全 文 :稗草(Echinochloa crus-galli(L). Beauv), 英文
名称 Barnyardgrass, 隶属于禾本科稗属, 为一年生
杂草, 原产欧洲和印度, 现广泛分布于中国及世界
温暖地区 [1]。 随着化学除草的大面积推广和累年推
行, 杂草的抗药性问题越来越严重, 不仅使现有的
除草剂品种防效降低, 还造成农业的减产, 给农业
生产造成重大损失。 参照HRAC(Herbicide Resista-
nce Action Committee)调查结果, 稗草属于十大抗
性杂草之一[2]。
黑龙江省是我国的大豆之乡, 也是我国最早使
用除草剂的地区之一, 无芒稗是大豆田主要的禾本
科杂草, 无芒稗(Echinochloa crus-galli(L). Beauv.
var. mitis(Pursh)Peterm)是稗草的一个变种,英文名
称Beardless Barnyardgrass, 当地农民利用芳氧苯氧
基丙酸酯类(APP)和环己烯酮类(CHD)除草剂防除
大豆田的稗草已经有 10 a 以上的历史, 本课题组
在对该地区大豆田抗性杂草的筛选中筛到一个对
APP 类除草剂精喹禾灵抗性倍数达到 87.29 倍的抗
性无芒稗生物型(整株生物测定法)[3]。
APP 和 CHD 类除草剂的作用靶标皆为质体型
乙酰辅酶 A 羧化酶(ACCase), 因此这 2 种除草剂
被统称为 ACCase 抑制剂类除草剂, 2 种除草剂通
热带作物学报 2013, 34(9): 1708-1713
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期 2013-06-06 修回日期 2013-08-19
基金项目 高等学校博士学科点专项科研基金(No. 20093702110003); 国家自然科学基金(No. 31171866、31201529); 公益性行业(农业)科研
专项(No. 201303031)。
作者简介 郇志博(1984年—), 男, 博士; 研究方向: 农药毒理与农药残留分析。 *通讯作者: 王金信, E-mail: wangjx@sdau.edu.cn。
无芒稗质体 ACCase基因 Real-time
PCR定量方法的建立
郇志博 1, 王金信 2*
1 中国热带农业科学院分析测试中心, 海南海口 571101
2 山东农业大学植物保护学院, 山东泰安 271017
摘 要 为研究一种抗精喹禾灵无芒稗的抗药性机理, 建立了一种以 β-actin 为内参基因利用实时荧光定量 PCR
技术测定抗性无芒稗质体 ACCase 基因相对表达水平的方法。 分析结果表明, 设计的实时定量引物特异性非常
好, 内参基因、 目的基因的扩增效率分别为 103.2%、 104.3%, 线性相关系数分别为 0.993 0、 0.991 2, 完全满
足 Real-time PCR 定量方法的要求。 所建立的无芒稗质体型 ACCase 基因 Real-time PCR 定量方法将为研究质体
型 ACCase 基因的表达和杂草对 ACCase 抑制剂的抗药性机制研究提供方法学参考。
关键词 无芒稗; 质体 ACCase; 基因表达; Real-time PCR
中图分类号 Q33 文献标识码 A
Establishment of Real-time PCR Assay for Quantitative
of Plastid ACCase in Beardless Barnyardgrass
HUAN Zhibo1, WANG Jinxin2
1 Analysis and testing center, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, Hainan 571101, China
2 Plant protection college, Shandong Agricultural University, Taian, Shandong 271017, China
Abstract In order to study the resistance mechanism of a quizalofop-ethyl-resistance beardless barnyardgrass, a
relative quantitative analysis method was established based on real-time PCR technology and β-actin gene as the
housekeeping gene. The results showed the specificity of the two sets of primers was very well. The amplification
efficiencies of the primers for β-actin and plastid ACCase gene was 103.2% and 104.3, while the correlation
coefficients was 0.993 0 and 0.991 2, respectively. The results showed the real -time PCR quantitative method
established in the article could be provided as a methodological reference for the study of the expression of
plastid ACCase gene and the study of the mechanism of weed resistant to ACCase inhibitors.
