全 文 ：浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis，2014，26(1):14-19 http:/ /www． zjnyxb． cn
孙凤梅，沈晓霞，沈宇峰，等． 薏苡 AFLP体系的建立与优化［J］．浙江农业学报，2014，26(1):14-19．
DOI:10. 3969 / j． issn． 1004-1524. 2014. 01. 03
收稿日期:2013-08-26
基金 项 目:国 家 中 医 药 管 理 局 中 医 药 行 业 科 研 专 项
(201107011);浙江省中药材新品种选育重大科研专项
(2012C12912);浙江省药用植物种质改良与质量控制技术重点
实验室 (2011E10015)
作者简介:孙凤梅(1989—)，女，山东菏泽人，在读硕士，主要从
事生药品种鉴定与品质研究，E-mail:xhxgwxttzyq@ 163． com
* 通讯作者，王志安，E-mail:wangshou@ mail． hz． zj． cn
薏苡 AFLP体系的建立与优化
孙凤梅1，沈晓霞2，沈宇峰2，张启坤3，王志安2，*
(1 浙江中医药大学，浙江 杭州 310053;2 浙江省中药研究所，浙江 杭州 310023;3 浙江省微生物研究所，浙江 杭州 310012)
摘 要:以 30 个不同薏苡种质为试验材料，利用 AFLP分子标记技术进行遗传多样性及亲缘关系的研究。通
过对 AFLP常规流程中(基因组提取、酶切、连接、预扩增、选择性扩增、电泳及银染检测)关键因素进行优化，
建立适合薏苡的 AFLP扩增检测体系。结果表明，采用酶切与连接分开的两步法，酶切完全，每步反应时间 4
h并附加 15 min的酶失活时间;连接产物稀释 10 倍;预扩增产物稀释 50 倍，试验效果最佳。应用优化后体
系，从 64 对引物中筛选出 14 对多态性较好的薏苡 AFLP选择性扩增引物。
关键词:薏苡;分子标记;AFLP体系
中图分类号:S 567 文献标志码:A 文章编号:1004-1524(2014)01-0014-06
Establishment and optimization of AFLP system for Coix
SUN Feng-mei1，SHEN Xiao-xia2，SHEN Yu-feng2，ZHANG Qi-kun3，WANG Zhi-an2，*
(1 Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China;2Zhejiang Ｒesearch Institute of Traditional Chinese
Medicine，Hangzhou 310023，China;3Zhejiang Ｒesearch Institute of Microbilogy，Hangzhou 310012，China)
Abstract:By taking 30 samples of Coix species as testing materials，the genetic diversity and genetic relationship
was analyzed using AFLP molecular markers technology． The optimal analysis system of AFLP has been established
by studying the key factors of conventional process such as gene extraction，restriction digestion and link up，pre-am-
plication，selective amplification，electrophoresis and siliver staining detection． The result showed that the genome
