发生 . 然后再移到不含激素的 M S 培养基上使体细
胞胚萌发并再生小苗 . 小苗先在膨胀珍珠岩中加培养液培养一个月 , 然后移人土壤中 .
5 6 中 国 科 学 ( B 辑 ) 19 8 7 年
二 、 结 果
1
. 从不同材料制备原生质体的比较
表 1结果说明 , 从普通细胞悬浮系制备原生质体时 , 用酶量少 , 酶解时间短 , 且得率高 . 而
用胚性细胞悬浮系时 , 用酶量多 , 酶解时间长 , 且得率低 . 由于此系中细胞聚集成十分紧密的
小细胞团 , 既不易切碎 , 酶液又不易渗入 , 所以酶解所得原生质体数量很少 , 常常不能满足培养
和操作的要求 . 直接用胚性愈伤组织时 , 虽然原生质体得率较低于普通细胞悬浮系 , 但是比用
胚性细胞悬浮系的得率要高 , 已 可以满足培养和操作的要求 .
材料的年龄对原生质体得率影响很大 . 经过比较 , 用悬浮系制备原生质体时 , 以培养第
3一 4 天的材料为好 , 用胚性愈伤组织时 , 需取第 10 一巧 天的材料 .
2
. 原生质体培养
( l) 来 自普通细胞悬浮系的原生质体培养 由于从普通细胞悬浮系制 备 原 生 质 体 得
率较高 , 采用了液体浅层 , 固体平板和双层 (下层为无原生质体的固体培养基 , 上层为有原生质
体的液体培养基 ) 方法进行培养 . 原生质体植板率以每毫升原生质体 (密度为 2 . 2 x 10 , ) 所得
愈伤组织计数 , 数值取四次试验的平均值 . 平板培养的植板率为 1 10 0 , 双层和浅层培养的植
板率分别为 4 20 和 到 . 试验表明 ,在 同是 D u 培养基时 , 用不 同培养方法所得到的结果不同 .
以上结果可见 , 用平板培养法再生愈伤组织植板率最高 . 原生质体在平板培养中 , 第二
天开始长成椭圆形 , 同时也观察到第一次分裂 . 培养到第七天 , 一次及二次分裂频率平均为
巧 多 , 最高可达 28 并 . 培养二周后形成小细胞团 , 四 周后形成肉眼可见的愈伤组织 (图版 I , l
一 4 ) . 在用液体浅层培养时 , 虽然 1 h2 后用荧光增白剂染色观察到再生细胞壁 , 但原生质体仍
呈圆形 , 一次分裂的频率很低 , 只有 1一 2外左右 . 原生质体相互粘连 , 成絮状 . 细胞长大形成
圆形或长管形的巨细胞 . 培养一个月后 , 只有很少的愈伤组织形成 . 用双层方法培养 , 再生愈
伤组织数 目比用浅层培养的高一些 , 但比平板培养仍低得多 .
试验又采用平板培养法比较原生质体对培养基的要求 . 不同培养基上原生质体植板率以
每毫升原生质体 (密度为 2 . 4 x 10 , ) 形成肉眼可见的愈伤组织计数 , 数值为五个重复的平均值 .
培养基为 D Z , M S , D u , K M SP , w h i t e , 原生质体植板率分别为 10 6斗, 9 56 , 1一5 2 , 1 0 6 , 0 . 结
果表明 , 棒头草原生质体除在成份复杂的 K M sP 培养基上植板率很低以及在缺少还原态氮源
的 w hi et 培养基上不能形成愈伤组织以外 , 在其他三种培养基上的植板率都显著高 , 而且数
值接近 .
在将这类原生质体培养所得的愈伤组织转移到含葡萄糖 0 . 2m ol / L , 2 . 4一 D 1 . om g ZI , 椰乳
5多的 M S 培养基上时 , 它们可以迅速生长 . 以后再把长大的愈伤组织转移到含 I A A .0 5 ,
N A A .O5
, 6 B A 0
.
5一 1 . om g l/ 的 M S ( M S刀 培养基上 , 7关 的愈伤组织块可以形成不典型的
体细胞胚 , 这些体细胞胚在 M SI 二 培养基 (只含一半大量及微量元素的 M S 培养基 )上能够萌
发 , 长出小苗 . 但是小苗的根系发育不良 , 其中有 80 外为 白化苗 (图版 I , 5一 7 ) .
( 2 ) 来 自胚性愈伤组织的原生质体培养 胚性愈伤组织的原生质体得率低于普通细胞
悬浮系 , 因此采用悬滴方法培养 . 培养第二天 , 用荧光增 白剂染色的结果表明 , 细胞壁已开始
再生 . 第三天出现第一次分裂 , 二周后形成细胞团 , 四周后形成肉眼 可见的愈伤组织 (图版 n ,
1一 6) . 这些愈伤组织在含葡萄糖 0 . 2 m ol / L , 2 . 4一 D 1 . o m g / 1, 椰乳 , 多的 M s 培养 基上可以
第 1期 陈东方等 :从棒头草原生质体培养获得再生成熟植株
大量增殖 , 并表现 出胚性愈伤组织的特点 . 将胚性愈伤组织移到 M S ; 培养基上有 70 多可以
形成体细胞胚 . 在培养中 , 还观察到体细胞胚可以在不 另外附加诱导条件的情况下 , 从原生质
体直接形成 . 并在原生质体培养过程中看到了胚胎发育的几个时期 (图版 H , 7一 8 ) . 但是 , 这
些体细胞胚在转移到固体培养基上后 , 未能萌发 .
