全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 23(4)：343— 346 2003年 7月
从无芒稗 花粉活力评价其与转基 因抗除
草剂水稻基 因漂移 的可 能性
宋小玲 ，强 胜 ，孙 明珠
(南京农业大学杂草研究室 ，江苏南京 210095)
摘 要 ：为给转基 因抗 除草 剂 水稻 和稗 草 间的基 因漂移研究 提供 必要 的信 息 ，探 寻 了无 芒 稗 (Echinochloa
crusgalli var．raitis)花粉活力及其测定的最佳方法，并利用该方法测定了无芒稗开花盛期后离体和活体条件
下不同时间的花粉活力 。结果表 明无芒稗开花盛期取样离 体条 件下花粉活力 下降较快 ，3 h后 花粉活力 只有
5．41 ，活体条件下花粉活力下降较慢，3 h后仍有 17．31 的花粉有活力。这说明无芒稗花粉在水稻开花时
仍有部分保持活力，因而存在潜在的基因漂移可能性。同时用最佳培养基法测定了不同条件处理下(紫外灯
照射，反复冻融，黑暗放置)无芒稗花粉活力，结果表明无芒稗花粉在不利环境条件下活力难以保持。
关键词 ：无芒稗 ；花粉活力 ；抗除草剂转基因水稻 ；潜在基 因漂移
中图分类号 ：Q944 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000—3142(2003)04—0343—04
Assessm ent on the possibility of gene flow
between transgenic herbicide—resistant rice and
Echinochloa crusgall vat． mitis from the
pollen vitality of E．crusgalli vat．mitis
SONG Xiao—ling，QIANG Sheng ，SUN Ming—zhu
(Weed Re$eatch Laboratory，Nanjing A ricuIt“ral Uni rsitv．Nanin窖210095．China)
Abstract：The optimal method for testing pollen vitality of Echinochloa frusgalli var
． raiti was researched for
providing useful information on gene flow between transgenic herbicide-resistant rice and E
． fr“ gnlli var．
raitis．The vitality of pollen putting in natural environment after collection and collecting directly from spikes
at different time were tested with the optimal culture medium
． The results demonstrated that the vitalitv of
pollen putting in natural environm ent after collection decreased quickly at different time
． And at 3 h after coI—
leering pollen vitality only were 5．41 ． The vitality of pollen collecting from spikes directly decreased sIower
than the former． At 3 h after anthesis，the polen vitality was still 17
． 31％．This showed the pollen of E．
crusgalli var．mitis．could keep vitality when rice were blooming
． The possibility of potential gene flow couId
exist between transgenic herbicide—resistant rice and E． crusgalli var． raitis． The pollen vitality of E． f， s—
galli var·raitis· were tested under different conditions (by irradiated under ultraviolet radiation
， by repeated
freezing and thawing and by put in dark condition)
