全 文 ：第 4卷 第 4期
2 0 0 6年 1 2月
湿　地　科　学WETLAND　SCIENCE Vol.4　No.4Dec., 2 0 0 6
收稿日期:2006-07-12;修订日期:2006-10-27
基金项目:黑龙江省杰出青年基金(JC03-09)项目资助。
作者简介:沈光(1977-),男 ,吉林省白城人 ,助理研究员 ,主要研究方向为生物多样性和植物信息系统。E-mail:shen772@gmail.com
应用 ISSR标记分析三江平原狭叶甜茅
不同种群的遗传多样性
沈　光 1, 2 ,倪红伟1 ,徐香玲 2
(1.黑龙江省科学院自然资源研究所 , 黑龙江 哈尔滨 150040;2.哈尔滨师范大学生物系 , 黑龙江 哈尔滨 150000)
摘要:以三江平原狭叶甜茅(Glyceriaspiculosa)为研究对象 ,选取 3个不同群落类型:狭叶甜茅优势种群落 、狭叶
甜茅和毛苔草(Carexlasiocarpa)为共建种的群落以及狭叶甜茅为主要伴生种的群落 ,共 45个材料进行了ISSR分
子标记分析。结果从 41个引物中筛选出 7个有效引物 ,扩增出 80条清晰条带 , 平均每个引物扩增了 11.4条带 ,
其中 70个位点是多态的 ,总的多态位点比率为 87.5%, 表明被测材料间 ISSR标记多态性较高。利用Popgen
(version1.32)软件分析了扩增结果 ,并得到了狭叶甜茅不同群落类型的遗传距离 、遗传一致度 、Nei和Shannon信
息指数等遗传特征。结果表明 , 对于一个物种来说 , 当地理距离太近不能成为影响其遗传多样性水平的因素时 ,
其构成的种群在群落中的地位将是影响遗传多样性水平的主要因素之一。
关 键 词:狭叶甜茅;群落;三江平原;ISSR;多态性;遗传多样性
中图分类号:Q75　文献标识码:A　文章编号:1672-5948(2006)04-286-06
　　狭叶甜茅(Glyceriaspiculosa)是禾本科甜茅属
多年生根茎型水生草本植物 ,生于湿草甸 、溪边和
沼泽地当中 ,分布于中国的黑龙江 、辽宁 、内蒙古 ,
以及俄罗斯西伯利亚和远东地区 [ 1] 。它是三江平
原湿地生态系统的重要建群种 ,常形成大片的密集
群丛而成为湿地生态系统的主要植被和生产者 ,是
三江平原湿地的标志性植物和重要的纤维资源植
物 ,是维持三江平原湿地生态功能的重要组成部
分 [ 2] 。
ISSR是一种在 PCR中直接使用微卫星序列进
行 DNA扩增的分子标记的方法 。它具有操作简
单 、快速 、高效 ,不需要繁琐的构建基因文库等优
点 ,适用于任何富含 SSR重复单元和 SSR广泛分
布的物种 ,可同时提供多位点信息和提示不同微卫
星座位个体间变异的信息 ,并且遗传多态性高 ,重
复性好 [ 3] 。至今尚未见其应用于狭叶甜茅遗传多
样性方面的报导 。
本研究利用 ISSR方法 ,从种群的角度阐明宏
观生态环境的变化对狭叶甜茅在各级水平特别是
分子水平的影响;研究狭叶甜茅的适应机制和进化
潜力;分析狭叶甜茅的遗传结构;揭示在自然条件
下对自然选择的适应方式和在长期进化历史中的
进化路线。研究结果对于狭叶甜茅的保护 、经营管
理 、种群恢复以及发展动态的预测都具有重要意
义 ,并可以为生物多样性尤其是湿地的保护和利用
提供理论指导。
1　材料和方法
1.1　供试材料
在三江平原的洪河自然保护区和大兴保护区
分别选择 3块不同的典型狭叶甜茅群落样地 。在
洪河保护区设 2个样品采集群落 ———狭叶甜茅与
毛苔草(Carexlasiocarpa)共建种群落和以狭叶甜
茅为主要伴生种的群落;在大兴保护区设一个样品
采集群落———狭叶甜茅优势种群落 。
实验选择的 3个群落类型的特征见表 1。每
个群落按同一方向随机采取 15株狭叶甜茅无性系
分株以提取 DNA,两株之间至少相距 10 m,且每株
丛径大小一致 。 DNA提取采用改良的 CTAB
法[ 4] 。
1.2　ISSR检测
从 41个购买的引物当中筛选了 7个有效引物
DOI :10.13248/j.cnki.wet landsci.2006.04.009
　4期 沈光等:应用 ISSR标记分析三江平原狭叶甜茅不同种群的遗传多样性 287　
表 1　3个群落类型的特征
Table1　Characteristicsofthreecommunities
群落类型 地理坐标 土壤类型 群落植物组成 平均水深
狭叶甜茅优势群落
47°1′14″N
133°11′33″E
海拔 43m
腐泥沼泽土
狭叶甜茅(相对密度 91.7%)为优势种 ,小叶章
(Calamagrostisangustifolia)和漂筏苔草(Carex
pseudocuraica)为伴生种。
32～ 35cm
狭叶甜茅 、毛苔草
共建群落
