全 文 ：收稿日期:2009-02-03作者简介:郭妍(1984-),女 ,硕士研究生 ,研究方向:中药制剂分析;E-mail:15840951126@139.com。＊通讯作者:郭晏华 , Tel:0411-87586007, E-mail:guoyanhualnu@sina.com。
淡竹叶药材 HPLC指纹图谱研究
郭　妍 ,郭晏华＊
(辽宁中医药大学药学院 ,辽宁 大连 116600)
　　摘要　目的:采用 HPLC法建立淡竹叶药材的指纹图谱。方法:采用 AgilentEclipseXDB-C
18
(150 mm×4.6
mm, 5 μm)色谱柱;以甲醇(A)-3%冰乙酸(B)为流动相 , 进行梯度洗脱;采用波长切换法检测;流速:1.0 mL/min;
柱温:30 ℃。结果:检测了不同来源 15批淡竹叶药材 , 标定了 16个共有峰 , 相似度较高 , 各色谱峰分离度较好 ,达
到了中药指纹图谱研究的技术要求。结论:本法准确 、可靠 ,建立的 HPLC指纹图谱为淡竹叶的质量控制提供更全
面的信息。
关键词　淡竹叶;HPLC;指纹图谱
中图分类号:R282.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2010)01-0041-04
StudyonFingerprintsSpectrumofLophatherumgracilebyHPLC
GUOYan, GUOYan-hua
(LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine, Dalian116600, China)
Abstract　Objective:ToestablishthefingerprintspectrumofLophatherumgracilebyHPLC.Methods:Thesamplesweresepara-
tedonAgilentEclipseXDB-C18 column(150 mm×4.6 mm, 5 μm)withmethanol(A)-3% aceticacid(B)asthemobilephaseata
flowrateof1.0 mL/minat30centigrades, adoptingthegradientelutionprocesswithswitchingtheWavelength.Results:15samplesof
differentoriginLophatherumgracileBrongnweredetectedand16 peaksinthechromatogramwerecommon.therewasahighsimilarity
andeachchromatographicpeakwasobtainedwithgoodseparationandcorrelationaccordingtothetechnicalrequirementsoffingerprint
ofChinesetraditionalmedicine.Conclusion:Themethodisaccurate, reliableandthefingerprintspectrumprovidesmoreinformationfor
controlingthequalityofLophatherumgracile.
Keywords　LophatherumgracileBrongn;HPLC;Fingerprintspectrum
　　淡竹叶为禾本科草本植物淡竹叶(Lophatherum
gracileBrongn)的干燥茎叶 〔1〕。主产于湖南 、浙江 、
安徽 、四川等省 ,具有清热除烦 、利尿的功效 ,多用于
热病烦渴 、口舌生疮 、小便赤色淋痛等症。淡竹叶中
含有大量的黄酮 、内酯 、氨基酸和糖类等成分 ,具有
解热 、利尿 、抗菌 、抗肿瘤等多种药理活性 〔2〕 ,淡竹
叶生长周期短 ,更生能力旺 ,资源丰富 ,除药用外 ,尚
可用于食品 、保健品等方面 ,值得充分开发利用 。由
于受产地 、气候和生态环境的影响 ,不同来源药材的
指标性成分含量差异较大 ,但目前尚未有淡竹叶药
材的质量控制标准。本文建立了淡竹叶药材的指纹
图谱 ,为更好地控制药材内在质量提供科学依据。
1 　仪器与材料
1.1 　仪器　Agilent1100型四元泵高效液相色谱
仪 , SPD-10A紫外检测器 , SHB-3循环水多用真空
泵 , UV-4802型紫外 -可见分光光度计 , SHIMADZU
AY220型电子分析天平 。