． The results showed that it is difficult tO keep the poIIen vi一
收稿 日期 ：2002一儿一15 修 订 日期 ：2003—02—20
基金项目：里骞科技部转基因专项基金(E2001o2)；国家自然科学基金(3o17o164)；国家教育部博士点基金(20003o7o8)资助 项目
。
作者简介： 小玲 969- 女’内蒙古乌蒙人’博士生，主要从事抗除草剂转基 因作物安全性评价的方法研究
。 *为通 讯 联 系
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344 广 西 植 物 23卷
tality under adverse condition．
Key words： Echinochloa crusgalli var
gene flow
随着基因工程 的发 展 ，抗 除 草剂 转基 因作 物 的
种植也愈加普遍，但同时人们也十分关 注转基因抗
性作物与野生近缘 种 之 间基 因交 流 ，一旦 两 者发生
了稳定的基因交流和基 因渗入 ，将会使抗性作物杂
草化或使近缘种携带抗性基 因，而给生态环境带来
潜在的破坏(Kling，1996；钱迎倩 等，1999；魏伟等，
1999)。因此 在抗除 草剂 转基 因作物 田间释放 前对
其潜在 的基 因漂移 作出正确 的评估 是很必要 的。虽
然稗草和水稻分属稗属(Echinochloa)和稻属(Ory—
za)，因稗草在稻 田的广泛分布和繁殖量大及危害
重 ，且对水稻有很 强 的拟 态性 (Barrett，1983)，人们
对两者间能否发生基 因交流非常关心。许多研究者
(Dale，1992；Schefler等 ，1994；Snow 等 ，1999)认为
抗除草剂转基因作物和野生近缘种成功的基因漂移
依赖 于作物 和接 受种 之 间 的有性 亲 和性 ，相一 致 的
开花期 ，在空间上有足够近的距离 ，使可育花粉转移
到接受种 的柱头 上 以及杂交后代 和随后后代 的可育
性和繁殖能力。这些条件中许多是可以满足的。虽
然研究证 明了稗草 与水 稻存 在 一定 的花时不 遇 (宋
小玲等，2002)，但如果稗草花粉活力能够延时，则有
发生相遇 的可能性 。相关研究 尚未见报道 。本研究
旨在明确在水稻开花时稗草的花粉活力，进一步确
证抗除草剂转基因水稻和稗草间的基 因漂移可能
性 。
I 材料与方法
1．1材 料
稗草为南京稻田常见种无芒稗。种子采集于南
京农业大学网室 2001年种植 的稗草，于 2002年 4
月底 至 6月底 每隔 15 d播 种 1批 。
1．2方法
为确保所 取花粉 为 当 日的新 鲜花粉 ，在 测定 的
前天下午把准备取样的稗穗轻轻拍打，抖落残余花
粉。花粉的取样分抖落花粉和新鲜花粉两种。抖落
花粉每处理选处于盛花期的无芒稗 3O株 ，每 1O株
为 1组，根据实验需求轻轻拍打稗穗抖落花粉；新鲜
花粉取样时把载玻片置于正在开放 的稗穗小花下 ，
待花药 自然散粉后立 即测定 ，每处理从 3株不同的
稗株上取样 。所 采集 的花 粉重 复测 定 5次 ，每次 不
少于 500粒花粉 。不同条件处理对无芒稗花粉活力
的影响研究中只采用盛花期的抖落花粉。所有花粉
活力 的观察都 在装有测微 尺的显微镜 下进行 并测量
花粉管长度，以花粉管长度超过花粉直径的 1．5倍
为萌发。数据经 SPSS统计软件统计分析。
1．2．1无 芒稗 花 粉 活力 的 测 定 方 法 (1)染 色 法 。
联苯胺染色法 ：参照胡晋等(1996)方法 ，染色液成分
为 A液 ：0．5 联 苯胺溶液 ；B液 ：0．5 a一萘酚溶液 ；
C液 ：0．25 碳酸钠。将 A、B、c三液等体积混合作
为 I液 ，0．3 9／6H。O。作 为 Ⅱ液，使用时在载玻片上
放少量待测花粉 ，滴 I液 l～2滴 ，再滴上 Ⅱ液 1～2
滴。TTC染 色法 ：参 照胡 晋 等 (1996)和胡 适宜
(1993)方 法 ，称 取 0．5 gTTC用 100 mL PH7．0磷
酸缓冲液配成 0．5 浓度的溶液。使用时在载玻片
上放少量待测花粉，滴 1～2滴 TTC染色液，即放人
垫有湿润滤纸 的培养皿 中，加盖后放人 37℃培养箱
中黑 暗培养 。
联苯胺染色法立即在显微镜下观察花粉染色情
况，TTC染色片 20 rain后镜检。用染色法测定从
花药中散落的花粉活力和从稗穗上抖落的花粉离体
条件下放置 1～3 h的无芒稗花粉活力
(2)培养基培养测定法 。培养液蔗糖浓度的确
定 ：设 l0 ，l5 9／5，20％，30 9／5，40 9／6共 5个 的蔗 糖浓
度，观察从花药中散落的花粉在不同蔗糖浓度中的
反应，确定最适蔗糖浓度。培养基的确定 ：参照胡适
宜 (1993)方法 ，设 最适蔗糖浓度 +lO 营养 液(硼酸