47°47′17″N
133°37′38″E
海拔 52m
泥炭沼泽土
狭叶甜茅(相对密度 41.2%)、毛苔草 (相对密
度 40.3%)为优势种 , 漂筏苔草 、球尾花(Lysi-
machiathyrsiflora)、乌苏里蓼(Polygonumkor-
shinskianum)等为伴生种。
2.22cm
狭叶甜茅为主要伴
生种群落
47°47′18″N
133°37′42″E
海拔 46m
泥炭沼泽土
漂筏苔草为优势种 , 狭叶甜茅 (相对密度
11%)、毛苔草 、睡菜(Menyanthestrifoliata)、球
尾花 、湿生狗舌草(Tephroserispalustris)、乌苏里
鸢尾(Irismaacki)、羊草(Leymuschinensis)、水
问荆(Equisetumfluviatile)为伴生种。
2.37cm
(表 2)。 PCR扩增采用 Tsumura的体系[ 3] 。反应
总体积 25μL,其中含 20ng的模板 , 0.2×10-3 mol
的 dNTP, 1.5ng/μL的引物 , 1.5U。的 TaqDNA聚
合酶 , 1.5×10-3 mol的 Mg2+, 1×bufer(含 0.1mol
的 Tris-HCl(PH8.3)和 0.5 mol的 KCl)。 PCR
反应共进行 40个循环 , 每个循环 94 ℃变性 30 s,
表 2　ISSR引物序列及扩增结果　
Table2　SequencesofISSRprimersandamplifiedresults
引物 扩增条带总数 多态性条带总数
群落
狭叶甜茅
优势群落
狭叶甜茅与毛苔
草共建群落
狭叶甜茅为主要
伴生种群落
每个引物检出的
多态性条带百分率
808(AG)8C 12 10 8 9 9 83.33%
809(AG)8G 15 14 10 13 7 93.33%
827(AC)8G 11 9 7 8 7 81.82%
834(AG)
8
CT 10 9 7 6 4 90%
836(AG)8CA 14 12 11 9 12 85.71%
848.1(CA)8AG 12 11 10 11 10 91.67%
848.2(CA)8TG 6 5 5 5 4 83.33%
合计 80 70 58 61 53
多态条带百分率(%) 87.50% 72.50% 76.25% 66.25% 87.02%
55 ℃退火 45 s, 72 ℃延伸 2 min。在 GeneAmp
PCRSystem9700PCR仪上进行。采用 1.5%琼脂
糖凝胶电泳 , 0.5 μg/mLEB染色检测扩增产物。
电泳结果在紫外凝胶成像系统(AmershamBiosci-
ences)下拍照 。
1.3　数据处理
记录扩增谱带:采用人工读带法 ,根据条带的
迁移率和有无记录二元数据 ,有带为 1,无带为 0。
为减小误差只记录易于辨认的条带 ,排出模糊不清
的带;无法准确辨认的带应予以排除;条带迁移率
相同而强度不同时 ,如果强带超过弱带的 2倍 ,应
为不同的带 。
区别共有带和特征带:在统计了所有的共有带
和特征带后 ,根据以下公式计算多态性指数 P:
P=(总带数 -共有带数)/总带数
数据的统计:统计分析在 Popgen(version
　 288　 湿　　地　　科　　学 4卷
1.32)软件系统下进行 。
2　结果与分析
2.1　ISSR多态性
利用 7个 ISSR引物对 45份狭叶甜茅材料进
行了 ISSR多态性检测 ,扩增结果如表 2。 7个引物
扩增出 80条清晰条带 ,代表 80个引物结合位点 ,
平均每个引物扩增了 11.4条带 ,其中 70个位点是
多态的 ,总的多态位点比率为 87.50%。每个引物
扩增出的条带不同 ,其中 836扩增出的条带最多 ,
为 14条;最少的为 848.2,仅有 6条 ,而且每个引
物检出的多态性条带百分率也不同。这些结果说
明 ISSR标记能够揭示材料间较高的多态性。
2.2　种群间的遗传距离和样品间的遗传一致度
遗传一致度 (geneticidentity, I)和遗传距离
(geneticdistance, D)是评价种群内和种群间遗传
变异水平的重要指标 [ 5] 。根据 7个有效引物 PCR
扩增产物的电泳结果 ,遗传一致度(I)和遗传距离
(D)按 Nei[ 5]的方法计算出狭叶甜茅各种群的遗传
一致度(表 3),遗传一致度越大 ,亲缘关系越近 ;
表 3　狭叶甜茅不同种群遗传距离和一致度
Table3　GeneticidentityandgeneticdistanceofGlyceriaspiculosapopulations
popID 狭叶甜茅共建种群 狭叶甜茅优势种群 狭叶甜茅伴生种群
狭叶甜茅共建种群 ＊＊＊＊ 0.931 1 0.936 7