1.2 　材料　反式对香豆酸对照品由天津一方科技
公司提供。本研究收集了 15批不同来源的淡竹叶
药材 ,经辽宁中医药大学李峰教授鉴定均为禾本科
植物淡竹叶 LophatherumgracileBrongn的干燥茎叶 ,
样品来源见表 1。甲醇为色谱纯 ,水为重蒸馏水 ,其
他试剂均为分析纯 。
　表 1　 淡竹叶样品的来源
样品编号 来源 样品编号 来源
1 湖南
2 山东
3 杭州
4 北京
5 广东
6 铁岭
7 内蒙古
8 河南
9 上海
10 江苏
11 甘肃
12 鞍山
13 沈阳
14 山西
15 大连
2　方法与结果
2.1　色谱条件　AgilentEclipseXDB-C18(150mm
×4.6 mm, 5 μm)色谱柱;以甲醇 (A)-3%冰乙酸
(B)为流动相进行梯度洗脱 ,洗脱程序见表 2;流速:
1.0 mL/min;柱温:30 ℃;检测波长的选择:为使色
谱图上所得峰数目更多 ,分离度更好 ,选用波长切换
·41·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 1期 2010年 1月
法 。波长切换程序为:0min※260nm、30min※308
nm、60min※331nm。
　表 2　 流动相梯度洗脱程序
时间 /min 甲醇 /% 3%冰乙酸 /%
0 ～ 15 5 95
15 ～ 22 10 90
22 ～ 32 12 88
32 ～ 45 16 84
45 ～ 58 20 80
58 ～ 90 24 76
2.2 　对照品溶液的制备　精密称取反式对香豆酸
对照品适量 ,置 10mL棕色容量瓶中 ,加甲醇溶解并
定容 ,制得浓度为 0.223 mg/mL的对照品储备液 ,
备用。
2.3　供试品溶液的制备　精密称取淡竹叶药材
(过 40目筛)1.5 g,加入 60%乙醇 60 mL(pH=3),
加热回流 2 h,过滤 。滤液蒸干 ,加热水 15mL超声
使溶解 , 离心 10 min。取处理好的大孔吸附树脂
(AB-8)5 g装入柱中(1 cm×24 cm),离心液上样 ,
收集 40%和 60%乙醇洗脱液 ,浓缩 ,用 60%乙醇定
容至 10mL,经 0.45 μm微孔滤膜过滤 ,滤液作为供
试品溶液 ,备用 。
2.4　测定方法　分别精密吸取对照品溶液和供试
品溶液各 10μL,注入高效液相色谱仪 ,记录 90 min
色谱峰。以反式对香豆酸的色谱峰的保留时间为
1,计算共有峰的相对保留时间 。淡竹叶样品 HPLC
指纹图谱见图 1。
图 1　淡竹叶样品 HPLC指纹图谱
9(S).反式对香豆酸
　　表 3　 淡竹叶药材指纹图谱中共有峰相对保留时间及相似度
NO 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′ 7′ 8′ 9′ 10′ 11′ 12′ 13′ 14′ 15′ 对照模板
1 0.1585 0.1589 0.1557 0.1593 0.1594 0.1576 0.1597 0.1594 0.1587 0.1597 0.1594 0.1587 0.1587 0.0000 0.1576 0.1474
2 0.2189 0.2192 0.2174 0.2192 0.2250 0.2192 0.2186 0.2192 0.2192 0.2197 0.2198 0.2195 0.2192 0.2188 0.2169 0.2195
3 0.3792 0.3730 0.3721 0.3731 0.3735 0.3733 0.3735 0.3728 0.3736 0.3732 0.3734 0.3732 0.0000 0.3725 0.3712 0.3464
4 0.4307 0.4331 0.4311 0.4336 0.4339 0.4335 0.4332 0.4194 0.4298 0.4303 0.4300 0.4293 0.3735 0.4314 0.4288 0.4266
5 0.4684 0.4684 0.4664 0.4688 0.4688 0.4676 0.4700 0.4692 0.4697 0.4695 0.4699 0.4696 0.4695 0.4689 0.4671 0.4689
6 0.5548 0.5557 0.5542 0.5562 0.5562 0.5559 0.5563 0.5564 0.5555 0.5554 0.5558 0.5554 0.5558 0.5553 0.5531 0.5556