Key words Beardless barnyardgrass; Plastid ACCase; Gene expression; Real-time PCR
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2013.09.015
第 9 期 郇志博等: 无芒稗质体 ACCase基因 Real-time PCR 定量方法的建立
基因 引物 序列(5′-3′) Tm/℃ 扩增长度/bp
β-actin
Yactin-F2 TTGCCTACATTGCCCTTGACTA 55.8 262
质体ACCase
7006 F GTCTCAATCGCTCTCCGATCTT 57.7 94
7110 R TTGGCTCTCTGAGAAGGATCCA 57.7
Yactin-R2 GAACCACCACTGAGGACGACA 59.5
表 1 实时定量所用的引物
过抑制质体型 ACCase 活性造成植物脂肪酸合成受
阻, 进而引起植物细胞膜、 细胞器膜生成受阻, 造
成植物死亡 [4]。 经过综合分析国内外研究文献得
知, 禾本科杂草对 ACCase 抑制剂类除草剂的抗性
机理主要包括 3 个方面: 杂草增强对除草剂的降
解 [5-9]、 ACCase 敏感性降低, 多为质体型 ACCase
基因突变导致[10-17]和ACCase的过量表达[18-20]。
在研究杂草的抗药性机理时, 传统的测定基
因表达的方法为 Northern 杂交, 但该方法的工作
量较大且需要大量 RNA[21], Real-time PCR 技术
问世后, 大大减少了测定基因表达的工作量, 只
需很少的 RNA 在 2~3 h 就可得到基因表达数据。
因此我们在抗药性机理研究中建立了一种利用
Real-time PCR 技术测定无芒稗质体 ACCase 基因
表达的方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 仪器与设备 PCR仪(温度梯度)自动系列
(T-Gradient Thermoblock), 购自德国 Biometra 公
司; BIO-RAD iQTM5 多重实时荧光定量 PCR 仪购
自美国伯乐公司。
1.1.2 试剂 RNAprep pure植物总 RNA提取试剂
盒, Quant cDNA第一链合成试剂盒, 和RealMasterMix
(SYBR Green)试剂盒为天根生化科技(北京)有限
公司产品。
1.1.3 供试材料 抗性无芒稗种子采自黑龙江
省五大连池市格球山农场大豆田施用推荐剂量
60 g ai/hm2 精喹禾灵乳油 30 d 后仍然存活的无芒
稗植株(记为 Geqiushan R), 敏感无芒稗种子采自
格球山农场从未接触过任何除草剂的荒山上(记为
Geqiushan S)。 种子经 0.1%赤霉素处理 12 h 后,
种植在装有沙和土质量比 2 ∶ 1 的塑料盆内, 在夜
晚 20 ℃, 白天 25 ℃, 自然光照射的温室内长至三
叶一心期, 单株采集植物材料, 每株采集植株的相
同部位, 采集后立即放置入液氮中, 储存在-80 ℃
备用, Geqiushan R 和 Geqiushan S 各 3个重复。
1.2 方法
1.2.1 无芒稗总 RNA 提取和 cDNA 合成 取约
0.1 g 植物材料 , 按照天根 RNAprep pure 植物总
RNA 提取试剂盒说明书的方法提取无芒稗的总
RNA, 使用 DNase I 除去其中的基因组 DNA。 利
用紫外分光光度计和 1%琼脂糖凝胶电泳分别分析
提取的总 RNA 的浓度和质量后, 利用 TIANGEN
公司的 Quant cDNA 第一链合成试剂盒合成 cDNA,
20μL反转录反应体系包括: 2 μL 10×RT mix, 2 μL
dNTPs 混合液(2.5 mmoL/L), 2 μL Oligo-dT15, 1 μL
Quant Reverse Transcriptase和2 μg总RNA, 反应条件