DNA was digested more completely by using two-step method compared with one-step method． In each step，the en-
zyme reaction time was 4 h added with 15 min for enzyme inactivation． The connection product should be diluted for 10
times and the pre-amplification product should be diluted for 50 times to get a better result． With application of the es-
tablished system，14 selective amplification primers with better polymorphism were selected out from 64 primers．
Key words:Coix;molecular markers;AFLP system
薏苡(Coix lachryma-jobi L．)又名药玉米，为
禾本科(Gramineae)薏苡属(Coix L．)草本植
物［1］。薏苡是一种药食兼用的营养丰富的一年
生或多年生植物，始载于我国汉代《神农本草
经》。薏苡在我国有着悠久的栽培历史，我国薏
苡属植物资源丰富，有 5 种，2 变种，是农业上的
小品种之一［2］，分布于我国南北方各地，以贵州、
广西、云南、江苏、河北、辽宁等地产量较大［3］。
它的干燥成熟种仁称为薏苡仁，为常用中药，素
有“滋补保养之王”的美誉，《本草纲目》中称其
乃上品养心药［4］，具有很高的食用价值和医药保
健价值，成为世界范围内备受青睐的保健粮食
作物。
薏苡的抗逆性强，耐脊性高，耐粗放栽培［5］，
但由于缺乏优良品种，致其产量低，严重限制了
薏苡的发展。因此当务之急是要对现有的种质
进行改良。而目前，关于我国薏苡资源缺乏严格
系统的科学研究，致使薏苡品种混乱，同名异物、
同物异名现象严重，同时其遗传背景复杂和亲缘
关系的混乱也给薏苡育种工作带来了很多方面
的限制。因而改良种质的第一步是要对现有的
种质资源深入研究，归类分析。近年来，分子标
记技术得到了迅速发展，也逐渐地被应用到品种
鉴定、遗传亲缘关系分析、遗传多样性评估等方
面。在分子领域特别是品种鉴定及遗传亲缘关
系分析方面，对薏苡的研究报道还很少，本试验
利用成熟的 AFLP 分子标记技术对 30 个薏苡样
本种质资源进行研究，从而提高了薏苡植物分类
效率和育种水平，为薏苡的种质改良提供了科学
理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1. 1 薏苡材料
供试样本为采自全国各地的 30 份薏苡，所
有样品均为新鲜嫩叶，用封口袋密封，用冰盒带
回实验室，置于 － 80℃冰箱保存。
1． 1. 2 仪器与试剂
天根植物提取试剂盒(试剂盒型号:DP305-
2)、限制性内切酶 MseⅠ和 EcoＲⅠ、T4 DNA连接
酶购自 NEB公司，Taq DNA 聚合酶、dNTPs、10 ×
PCＲ Buffer 购自 TaKaＲa 公司，尿素、丙烯酰胺∶
甲叉双丙烯酰胺(19∶ 1)、过硫酸铵、TEMED、硝酸
银、甲醛等购自北京鼎国生物工程有限公司，
DNA Markers、6 × Loading Buffer 购自大连宝生物
有限公司，引物和接头由上海生工生物公司合
成。试验用仪器包括 Tanon-EPS300 电泳仪、垂直
电泳槽(北京六一仪器厂)、Tanon1600 凝胶成像
系统、DNA Engine-PCＲ扩增仪(Bio-ＲAD)、Nano-
drop 2000 紫外分光光度计(Thermo Scientific)、
国华 85-2 型恒温磁力搅拌器、Sorval Legend Micro
表 1 三十个薏苡样品的编号和产地
Table 1 The number and origin area of 30 Coix sam-
ples
编号 产地 编号 产地
1 浙江杭州 16 福建浦城 5
2 浙江泰顺 1 17 福建浦城 6