7 0.7743 0.7751 0.7724 0.7766 0.7763 0.7750 0.7778 0.7761 0.7757 0.7748 0.7725 0.7784 0.7737 0.7740 0.7722 0.7752
8 0.9511 0.9538 0.9517 0.9541 0.9538 0.9535 0.9524 0.9542 0.9504 0.9510 0.9497 0.9507 0.9505 0.9528 0.9510 0.9521
9 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000
10 1.2628 1.2631 1.2589 1.2634 1.2616 1.2585 1.2639 1.2643 1.2645 1.2675 1.2657 1.2653 1.2638 1.2649 1.2638 1.2634
11 1.5096 1.5085 1.5048 1.5111 1.3584 1.5030 1.5125 1.5125 1.5136 1.5172 1.5510 1.5154 1.5121 1.5090 1.5118 1.5028
12 1.6186 1.6199 1.6137 1.6200 1.5086 1.6124 1.6201 1.6219 1.6197 1.6251 1.6802 1.6213 1.6185 1.6219 1.6225 1.6158
13 1.8375 1.8399 1.8366 1.8413 1.6181 1.8309 1.8379 1.8412 1.8418 1.8742 1.8432 1.8432 0.8390 1.8442 1.8448 1.8264
14 1.8844 1.8892 1.8832 1.8900 1.8389 1.8775 1.8860 1.8881 1.8889 1.8931 1.8906 1.8902 1.8845 1.8933 1.8916 1.8841
15 1.9379 1.9411 1.9428 1.9436 1.8849 1.9344 1.9384 1.9428 1.9418 1.9471 1.9462 0.0000 0.0000 1.9462 1.9483 1.6605
16 2.2160 2.2205 2.2308 2.2258 2.2227 2.2159 2.2160 2.2243 2.2171 2.2250 2.2989 2.2162 2.2118 2.2281 2.2335 2.2264
相关系数 0.9951 0.9951 0.9950 0.9951 0.9907 0.9951 0.9951 0.9951 0.9951 0.9951 0.9957 0.8138 0.8219 0.9941 0.9950 1.0000
夹角余弦 0.9987 0.9987 0.9986 0.9986 0.9975 0.9987 0.9987 0.9986 0.9986 0.9987 0.9988 0.9420 0.9393 0.9982 0.9986 1.0000
·42· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 1期 2010年 1月
　　表 4　 淡竹叶药材指纹图谱中共有峰相对峰面积及相似度
NO 1′ 2′ 3′ 4′ 5′ 6′ 7′ 8′ 9′ 10′ 11′ 12′ 13′ 14′ 15′ 对照模板
1 0.0893 0.0203 0.0503 0.0569 0.0652 0.0364 0.0228 0.0904 0.0298 0.0452 0.0197 0.0229 0.0201 0.0000 0.0257 0.0397
2 0.0415 0.0568 0.0402 0.0619 0.0205 0.0463 0.0231 0.0686 0.0565 0.0601 0.0603 0.0233 0.0295 0.0256 0.0303 0.0430
3 0.2066 0.2966 0.2503 0.1784 0.1827 0.1892 0.1860 0.5562 0.1325 0.3785 0.1455 0.2763 0.0000 0.1181 0.4841 0.2387
4 0.1587 0.2695 0.1521 0.1483 0.1887 0.1084 0.0638 0.0206 0.0817 0.1251 0.0384 0.0565 0.2480 0.1044 0.3860 0.1434