为37 ℃孵育60 min。
1.2.2 内参基因 β-actin 的 PCR 克隆 根据水稻
(Oryza sativa)、 玉米 (Zea mays)和小麦 (Triticum
aestivum)等单子叶植物β-actin基因序列, 设计PCR
克隆的上下游引物, 分别为AF 5′-CTCGACTCTGGT
GATGGTGTG-3′和 AR 5′-TCGTACTCCGCCTTGGA
GAT-3′。 以提取的无芒稗 cDNA 为模板进行 PCR
扩增, 25 μL反应体系包括17.25 μL ddH2O, 2.5 μL
10 ×LA PCR Buffer Ⅱ (Mg2 + Plus), 2.5 μL dNTPs
Mixture(2.5mmoL/L), 1 μL正向引物AF(20 μmoL/L),
1 μL反向引物AR(20 μmoL/L), 0.25 μL TaKaRa LA
Taq(5 U/μL)和0.5 μL cDNA(about 25 ng/μL), 反应
循环为: 94 ℃预变性5 min; 然后, 94 ℃变性1 min,
58 ℃退火50 s, 72 ℃延伸1 min, 共35个循环; 最后
72 ℃延伸10 min。 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳, 胶
回收交上海生工生物技术有限公司测序。
1.2.3 内参基因与目的基因引物的设计与分析
根据无芒稗质体型 ACCase 基因 (GenBank HQ
395758)和无芒稗 β-actin 基因的碱基序列, 由大连
宝生物公司设计引物 , 利用软件 Primer 5.0,
BLAST, Clustalx 评价了引物对的 Tm 值、 自身及
引物间配对情况, 最终确定的引物见表 1。
内参基因与目的基因引物的特异性分析: 根据
荧光定量 PCR引物的设计要求, 将设计的 2对引物
1709- -
第 34 卷热 带 作 物 学 报
28 S
18 S
图 1 Geqiushan R(左 )和Geqiushan
S ( 右 ) 总 RNA 的 电 泳 图 谱
M 1 2
632 bp
图 2 Geqiushan R(1)和Geqiushan
S ( 2 )的 β - actin基 因 克 隆
进行 PCR扩增, 验证引物的特异性并优化反应条件:
25 μL 反应体系包括 17.25 μL ddH2O, 2.5 μL
10 ×LA PCR Buffer Ⅱ (Mg2 + Plus) , 2.5 μL dNTPs
Mixture(2.5 mmoL/L), 1 μL 正向引物(20 μmoL/L),
1μL反向引物(20 μmoL/L), 0.25 μL TaKaRa LA Taq
(5 U/μL) 和 0.5 μL cDNA(由 50.0 ng总 RNA合成),
反应循环: 94℃预变性 5 min, 然后 94℃变性 50 s,
61.6 ℃退火 50 s, 72 ℃延伸 30 s, 共 35 个循环,
最后 72℃延伸 10 min。
内参基因与目的基因引物的溶解曲线分析:
对于以 SYBR Green Ⅰ为基础的 Real-time PCR 反
应而言, PCR 产物的特异性对于试验结果有至关
重要的影响。 通过溶解曲线分析, 可以确定可能伴
随特异性产物扩增而出现的非特异性扩增产物。
溶解曲线分析的反应体系: SYBR GreenⅠ实
时荧光定量 PCR 反应体系: 25 μL 反应体系包括
11.25μL 2.5×RealMasterMix/20×SYBR solution (8 ∶ 1),
0.4 μL 正向引物, 0.4 μL 反向引物, 0.5 μL cDNA
(由 50.0 ng 总 RNA 合成), 12.45 μL ddH2O。 反应
循环 : 95 ℃预变性 2 min, 然后 94 ℃变性 20 s,
61.6 ℃退火 20 s, 68℃延伸 3 min, 共 35个循环。