3 浙江泰顺 2 18 福建浦城 7
4 浙江泰顺 3 19 贵州晴隆 1
5 浙江泰顺 4 20 贵州晴隆 2
6 浙江泰顺 5 21 湖北思施
7 浙江武义 1 22 云南师宗 1
8 浙江武义 2 23 山东邹县
9 浙江缙云 1 24 四川南充
10 浙江永嘉 25 广西西林
11 浙江仙居 26 吉林 1
12 福建浦城 1 27 浙江缙云 2
13 福建浦城 2 28 云南师宗 2
14 福建浦城 3 29 辽宁义县
15 福建浦城 4 30 吉林 2
17 微量离心机(Thermo Scienfic)、精宏恒温水浴
锅、DW-YL270 － 25℃ 低温冰箱、AL104 天平
(Mettler Toledo)、DHG-9123A型电热恒温鼓风干
燥箱、Simplicity UV超纯水仪、华利远 ZD-9556 水
平摇床、绿叶牌 DZ-280 /2SD型真空封装机等。
1． 2 方法
1． 2. 1 基因组 DNA的提取和质量分析
采用天根试剂盒提取薏苡叶片中的基因组
DNA。将提取的植物基因组 DNA 取 1μL 在超微
量紫外分光光度计上(Nanodrop 2000)测样本的
浓度(ng·μL －1)和纯度，然后用 1%的琼脂糖凝
胶电泳检测主带质量，取 5 μL DNA 样品 + 1 μL
6 × Loading Buffer(溴酚蓝上样缓冲液)，90 V 电
压下电泳大约 35 min，放置在含有溴化乙锭的染
色缸中染色 20 min，紫外凝胶成像系统观察并
摄像。
1． 2. 2 酶切
AFLP分子标记技术体系参照 Vos 等［8］，采
用双酶切，其组合由一个高频内切酶 EcoＲⅠ(T /
TAA)和一个低频内切酶 MseⅠ (G /AATTC)组
成。每个反应体系为 25 μL，其中包括 10 × Buffer
2 (EcoＲⅠ和 MseⅠ两种酶的活性均为 100%)
2. 5 μL，10 U·μL －1 MseⅠ 0. 8 μL 和 20 U·μL －1
EcoＲⅠ 0. 4 μL，最后用双蒸水将体系调整为 25
μL。针对基因组 DNA的用量设置了 4 个梯度实
·51·孙凤梅，等．薏苡 AFLP体系的建立与优化
验，分别为 200，300，400，500 ng;对酶切时间则设
置 4 个不同的梯度，在 37℃条件下对薏苡 27 号
样本分别做 2，4，6，8 h 的酶切处理。酶切后
70℃反应 15 min，使内切酶失活，完成后保存在
－ 20℃条件下。
1． 2. 3 连接
酶切后，将连接反应液加入到酶切体系中，共
25 μL。连接液包括 20 μmol·L －1 EcoＲⅠ退火接头
0. 7 μL，20 μmol·L －1 MseⅠ退火接头 7 μL，10 × T4
DNA Ligase Buffer (with 10 mmol·L －1 dNTPs)2. 5
μL，T4 DNA Ligase 1 μL，双蒸水 14. 6 μL。室温下
混匀，离心，20℃或室温下反应 2 h;反应结束后
70℃反应 15 min，使连接酶失活。
1． 2. 4 预扩增
将连接产物分别设置不同的稀释倍数(5，
10，15，20 倍)，作为预扩增的模板，进行对比实验
研究。预扩增体系为 30 μL，取 3 μL连接后并稀
释过的 DNA 样品，加入 27 μL 反应液。预扩增
体系包括 10 × PCＲ Buffer 3 μL，2. 5 mmol·L －1
dNTPs 2. 4 μL，10 μmol·L －1 EcoＲⅠ (Pre-primer)
1. 0 μL，10 μmol·L －1 MseⅠ(Pre-primer)1. 0 μL，
5 U·μL －1 Taq 酶(TaKaＲa 公司生产)，双蒸水
19. 2 μL。混匀离心后，在 BioＲad PCＲ 仪上扩
增，程序为:94℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s(每循
环增加 1 s)，共 28 个循环，72℃延伸 2 min，4℃
保温。
1． 2. 5 选择性扩增
将预扩增产物设置不同的稀释倍数(20，40，