5 0.0567 0.1294 0.0760 0.0490 0.0952 0.0652 0.0454 0.1257 0.0393 0.0693 0.0548 0.0703 0.0761 0.0467 0.0792 0.0719
6 0.1313 0.1180 0.1130 0.1122 0.1457 0.1028 0.1029 0.1584 0.0915 0.2312 0.1023 0.1021 0.1386 0.0851 0.1500 0.1257
7 0.0720 0.0591 0.0507 0.0815 0.1349 0.0420 0.0413 0.0750 0.0326 0.1499 0.1280 0.0510 0.0544 0.0437 0.0738 0.0727
8 1.4913 2.4978 1.9539 1.5376 1.4679 1.1535 0.8768 0.3935 0.6469 1.4136 0.2748 0.6211 0.2591 0.8879 0.4194 1.0597
9 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000
10 0.1278 0.1034 0.1565 0.2147 0.2355 0.2393 0.0999 0.2536 0.1556 0.4474 0.2027 0.1048 0.1925 0.1391 0.2630 0.1957
11 0.5402 0.1987 0.4170 0.6594 0.7093 0.8078 0.0931 0.1042 0.1907 0.4519 0.0268 0.1624 0.0592 0.1762 0.0529 0.3100
12 0.7820 1.8855 1.3209 1.7363 0.5806 1.2990 0.3930 0.2871 0.4106 0.6449 0.2031 0.0929 0.0721 0.9600 0.2528 0.7281
13 0.8177 1.8656 1.0368 1.6659 1.6051 1.0538 0.5459 0.6211 0.3864 0.8983 1.2281 0.2859 0.2092 1.5288 0.4228 0.9514
14 2.2738 4.7474 3.3430 2.2681 1.6201 1.8393 1.8945 0.7596 0.9695 2.0344 0.1458 0.3200 0.3175 1.2466 0.7949 1.6383
15 0.2261 0.6867 0.3325 0.5313 0.6864 0.4180 0.1482 0.0686 0.0623 0.2635 0.1183 0.0000 0.0000 0.4119 0.0525 0.2671
16 1.1164 3.2462 1.3130 1.2387 0.8829 1.4163 0.6352 0.4483 0.3074 0.7929 0.2321 0.1487 0.0927 1.3140 0.4394 0.9116
相关系数 0.9728 0.9299 0.9535 0.9464 0.9204 0.9469 0.9518 0.7949 0.9110 0.9672 0.4958 0.6209 0.5084 0.9080 0.7733 1.0000
夹角余弦 0.9845 0.9532 0.9685 0.9734 0.9621 0.9744 0.9640 0.9038 0.9528 0.9842 0.7037 0.7891 0.7112 0.9529 0.8937 1.0000
2.5 　方法学考察
2.5.1　精密度试验:取同一供试品溶液 ,连续进样
5次 ,测得各共有峰的相对保留时间 ,结果 RSD为
1.2% ～ 4.5%,符合指纹图谱技术要求 。
2.5.2　重复性试验:取同一批药材 5份 ,按 “ 2.3”
项下方法制备供试品溶液 ,测得各共有峰的相对保
留时间 ,结果 RSD为 0.8% ～ 3.7%,说明此方法稳
定 、可靠。
2.5.3　稳定性试验:取同一供试品溶液 ,分别在
0、6、12、24、48 h进样 ,测得各共有峰的相对保留时
间 ,结果 RSD为 0.8% ～ 3.7%,说明供试品在 48 h
内稳定 。
2.6 　指纹图谱的分析与评价
2.6.1　共有峰的标定:根据 15批不同来源的淡竹
叶药材 HPLC指纹图谱检测结果 ,进行相似度评价 。
标定了 16个共有特征峰 ,其中保留时间为 34 min
的峰即 9号峰为反式对香豆酸的指纹峰 ,与相邻峰