0．1 g，硝酸钙 0．3 g，硫酸镁 0．2 g，硝酸钾 0．1 g，蒸
馏水 100 mL，下 同)，最适蔗糖 浓度 +1O 9，6营养液 +
30mg／kg GA ，最 适 蔗 糖 浓 度 + 10 营 养 液 +
30mg／kg GA +1 琼脂共 3种培养基。比较从花
药中散落的无芒稗花粉和从稗穗上抖落的花粉在三
种培养基上的萌发情况 ，确定最适培养基。液体培
养基首先在干净的载玻片上滴 1～2滴培养液，再把
所测花粉均匀 散布在上面 ，为防止水分的蒸发 ，需把
制好的载玻片放入垫有湿润滤纸的培养皿 内；固体
培养基现配现用 ，把配制好的固体培养基均匀涂布
在灭菌的载玻片上，待冷却后再把待测花粉均匀散
布在上面。之后置于 3O℃环境下培养 4O rain后观
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4期 宋 小玲等 ：从无 芒稗花粉活力评价转基因抗除草剂水稻基 因漂移 的可能性 345
察 。
1．2．2无芒稗花粉 活力的测 定 每 Et 6：30无芒稗
开花高峰期从开花 的稗 穗上 轻轻 拍 打抖 落花粉 ，于
取样后 0，30 rnin，1 h，2 h，3 h，用最 佳培 养基 测 定
花粉 活力 。并 于无 芒稗 开 花 高 峰期 后 0，30 rain，1
h，2 h，3 h后轻轻拍打抖落花 粉 ，用最佳 培养 基测定
花粉活力，比较无芒稗花粉离体和活体条件下的活
力 。无芒稗花粉在 培养基 上置 于 30℃环境 下培养
40 min，之后观察 。
1．2．3影响无芒稗 花粉 活力 的 因素 (1)紫外 灯 照
射 。采集无芒稗新鲜 花粉 ，部 分立即测定花粉活力 ，
部分置于 20 w紫外灯下分别照射 5 rain和 6 rnin，
之后测定花粉 活力 。(2)反 复冻 融 。在 当 日无芒稗
盛花期用铺有一层氯化钙 和滤纸 的培养皿采集稗草
花粉 ，部分用 于测定花粉活力 ，部分立 即放人 冰箱 中
冷冻 30 rain，30 rain后再 置于 自然 条件 下 融 化 30
rain，反复进 行 1～6次 。之后 立 即测 定 花粉 活 力 ，
确定不 同冻融次数 后无 芒稗 花粉 活 力 。(3)黑 暗 放
置 。于无芒稗开花 盛期 用培 养皿 采集 花粉 ，部 分用
于测定花粉 活力 ，部分用黑色纸包裹 ，放置 于黑 暗地
方 ，分别于放置 1、2、3 d测定花粉 活力 。
2 结 果
2．1无芒稗 花粉活力 的测定 方法
2．1．1染 色法 用联苯胺染 色法测定 无芒稗 花粉活
力 ，无论新 鲜 的还是放 置一定 时间的花粉 ，都能被染
色成蓝褐色 ，虽然颜 色 深浅 有 一定 差异 ，但 不 明显 ，
不能很好地用来 判断花粉活力 。
表 1 稗草花粉萌发最适蔗糖浓度的筛选
Tabl e 1 The sel ection of optimal sugar concentration
for pol1en germination of E．crusgalli var．rnitis
内容物外溢或花粉破裂百分率
The percent of pollen overflowing their
inclusions or pollen splitting ( )
处理 1 处理 2 处理 3 平均
Treatment 1 Treatment 2 Treatment 3 Average
1O
15
2O
30
40
52、12
29、12
5．53
40．23
59 27
49．32
30、56
6．89
45．12
58．74
55、68
32．96
4．92
44．13
61．33
52、37ABb
3O．88Cb
5、78De
43．16aBc
59 78A a
表 2 不 同培养基上 无芒稗花粉萌发率
Table 2 Pollen germination rate of E．crusgalli var．mitis at different culture mediums
I
Ⅱ
Ⅲ
16．78
26．29
69．58
19．56
30 O2
72．13
23．36
29．79
71．89
19 90A a
28．70Bb
71．2OCc
16．12
18．97
51．69
20．54
25．13
63．16
17．40Bb
21 25Bb
56．36Aa
注 ：I：20％蔗糖 +10 营养 液 ；1I：20 蔗糖 +10 营养液 ·{-3O mg／kg GA3；Ⅲ：20 蔗糖 +10 营养 液 +30mg／kg GA3+1 琼脂 。
Note：I：2o oA sugar+1 0 nutritional liquid；I ：2o sugar+ lO nutritional[iquid+3o mg／kg GA3；Ⅲ：2O sugar+lO nutritiona【Ilq