60，80 倍)进行对比研究。选择性扩增采用 E +
3 /M +3 引物组合，20 μL反应体系，取 5 μL预扩
增产物稀释液，加入 15 μL 反应液。反应液包
括:10 × PCＲ Buffer 2. 0 μL，2. 5 mmol·L －1 dNTPs
1. 6 μL，5 ng·μL －1 EcoＲⅠ引物 1. 0 μL，30 ng·
μL －1 MseⅠ引物 1. 0 μL，5 U·μL －1 Taq 酶 0. 3
μL，ddH2O 9. 1 μL。第一轮扩增的参数为:94℃
10 s，65℃ 30 s(以后每个循环温度降低 0. 7℃，
最终降至 56℃)，72℃ 60 s，共 13 个循环。第二
轮扩增为 25 个循环，参数如下:94℃ 10 s，56℃
30 s，72℃ 60 s (以后每个循环时间增加 1 s)，最
后 72℃延伸 2 min，4℃保温。
1． 2. 6 选择性扩增产物的电泳分析
选择性扩增产物通过电泳分离检测，采用
Vos等［8］的聚丙烯酰胺凝胶电泳，并根据实验实
际情况加以改良。选择性扩增结束后，将选择性
扩增产物与甲酰胺上样缓冲液 1∶ 1 混合，95℃变
性 5 ～ 7min，变性后立即放置在冰上 2 min。在
6%聚丙烯胺酰胺凝胶(丙烯酰胺 /甲叉双丙烯酰
胺混合比例为 19 ∶ 1)上进行电泳分离。每个样
品取 2. 5 μL上样，恒压 70 V电泳 12 ～ 15 h，银染
法对电泳结果进行检测。
1． 3 银染检测
采用银染法染色，银染程序参考 Bassam［9］和
Sanguinetti［10］法，综合考虑两种染色方法的优
劣［11］，最终选择经过改良的 Sanguinetti法。将凝
胶剥下，按如下过程进行操作:双蒸水冲洗一次，
15 s;加染色液(0. 1%硝酸银溶液)，摇床轻摇 8
～ 10 min;双蒸水冲洗一次，15 s;加少量显色液
(甲醛溶液)，轻摇 15 s，弃去反应液;加入 400 mL
显色液，轻摇 2 ～ 3 min，即可见清晰条带显现［12］。
该银染法［13］摒弃了常规银染法需要固定和终止
的步骤，大大缩短了染色和显色的时间，整个染
色过程大概需要 15 ～ 20 min，条带清晰且重复性
强。终止染色反应，用凝胶成像仪拍摄后，封装
在真空袋中［14］，可长期保存并方便数据统计。
2 结果与分析
2． 1 基因组 DNA
所提取的基因组经过酚氯仿抽提和 ＲNase A
处理后，条带清晰，胶孔无亮点并且亮带下侧无
明显降解弥散现象，说明蛋白质和 ＲNA 去除干
净(图 1)。紫外分光光度计所测得的 D260 /D280
值范围在1. 7 ～ 1. 9之间，说明提取的基因组质
M:Marker;1 ～ 3:薏苡单株基因组。
图 1 薏苡样本基因组的 1%琼脂糖电泳图
Fig． 1 Pattern of Coix genomic DNA for AFLP analysis
·61· 浙江农业学报 第 26 卷 第 1 期(2014 年 1 月)
量良好，能够满足 AFLP分子标记技术的要求。
2． 2 优化的 AFLP体系
用预扩增产物对基因组最佳的酶切时间进
行了研究，结果如下图，酶切 2 h，预扩增产物弥
散范围扩大(100 ～ 800 bp 为正常范围)，说明没
有酶切完全;酶切 4，6，8 h 的预扩增产物均在正
常范围内弥散，4 h以上的酶切效率增长不明显。
M:Marker;1 ～ 4:分别代表 27 号样本经过 8，6，4，2 h酶切处
理后的预扩增产物。
图 2 不同酶切时间处理的预扩增产物琼脂糖电泳图
Fig． 2 Pattern of pre-amplified product using different
digestion time
将进行 2，4 和 6 h 酶切处理的 27 号样本分
别做了 E-ACT /M-CTG 的选择性扩增，用选择性
扩增产物对基因组的最佳酶切时间进行研究，由
图 3、图 4 可看出，酶切完全与否对选择性扩增反
应的结果影响很大。酶切进行充分时，在 500 和
750 bp 处各有一明显主带(图 3);酶切不充分