分离度较好 ,出峰位适中 ,其峰高与峰面积适中 ,故
选定反式对香豆酸色谱峰为参照峰 S,以其保留时
间和峰面积为 1,计算各峰的相对保留时间和相对
峰面积 ,见表 3、4。
2.6.2　相似度评价:分别对 15批淡竹叶药材指纹
图谱进行匹配 ,并以 15批样品生成的对照谱图(平
均数法)作为对照模板 ,计算其相似度 ,见表 3、4。
2.7　各产地药材指纹图谱的聚类分析　对 15批
不同来源的淡竹叶药材作指纹图谱分析 ,获得包括
反式对香豆酸的 16个色谱峰 ,将各色谱峰相对于内
参比峰的峰面积量化 ,得到 15 ×16阶原始数据矩
阵 ,运用 “SPSS软件 ”对色谱图相关数据进行聚类分
析研究。采用分层聚类分析方法以欧式距离作为相
本间的相似性测度 , 采用组间联结法 (between-
groupslink-age),分别以相对保留时间和相对峰面积
作为变量 ,对于样本之间的相似程度和不同变量对
其影响进行了分析和探讨。见图 2、3。
　　从图 2聚类结果分析 , 15个不同来源药材可分
为两大类 ,鞍山 、沈阳为 Ⅱ类 ,其他为 Ⅰ类 。由表 3
相似度计算得出 , Ⅰ类药材的相似度都在 0.90 ～
1.00之间 ,而 Ⅱ类药材相似度在 0.90以下 。从图 3
聚类结果分析 , 15个不同来源药材可分为四大类 ,
山东为Ⅰ类 ,杭州为 Ⅱ类 ,质量较好。湖南 、北京 、广
东 、铁岭 、内蒙古 、山西 、江苏为 Ⅲ类 ,质量次之。河
南 、上海 、大连 、鞍山 、沈阳 、甘肃为Ⅳ类 ,质量较差。
由表 4相似度计算得出 ,Ⅰ类 、Ⅱ类 、Ⅲ类药材相似度都
在 0.90以上 ,而Ⅳ类药材与其他类相似度相差较远。
·43·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 1期 2010年 1月
图 2　共有峰相对保留时间聚类分析图
图 3　共有峰相对峰面积聚类分析图
3 　讨论
3.1 　供试品溶液制备条件优选　分别对提取溶剂
和提取方法(超声提取 、加热回流提取和索氏提取)
进行考察 ,结果表明以乙醇为溶剂 ,加热回流提取所
得的峰数目最多 ,各峰对称性更好。利用正交实验
考察了乙醇的浓度 、提取时间 、溶剂用量和提取次数
对提取效果的影响 ,最终确定了供试品的制备方法 。
3.2 　样品的预处理　考察了不同型号大孔吸附树
脂的纯化处理效果 ,发现 AB-8型大孔吸附树脂的
纯化效果较好 ,且便于再生处理 ,综合考虑 ,最终选
用 AB-8型大孔吸附树脂对样品进行预处理。
3.3　色谱条件的优化　采用单一波长所得的图谱
峰数目较少 ,而波长切换则使出峰数目增多 ,峰形
佳 ,基线平稳 ,因此采用波长切换法。本实验曾对甲
醇-水 、乙腈-水等体系进行考察 ,结果表明甲醇-3%
冰乙酸水溶液系统分离良好 。
3.4　参比峰的确定　香草酸(6号),反式对香豆
酸(9号)和牡荆素(14号)均为淡竹叶药材中的指
标性成分 ,但反式对香豆酸(9号)在指纹图谱中峰
位适中 ,峰形对称性好 ,且相对稳定 ,因此选其作为
参比峰。
3.5　相似度评价及聚类分析　相似度评价和聚类
分析的结果表明该两种不同测度间可互相认证。用
该法分析未知样品时 ,只需测得该样品的指纹图谱 ,
计算未知样品与共有模式间的相似度 ,即可对样品
进行分类鉴定和评价。
3.6　实验结果显示 ,不同来源淡竹叶药材指纹图
谱具有相似性 ,但又不完全一致;主要峰群的整体面
貌基本一致 ,但各成分峰面积的相对比值有所不同。
植物类中药由于生长环境 、土壤性质等原因 ,使植物
体内的成分之间有所不同 ,表现在 HPLC色谱图上
则是某些峰位的差异 ,从而表现出彼此之间的亲疏
差别;而由于自然环境等各因素的影响 ,质量也存在
很大的差异 ,反映在色谱图上即是在相似的保留时
间上具有不同的峰面积 。运用指纹图谱和聚类分析
相结合的方法 ,能更全面 ,综合 ,准确地判别药材的
真伪与优劣 ,可以作为淡竹叶药材质量检测的一种
手段 。
参 考 文 献
[ 1] 国家药典委员会 .中华人民共和国药典 [ S] .一部.北
京:化学工业出版社 , 2005:230.
[ 2] 梅全喜 .现代中药药理与临床应用手册 [ M] .北京:中
国中医药出版社 , 2008:108.
2008年 《中药材 》杂志精装本已装订完毕 ,分上 、中 、下册 , 400元一套(包含邮资)。
·44· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 33卷第 1期 2010年 1月