将 SYBR Green Ⅰ实时定量 PCR 反应产物 ,
以 0.5 ℃每 30 s 的速度从 55 ℃缓慢而均匀地升温
至 95℃, 产生溶解曲线。
内参基因与目的基因引物的扩增效率分析: 将
cDNA 模板依次稀释为 1、 1/2、 1/4、 1/8、 1/16 倍。
以此为模板进行目的基因和内参基因的荧光定量
PCR扩增, 设立阴性对照, 每个模板做 3个重复。 计
算分析目的基因和内参基因的扩增效率。
2 结果与分析
2.1 RNA的纯度和完整性分析
对提取的 Geqiushan R 和 Geqiushan S 的总
RNA 经分光光度计检测 A260/A280 值为 1.8~2.0。 经
1%琼脂糖凝胶电泳鉴定, 28 S、 18 S 条带清晰可
见, 无明显降解(图 1)。
2.2 无芒稗 β-actin基因的克隆与鉴定
利用引物 AF 和 AR, 以无芒稗 cDNA 为模板
获得的产物长度为 632 bp(图 2)。 该基因序列与獐
茅(Aleuropus littoralis), 黑麦草(Lolium perenne),
甘蔗(Saccharum officinarum), 谷子(Setaria italica),
水稻(Oryza sativa), 玉米(Zea mays), 小麦(Triticum
aestivum) 的 β-actin序列同源性分别达到 76.61%、
76.42%、 84.18%、 84.02%、 84.20%、 80.06%、 8
5.13% 。 经过比对分析确定该序列为无芒稗的
β-actin基因片段(GenBank HQ395760)。
2.3 内参基因与目的基因引物的特异性分析
将设计的 2 对引物按照优化的反应条件进行
PCR 扩增, 将扩增产物进行电泳, 结果表明, 2 对
引物均可以扩增出单一条带, 没有明显的非特异性
扩增条带(图 3)。
2.4 内参基因与目的基因引物的溶解曲线分析
由溶解曲线图 4可以看出, 内参基因和目的基
因皆为单峰, 证明引物的特异性非常好, 内参基因
β-actin 的 Tm 值约为 87 ℃, 目的基因的 Tm 值约
为 81℃, 也符合实时荧光定量 PCR的要求(图 4)。
2.5 内参基因与目的基因引物的扩增效率分析
内参基因的标准曲线的斜率为-3.248, 扩增效
率为 E=103.2%, R2=0.993 0, 目的基因的标准曲
1710- -
第 9 期
M 1 2
262bp
M 3 4
94 bp
图 3 Geqiushan R和Geqiushan S的内参引物(1和2)和目的引物(3和4)的扩增
250
200
150
100
50
0
55 60 65 70 75 80 85 90 95
图 4 内参基因和目的基因的溶解曲线
Temperature. Celsius
Melt Peak Chart: Data 2010-07-24-抗性与对照.opd
-d
( R
FU
) /
dT
目的基因
内参基因
1.00
55.00
27
26
25
24
23
22
21
-2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0 0.5
cDNA 初始浓度稀释倍数的对数值
CT
值
×●Standard Unknown
-2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0 0.5
cDNA 初始浓度稀释倍数的对数值
32
31
30
29
28
27
CT
值
×●Standard Unknown
图 5 内参基因的标准曲线 图 6 目的基因的标准曲线
线的斜率为-3.223, 扩增效率为 E=104.3%, R2=
0.991 2, 2 个扩增效率都在 90%~105%之间, 在
阴性对照中无扩增产物出现(图 5、 6)。
3 讨论与结论
通过对添加除草剂而诱导产生的抗除草剂植物