狭叶甜茅优势种群 0.071 4 ＊＊＊＊ 0.964 8
狭叶甜茅伴生种群 0.065 4 0.035 9 ＊＊＊＊
　注:对角线以上数据为 Nei的遗传一致度;对角线以下数据为遗传距离。
遗传距离越大 ,说明亲缘关系越远 。遗传距离 D
值是显性基因频率的函数。从表 3可知 ,狭叶甜茅
优势种群与狭叶甜茅伴生种群之间的遗传距离 D
值最小为 0.035 9,狭叶甜茅优势种群与狭叶甜茅
共建种群之间的遗传距离 D值最大为 0.071 4,狭
叶甜茅伴生种群与狭叶甜茅共建种群之间的遗传
距离为 0.065 4。根据遗传距离的大小可以获得 3
个种群的聚类关系图(图 1),可以看出 ,狭叶甜茅
3个种群的遗传距离和实际的水平地理距离之间
没有相关性 ,这可能是因为 3个群落样地之间的地
理距离较近 ,所以狭叶甜茅 3个种群的遗传距离并
没有反应出地理距离对它们的影响 。3个种群的
　　+-------------------------pop1(狭叶甜茅共建种群)
--2
　　! +-----------------pop2(狭叶甜茅优势种群)
　　+------1
+-----------------pop3(狭叶甜茅伴生种群)
图 1　不同种群遗传距离的聚类图
Fig.1　Dendrogramofgeneticdistanceofdifferentpopulations
遗传一致度的值在 0.931 1和 0.964 8之间 ,狭叶
甜茅优势种群和狭叶甜茅伴生种群最为相似 ,狭叶
甜茅优势种群和狭叶甜茅共建种群相差最大。
3　讨　论
根据 Shannon信息指数 [ 6]估算狭叶甜茅种群
生物多样性水平的结果为:狭叶甜茅共建种群 >狭
叶甜茅优势种群 >狭叶甜茅伴生种群 (表 4),与
Nei指数计算结果一致。这 3个种群因多年未加
任何利用 ,无人为选择压力 ,所以基因型有可能产
生突变。以上 2种方法得到的种群间遗传多样性
和种群内遗传多样性的比例大体一致 ,都是大部分
的遗传变异存在于种群内 ,小部分的遗传变异存在
于种群间 。狭叶甜茅优势种群和狭叶甜茅伴生种
　4期 沈光等:应用 ISSR标记分析三江平原狭叶甜茅不同种群的遗传多样性 289　
表 4　由 Nei指数和 Shannon指数估计不同狭叶甜茅种群的遗传多样性
Table4　GeneticdiversityofdiferentGlyceriaspiculosapopulationsbased and
onNeiShannonindexes
种群 狭叶甜茅优势种群 狭叶甜茅共建种群 狭叶甜茅伴生种群
样本数 15 15 15
na 1.612 5 1.762 5 1.587 5
ne 1.404 8 1.498 5 1.415 2
h 0.232 8 0.284 0 0.232 1
I 0.342 7 0.417 9 0.339 0
　注:na:观察的等位基因数;ne:有效的等位基因数;h:Nei基因多样性 [ 5] ;I:Shannon信息指数 [ 6] 。
群的遗传多样性水平比较一致 ,而狭叶甜茅共建种
群的遗传多样性水平要高一些 ,这说明在一个种群
内狭叶甜茅的数量太多或太少都影响其遗传多样
性水平 。我们可以这样分析 ,经过长时间的演替进
化 ,形成了狭叶甜茅与毛苔草共建种群落 ,并保持
了较高的遗传多样性水平 ,当环境条件发生改变
时 ,如其生存环境水位的上升或下降导致发生了群
落演替 ,根据适者生存的法则 ,一部分狭叶甜茅被
淘汰 ,形成了两极分化 ,这样形成了狭叶甜茅优势
种群和狭叶甜茅伴生种群 ,所以狭叶甜茅优势种群
和狭叶甜茅伴生种群的遗传多样性水平要比狭叶
甜茅共建种群要低一些 。这个结果从侧面也反应
了保护生物多样性的重要性 ,保护其它植物物种才
能维持狭叶甜茅的遗传多样性 ,所以 ,每一个单一
物种的灭绝也能降低其它物种的遗传多样性 ,威胁
其它物种的生存 ,所以 ,为了更好地保护我们的大
自然 ,要保护好自然界中的每一个物种。根据 Nei
指数的估算 , 种群间的遗传多样性所占比例
(10.09%)小些。原因可能是在根据 Kongkiath-
gam[ 7]等的方法估算等位基因频率时 ,没有区别杂
合体(如 Aa, A代表一个基因 , a代表它的等位基
因 ,以下同)和纯合体(AA),即无论是 AA还是 Aa
时 ,都将隐性基因频率认为是 0,这样就人为地减
小了种群的遗传多样性。 Shannon指数较 Nei指数
来说缺乏生物学意义 ,从而在一定程度上有可能避
免对 ISSR扩增位点显隐性的讨论。总的来说 ,大
约有 90%的变异发生在各种群内部 ,而 10%的变
异发生在各种群间 ,说明狭叶甜茅种群间具有较大
的遗传分化 。
Hamrick和 Godt的统计表明 ,种群间的多样性
差异受繁育系统影响很大 , 自交繁育的植物有