时，DNA从点样孔处开始弥散，此产物在 6%的
变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，银染，结果是
M:Marker;1 ～ 2:经 6 h，4 h限制性酶切的选择性扩增产物。
图 3 酶切充分时，选择性扩增产物琼脂糖凝胶电泳图
Fig． 3 Pattern of selective amplified product with com-
plete enzyme restriction
M:Marker;1:经过 2 h酶切处理的选扩产物。
图 4 酶切不完全时，选择性扩增产物琼脂糖凝胶电泳图
Fig． 4 Pattern of selective amplified product with incom-
plete enzyme restriction
胶图背景颜色很深，条带数和多态性位点数均很
少(图 4)，因此不能对薏苡种质资源遗传多样性
进行检测研究。
根据以上预扩增产物和选择性扩增产物的
琼脂糖电泳图结果，最终选择的酶切时间为 4 h，
酶切反应不仅进行彻底，而且能保证实验的高
效率。
2． 3 AFLP体系的建立
通过对影响 AFLP实验的几个关键因素进行
对比研究，最后建立了以基因组模板量 200 ng，
酶切时间 4 h，连接产物稀释 15 倍，预扩增产物
稀释 40 倍为最适合的薏苡 AFLP 检测体系。具
体操作如下所示:(1)酶切:DNA 200 ng，10 ×
Buffer 2 2. 5 μL，10 U·μL －1 MseⅠ0. 8 μL，20 U·
μL －1 EcoＲⅠ0. 4 μL，ddH2O 加水补足至 25 μL，
PCＲ仪中 37℃ 4 h，70℃ 15 min 内切酶失活后，
将连接反应液直接加入到酶切产物中;(2)连接:
10 × T4 Ligase Buffer(含 2. 5 mmol·L －1 ATP)2. 5
μL，20 μmol·L －1 EcoＲⅠ接头 0. 63 μL，20 μmol·
L MseⅠ接头 6. 3 μL，40 U·μL －1 T4 连接酶 1 μL，
ddH2O 14. 6 μL，PCＲ仪中 20℃ 2 h，70℃ 15 min
连接酶失活后，稀释 15 倍备用;(3)预扩增:连接
产物 3 μL，10 × PCＲ Buffer 3 μL，2. 5 mmol·L －1
dNTPs 2. 4 μL，10 μmol·L －1引物各 1 μL，5 U·
μL －1 Taq 0. 4 μL，ddH2O 19. 2 μL，94℃ 15 s，
60℃ 30 s，72℃ 60 s(每循环增加 1 s)，共 28 个循
环，72℃延伸 2 min，将预扩增产物稀释 40 倍备
用;(4)选择性扩增:选择性扩增产物 5 μL，10 ×
PCＲ Buffer 2 μL，2. 5 mmol·L －1 dNTPs 1. 6 μL，10
μ mol·L －1 E∶ Elec-primer 1 μL，10 μmol·L －1 M∶
Pre-primer 1. 6 μL，5 U·μL －1 Taq 0. 3 μL，ddH2O
·71·孙凤梅，等．薏苡 AFLP体系的建立与优化
9. 1 μL，94℃ 2 min，94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 60
s，每个循环退火温度降低 0. 7℃，13 个循环。
94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 60 s，延伸温度每个循
环增加 1 s，25 个循环。
2． 4 遗传多样性分析
通过该优化后的体系，我们分析了薏苡种质
资源的遗传多样性。从 64 对选扩引物组合中筛
选出 12 对多态性较强、高分辨率的引物组合，引
物组合为 EcoＲⅠ-MseⅠ:ACC /CTG，AAG /CAC，
ACA /CAT， ACA /CTT， ACT /CAC， ACT /CTA，
ACC /CTA， ACC /CTC， ACC /CTT， AAC /CTG，
AAG /CAC，ACA /CAG。利用这 12 对引物组合对