愈伤组织的抗性机理研究发现, 靶标酶的过表达为抗
郇志博等: 无芒稗质体 ACCase基因 Real-time PCR 定量方法的建立 1711- -
第 34 卷热 带 作 物 学 报
性机理之一, 如野胡萝卜(Daucus carota L.)[22]和菊
苣(Cichorium intybus L.)[23]愈伤组织被发现含有过
量表达的乙酰乳酸合成酶。 类似的, 草甘膦和草铵
膦诱导产生的抗性野胡萝卜和苜蓿 (Medicago
sativa L.)愈伤组织中也含有扩增水平的 5-烯醇式
丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)和谷氨酰胺
合成酶 [24-25]。 另外通过 Western 杂交技术对抗烯禾
啶的玉米愈伤组织研究发现, ACCase 酶含量和活
性皆高于敏感的愈伤组织[26]。
以上研究基本都是针对于抗性愈伤组织作出
的, 真正以抗性植物体作为研究对象, 运用 Real-
time PCR 技术研究靶标酶过表达是否为杂草抗药
性机理的首例案例为 2010 年 Gaines 等对抗草甘膦
的长芒苋(Amaranthus palmeri S. Wats)的抗性机理
研究, 发现该抗性杂草中 EPSPS 酶的敏感性与敏
感种群一致, 但 EPSPS 基因的拷贝数为敏感种群
的 5~160 倍, 同时表达量也相应的大大增加[27]。 而
对 ACCase 抑制剂类除草剂产生抗药性的杂草的抗
性机理研究, 目前仅仅通过间接推测得出抗性杂草
中的 ACCase 可能过量表达, 其在测定 ACCase 活
性时发现, 抑制抗性生物型和敏感生物型 ACCase
活性 50%的除草剂剂量类似, 在无除草剂处理时,
抗性种群 ACCase 活性是敏感种群的 2~3 倍; 当用
相同浓度除草剂处理后, 抗性种群 ACCase 活性也
高于敏感种群 , 因而最终推测得出抗性种群的
ACCase可能过量表达, 最终导致抗性的发生[28]。
Real-time PCR 技术是测定基因表达的新方
法, 在对抗精喹禾灵无芒稗的抗性机制研究中, 笔
者选择利用该技术, 测定抗性和敏感无芒稗在不施
用精喹禾灵时抗敏种群质体 ACCase 基因的基本表
达差异, 和施用相同剂量的精喹禾灵后其各自质体
ACCase 基因表达随时间变化情况, 以及抗性种群
和敏感种群在相同剂量精喹禾灵处理后相同时间下
的抗敏种群质体 ACCase 基因表达差异, 以此来分
析基因过表达是否为该抗性机理之一, 最终结果表
明, 抗性无芒稗质体 ACCase 基因在不施用精喹禾
灵时的基本表达水平与敏感种群类似, 而施药后抗
性种群的质体 ACCase 基因表达水平与不施药时基
本类似并且在研究的时间范围内基本未变, 而敏感
种群在施药后其质体 ACCase 基因表达水平随时间
延续而逐渐降低, 我们推测基因过表达并非导致该
抗药性产生的原因[29]。 在随后的对抗敏种群的质体
ACCase 基因测序时发现, 抗性种群质体 ACCase
基因较敏感种群发生基因突变, 导致其翻译的质体
ACCase 氨基酸序列 1 781 位由异亮氨酸突变为亮
氨酸[30], 国际上其他研究也发现质体 ACCase 1 781
位由异亮氨酸到亮氨酸的突变是导致几种禾本科杂
草对 ACCase 抑制剂类除草剂产生抗药性的原因 [31-
33], 因而最终推测抗性种群的基因突变为导致该无
芒稗种群对精喹禾灵产生抗药性的主要原因。 虽然
最终基因过表达并非该抗药性产生的原因, 但是我
们建立的利用实时荧光定量 PCR 技术测定无芒稗
质体型 ACCase 基因表达的方法将为研究其他抗
ACCase抑制剂杂草的抗性机理提供方法学参考。
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责任编辑: 叶庆亮
郇志博等: 无芒稗质体 ACCase 基因 Real-time PCR 定量方法的建立 1713- -