51%的遗传变异存在于种群之间 ,而异交繁育的植
物大约有 23%的变异存在于种群间[ 8] 。本文中 ,
ISSR检测狭叶甜茅种群的遗传多样性都是种群内
的遗传变异大于种群间的遗传变异 ,说明了狭叶甜
茅种群异交的可能性 。
从表 3可以看出 ,狭叶甜茅种群个体水平上遗
传距离有一定的差异 ,狭叶甜茅优势种群落和狭叶
甜茅共建种群落的遗传距离最大 ,为 0.071 4,其次
是狭叶甜茅伴生种群和狭叶甜茅共建种群 ,为
0.065 4,狭叶甜茅优势种群和狭叶甜茅伴生种群
的遗传距离最小 ,为 0.035 9,由此说明对一个种群
来说 ,当地理距离不能成为影响其遗传多样性水平
的因素时 ,其构成的种群在群落中的地位将是影响
遗传多样性水平的主要因素之一。
致谢:本实验是在东北林业大学森保实验室完成
的 ,在此表示感谢。
参考文献
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43-46.
GeneticDiversityofDifferentGlyceriaspiculosaPopulations
intheSanjiangPlainBasedonISSRMarkers
SHENGuang1, 2 , NIHong-Wei1 , XUXiang-Ling2
(1.NaturalResourcesInstituteofHeilongjiangSciencesAcademy, Harbin150040, Heilongjiang, P.R.China;2.Biologydepartment
ofHarbinNormalUniversity, Harbin150000, Heilongjiang, P.R.China)
Abstract:Glyceriaspiculosaisakindofperennialaquaticherbaceousplantwhichbelongstomannagrassofgra-
mineae.Theyliveinaquiprata, marshlandandbythestream.Theyareoneoftheimportantconstructivespe-
ciesandimportantcomponentpartofwetlandecosystemintheSanjiangPlain.
ISSRaresequencesbetween16 to28 basesofrepetitivesequences, basedonpolymerasechainreaction.
ISSRmethodhasadvantagesofsimplemanagement, quickness, higheficiencyandwithoutfussyconstructing
genelibraryandsoon.ItfitsforanyspecieswhichisaboundofrepetitiveunitofISSR.Itcansupplymultiposi-
tioninformationandaberancesamongdiferentmicro-sateliteseatsinformation, andithashighgeneticpoly-
morphismandgoodrepetitiveness.Buttilnow, ithasnotbeenseentobeappliedingenediversityofGlyceria
spiculosa.
ToclarifyinfluenceofchangeofmacroscopicalecologyenvironmentonGlyceriaspiculosaatallevelsespe-
cialyatmolecularlevelwasexamined.Adaptivemechanismandevolutionpotentialwerestudiedandgenestruc-
tureofGlyceriaspiculosawasanalyzed, andsotorevealadaptivemannerofGlyceriaspiculosawhenfacingnatural
selectionandtheevolutionroutineoflongevolutionhistory.Altheseareimportantforprotection, operating
management, repopulationandanticipationofdynamicdevelopmentofGlyceriaspiculosa, andsupplytheorydi-
rectionforbio-diversityespecialyprotectionandutilizationofmarshland.