30 个薏苡样本进行片段长度多态性扩增，共扩增
出 9 870 条带，多态性条带为 8 790，其多态性比
率为 89. 1%，通过体系的优化，得到清晰的 AFLP
选择性扩增图(图 5)。
注:箭头指示的为多态性条带。
图 5 薏苡样本的 ACT /CTG引物选择性扩增产物电泳图
Fig． 5 Pattern of selective amplified product of Coix using the primer ACT /CTG
3 讨论
AFLP反应程序主要包括 DNA 模板的制备、
酶切与连接、预扩增、选择性扩增、凝胶电泳检测
和银染分析等步骤。整个操作流程复杂，影响因
素繁多，在利用 AFLP 分子标记技术对某供试样
本进行研究时，必须针对几个关键因素进行体系
的优化选择［15］。
完整性好的基因组 DNA 能够保证在后续的
试验中获得整个基因组的多态性信息;高纯度的
DNA能够保证限制性内切酶的活性充分发挥，使
得酶切充分完全。DNA 容易降解，尽量取材新
鲜，低温操作;为保证酶切充分，要将 ＲNA、酚类、
蛋白质等杂质去除干净，并避免提取过程中引入
乙醇等有机溶剂污染。天根植物基因组提取试
剂盒所提取的薏苡基因组纯度高，基本符合酶切
的要求［16］。
AFLP反应中，酶切是否完全直接决定实验
的成败。而不同植物样本的基因组大小、序列以
及所含的次生代谢产物各不相同，因此酶切时间
也是不同的。本试验所采取的 4 个酶切时间梯
度中，4 h是最为适合的。酶切时间 2 h，酶切不
完全，在预扩增结果中出现大分子量的片段，且
选扩产物中条带数很少，不能真实地反映整个基
因组的信息。酶切 10 h，时间过长，接头不能连
接上去，出现假阴性情况。由于酶切充分与不充
分造成的多态性条带分布不同，不能代表样本真
·81· 浙江农业学报 第 26 卷 第 1 期(2014 年 1 月)
实的遗传信息，因而不能作为物种鉴定的依
据［17］。所以将限制性内切酶确定为 8 U 的条件
下，需要对酶切时间进行选择，最终确定酶切时
间为 4 h，既保证了酶切完全充分，也降低了酶切
过量的可能性。
预扩增反应是整个反应体系中比较关键的
步骤，它在整个反应体系中起到承上启下的作
用，不仅可以作为指示酶切和连接反应进行是否
完全充分的标志，而且还直接影响到选择性扩增
反应的电泳结果，所以只有预扩增反应的条件稳
定，选择性扩增反应的可重复性才高。通过对预
扩增反应体系的优化表明，dNTPs 的浓度对反应
的影响较大，浓度过高，导致非特异性产物增多，
预扩增产物的弥散范围增大，影响选择性扩增反
应;浓度低时，预扩增产物少，条带模糊不清，难
于统计。
在配制聚丙烯酰胺凝胶时，为保证玻璃板干
净，每次实验之前需用 75%酒精棉擦拭玻璃板表
面，以避免灌胶时产生气泡;将玻璃板固定在电
泳槽上时，要倾斜着先将玻璃板的一侧插入电泳
槽中，边排气泡边将玻璃板的另一侧也插入缓冲
液，以避免气泡形成的绝缘体使得电压分布不均
匀。选择性扩增产物上样之前，6%变性聚丙烯
酰胺凝胶要进行至少 30 min预电泳，保证胶面温
度维持在 40 ～ 60℃，并且在电泳的过程中，磁力
搅拌器持续慢速对电泳液进行搅拌，既可以散
热，又使得电泳液的离子浓度分布均匀，经染色
之后的条带平稳整齐。硝酸银需要完全溶解，否
则在显色时，硝酸银颗粒会嵌入到胶中而出现黑
色斑点，造成胶面背景不清晰。电泳液(离子浓
度及 pH稳定)、AgNO3 染色液(Ag
+量稳定)和显
影液(HCHO量稳定)要及时更换，保证实验在最
佳的条件下完成。该试验针对影响薏苡 AFLP反
应的几个关键因素进行了研究，但 PCＲ的每个环
节都对实验产生影响，包括体系中各组分的用量
及时间因素等，因此为了建立稳定、重复性高以
及高效的的薏苡 AFLP 反应体系，还需要进行单
因素的深度研究。
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(责任编辑 张 韵)
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