从这类原生质体培养获得的再生体细胞胚在不含任何激素的 M S 培养基上可 以萌发 , 但
胚根未能很好地生长 , 因此再生小植株的根系发育不良 . 此外 , 在第一次获得的 20 多个芽中 ,
只有五个芽是绿色的 , 其余的都是 白化芽 . 虽然这些芽的根系不良 , 但在 M S 2I/ 培养基上仍然
可以生长并分萦 . 把有分萦的小苗转移到含有 2 . 4 一 D o . s m g l/ , K T 0 . l m g l/ 的 M sl 。 培养基
中 , 人`分羹节处又长出许多根 , 把健壮的苗先在膨胀珍珠岩中培养液培养一个月 , 以后移入土
壤中 , 小苗生长正常 ,分奠开花和结实 (图版 1 , 9一 1 0 ) .
由于不 可能保证原生质体悬浮液中不混有极少量细胞 , 因此进行了这样的试验 : 即将来
自胚性愈伤组织和细胞悬浮系中的细胞分别在原生质体培养基 (M s) 中进行 液 体 和 固体平
析培养 . 结果表明 , 所有细胞在高渗条件下均首先质壁分离 , 不能长大分裂 , 然后死亡 (图版
1
,
8一 9 ) . 因此可以排除这些细胞在实验条件下形成愈伤组织的可能性 .
三 、 讨 论
多年来 , 禾本科植物原生质体培养一直被认为是个十分困难的课题 . 直接以植物体组织
为材料制备原生质体 , 很难获得持续的细胞分裂和植株再生 〔2 2 , . 也有人曾认为禾本科植物原
生质体不具有持续分裂的能力〔23] . 从近几年的进展来看 , 这个看法不够正确 . 目前 , 在一些禾
谷类和禾本科牧草的原生质体培养中 , 已有几例从愈伤组织或细胞悬浮培养制备原生质体得
到愈伤组织 . 特别是 v as il 实验室先后报道了在珍珠粟 、 羊草和象草中 , 从胚性细胞悬浮系制
备原生质体 , 成功地获得了再生小植株 “ 2一 ` 4] . 这就为禾本科植物原生质体具有全能性提供了
证据 . 本工作从棒头草普通细胞悬浮系制备的原生质体获得了再生体细胞胚和小植株 , 以及
从胚性愈伤组织制备的原生质体获得了再生体细胞胚 、 小植株和成熟植株 , 为禾本科植物原生
质体具有全能性提供了进一步的例证 .
本工作与 v as il 及 L u 等的工作不同 , 在实验中未能从胚性细胞悬浮系制备出足够量的
原生质体 . 这主要是由于在胚性细胞悬浮系中 , 细胞紧密成团 , 且体积小 , 酶液难以渗人 . 但
是从胚性愈伤组织制备了已够试验用量的原生质体 ,培养后获得了再生体细胞胚和成熟植株 .
这可能成为禾本科植物原生质体培养的一条新的可行途径 . 采用这一途径有几个好处 : ( l)
胚性愈伤组织发生在禾本科植物离体培养中是一个较普遍的现象 〔, 4] , 因此在其他材料中也有
可能用以制备原生质体 ; ( 2 )胚性愈伤组织既具有旺盛的分裂能力 , 又具有潜在的分化能力 , 用
这类材料制备原生质体 , 培养后容易诱导植株再生 ; ( 3 )获得胚性愈伤组织比建立细胞悬浮系
所需的培养时间要短得多 , 这样也有利于保持植株再生能力 . 但采用这一途径还需要进一步
改进技术 , 以提高原生质体的得率 .
本试验从普通细胞悬浮系制备原生质体 , 经培养后获得再生体细胞胚和小植株 , 这和 V as U
等 〔, `」所采用的途径是类似的 . 采用这一途径的好处是 : ( l) 原生质体容易制备 , 得率高 ; ( 2 )细
胞具有较强的分裂能力 , 因此植板率高 , 结果易重复 ; ( 3) 悬浮培养物中细胞分散度较好 , 在分
离原生质体前可以进行各种处理 . 但采用这条途径有两个缺点 : ( l) 建立细胞悬浮系主要依
中 国 科 学 ( B 辑 ) 1 9 8 7 年
靠经验 , 且不易掌握 ; (二 )建立细胞悬浮系需要花费较长的时间 , 因此影响了原生质体的形态
发生能力 DS] . 本实验中采用这一途径获得体细胞胚和再生小植株都是不正常的 , 因此没有能
移栽成活 .
培养基的组份和培养方法对棒头草原生质体的植板率有影响 . 在不同培养方法对原生质
体植板率影响的试验中 , 以固体平板法最好 , 双层培养法次之 , 液体浅层法最差 . 在培养基的
选择上 ; 用固体培养方法 , 以 D u , D Z 和 M S 培养基对棒头草的原生质体培养较合适 . 而原生
质体在无还原态氮且组份简单的 w hit e 培养基中不能分裂 , 在组份复杂的 K M , P 加富培养
基中植板率也很低 . 此外 , 在培养来源于胚性愈 伤组织的原生质体时 , 我们还观察到了体细胞
胚在高渗的原生质体培养基中直接形成 . 这是一个很有趣的现象 , 它将成为研究禾本科植物
体细胞胚发生的起源和所需条件的一个较理想的实验系统 .
本试验通过两条途径成功地从禾本科植物棒头草原生质体培养成了小植株和 成熟 植株 ,
其目的是想建立一个禾本科植物原生质体培养的模式实验系统 , 从而逐步探索禾本科植物原
生质体全能性表达的规律 , 并运用到具有重要经济价值的植物上 , 使原生质体培养技术能迅速
在改良农作物 的研究中发挥作用 .
本工作承陈乃先 、 王六发同志协助摄影 ,谨一并表示感谢 .
参 考 文 献
[ 2 2 ]
[ 2 3 1
[ 2 4 ]
[ 2 5 ]
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