ThreediferenttypicalplotsofGlyceriaspiculosacommunitieswerechosenintheHongheNaturalReserve
andtheDaxingReserveoftheSanjiangPlain.TherearetwoplotsintheHongheNaturalReserve, namelyplots
ofcommunitiesinwhichGlyceriaspiculosaandCarexlasiocarpaareconstructivespecies, andoneplotinthe
DaxingReserve, namelyplotsofcommunityinwhichGlyceriaspiculosaisdominantspecies.15rametsofGlycer-
iaspiculosaalongthesamedirectionineveryplotweretaken, atleast10mbetweentworametsandsamediame-
terforeveryclump.SamplestakenbackwerereadyforextractingDNA.
Afterpreliminaryexperiment, modifiedCTABmethodwasusedforextractingthetotalDNAfromGlyceria
spiculosa.PCRreactionconditions, andfiltered7efectiveprimersfrom41primersboughtwereestablised.With
thePopgensoftware, thecharacteristicsofGlyceriaspiculosasuchasalelefrequency, polymorphismandheredity
distanceandsoon, andgotNeiandShannonindexnumberswereanalyzed.Atlast, thehereditydiversitychar-
acteristicsofGlyceriaspiculosawereanalyzedanddiscussed.
TheexperimentextractedthetotalDNAwithCTABmethod, andadded2%(w/v)PVPand0.1%(v/v)
β -mercaptoethanoltowipeofpolyphenolandamylaseefectively.ThetotalDNAextractedcanbeusedfor
PCRnormaly.
ThefinalamplificationprocedureofPCRwas, denaturationfulyfor7minat94℃, denaturationfor30sat
94 ℃, annealingfor45 sat55 ℃, extensionfor2minat72℃, 40cycles, finalextensionfor7minat72℃.
　4期 沈光等:应用 ISSR标记分析三江平原狭叶甜茅不同种群的遗传多样性 291　
Reactionsystem:reactionvolume25μL, dNTPs0.2×10-3 moleach, primers1.5 ng/μLeach, Taqpolymer-
ase1.5 U, Mg++ 1.5×10-3mol, Bufer2.5 μLeach(Tris-HCl0.1×10-3mol, KCl0.5×10-3mol, pH
8.3), theotherwasfiledwithasepticwaterdistiledforthreetimes.
The7 efectiveISSRprimersare808((AG)8C)、809((AG)8G)、827((AC)8G)、836((AG)8CA)、834
((AG)8CT)、848(1)((CA)8AG)、848(2)((CA)8TG).Thestudygot80bandsclearlyfrom45individualsof
3 populationswiththe7primers.Thetotalpolymorphismratiowas87.5%.Genediversityinthepopulationsof
Glyceriaspiculosawas89.91%ofgenediversityoftotalpopulations, whilegenediversityamongpopulationswas
10.09%.Inthe3 populations, NeiandShannonindexnumberwerealsmalerthanaveragevalue.AndShan-
nonindexnumberwasbiggerthanNeiindexnumber.The2indexnumbersareconsistentwhenshowingheredity
polymorphismlevelofthe3 populations, namely, hereditypolymorphismofpopulationinwhichGlyceriaspicu-
losastandsasedificatospecieswasbiggerthanthatofpopulationinwhichtheplantstandsasdominantspecies
whichisbiggerthanthatpopulationinwhichtheplantstandsascompanionspecies.Heredityaccordancevalues
ofthe3populationswerebetween0.9311and0.9648.Populationinwhichtheplantasdominantspeciesresem-
blespopulationinwhichtheplantstandsasco-edificatospeciesfurthest, onthecontrary, resemblespopulation
inwhichtheplantstandsascompanionspeciesatleast.Fromaltheseinformation, itshowsthattherewasabig
hereditydiferentiationamongGlyceriaspiculosapopulations.
Theconclusionwasthatforaspecies, whengeographicrangewastooshorttoafectthegeneticdiversity,
sometimesitsmaybethenumberofspeciesinthepopulationswouldafectthegeneticdiversitylevelofaspecies.
Theconclusionshowedtheimportanceofprotectingbio-diversity, onlyprotectingotherplantspeciescankeep
hereditydiversityofGlyceriaspiculosa.Soextinctionofeveryspeciescanreduceheredityofotherspecies,
threatenexistenceofotherspecies.Therefore, ournatureandeveryspeciesofthenatureshouldbeprotected.
Keywords:glyceriaspiculosa;community;theSanjiangPlain;ISSR;polymorphic;hereditydiversity