uid+ 3O mg／kg GA3+ 1 agar．
用 TTC染 色法 测定 无芒 稗 花粉 活力 ，培养 20
rain后 ，无论新鲜 的还是 放置一定 时间 的花粉 ，着 色
都不 明显 ，但 随着在空 气 中放 置时 间 的延 长 又全部
着色 ，因此两种染色法不适合 测定 无芒稗花粉活力 。
2．1．2最适蔗糖 浓度的确定 蔗 糖是起 维持渗 透 压
作用的 ，不 同植物 的花粉 对蔗糖浓度 的要求 不一致 ，
过高 或过低都不能使花粉正 常萌发 。研 究结果表明
10 和 15 的浓度下花粉 出现 了内容物 的外溢，
30 和 40 浓度下 出现了花粉破 裂现 象 ，都不是 无
芒稗花粉适合萌发的最适浓度。20 的蔗糖浓度适
合无芒稗花粉的萌发 (表 1)。
2．1．3培养基的确定 不同取样方式的无芒稗花粉
在三种培养基 上虽都 有 一定 比例 的萌发 ，但 在 不 同
一 — —1 — —— 一
培养基上萌发比例相差较大 ，其中 20 蔗糖+10
营养液的萌发 比例 最差 ，20 蔗糖 +10 营养液 +
30 mg／kg GA 的萌发率居中，而固体培养基的效
果最好(表 2)。因此 以 20 蔗糖 +10 营养 液 +30
mg／kg GA +1 琼脂为 测定无 芒稗 花粉活力 的培
养基 。虽然不同培养基无芒稗花粉萌发率不同，但
在花粉管 的长 度基 本 一 致 ，长度 从 1 500～5 500
m，平 均 3 150 m。
2．2无芒稗 花粉活 力的测定
在无芒稗开花高峰期从稗穗上轻轻抖落的花粉
在离体条件下花粉活力有明显下降，从 56．36 ，下
降到 3 h后的 5．41 ，而开花高峰期后不同时间从
活 体 取 样 得 到 的 花 粉 活 力 测 定 结 果 来 看，从
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j6．36 下降到 3 h的 l7．31 下降幅度没有取样后
离体条件下 的快 (图 1)。这说 明在 自然状态下 无芒
稗花粉 活力可 以延 时 ，在 开花 高峰 期后 3 h仍有 近
2o 的花粉具有活力。而据观察转基因水稻在晴天
9：3O时 ，有少部分小 花的颖 壳 已张开 ，这样仍 可能
无芒稗有活力的花粉 会漂 移 到转基 因水 稻柱 头上 ，
存在潜在的基 因漂移风险性 。
2．3影响无芒稗花粉活 力的 因素
2．3。l紫外灯 照射 法 无 芒稗 花粉 在盛 花期采 集 ，
有 54．12 的花粉可以萌发生长，照射 5min有个别
花粉可 以正常萌发生长，萌发率为 0．4O ，照射 6
rain则 没有 花粉萌发生 长 。
2．3．2反 复 冻融 法 无芒 稗 花粉在 盛 花期采集 ，有
59．2O 的花粉可 以萌发生 长 ，经反 复冻 融 1～6次
所测定 的所有 花粉未见萌 发。
2．3．3黑暗放 置法 无芒 稗 花粉在 盛花 期采集 ，有
56．24 的花粉 可 以萌发 生 长 ，经黑 暗 放置 1～3 d
后 ，所测定的花粉都未见萌发 。
O O 5
图 1 不同时 间稗草花粉活力
Fig．1 The pollen vitality of E．crusgalli var．
mitis at di{{erentdine
◆ 无芒稗开花取样后不同时问的花粉活力
The vitality of pollens after collectin at different times；
t 无芒稗开花后不同时问取样的花粉活力
The vitality of pollens collecting after anthesis at different times
3
(1)花粉活力测定的方法主要有染色法和培养
基培养法。染色法中主要有联苯胺染色法和氯化三
苯基四氮唑 (TTC)染 色 法 ，染 色 法测 定 花粉 活 力 ，
往往被染色的花粉百分率高于花粉实际的存活率。
而且各种方法都有缺陷，TTC法对实验的温度、光
照要求严格 ，必须在一定的温度下黑暗进行 ，且随着
时间的延长，由于空气中氧的作用使花粉染色变红，
无生活力而有内含物 的花粉也会 变红 (胡晋 ，l996)。
而联苯胺法 对不 同 植 物花 粉染 色深浅不 同 ，且对
不同植物有活力的花粉和没有活力的花粉着色差异
很大 ，有 时对 一种植 物而言被染色 的为有活力的 ，有
时对 另外一种植 物则不被着 色的为有 活力 的(Rich—
ards，l997)。在本实验 中用染 色法测定无 芒稗花粉
活力 ，均未取得 满意 的结 果 。改用培 养基培 养法能
得到满意的结果。
(2)花粉 生活力 的长 短一 方面是 由遗传 基因决
定；另一方面也受环境的影响。根据系统的研究，普
遍认 为 2一细 胞 型 花 粉 的 生 活 力 较 3一细 胞 型 的高
(Richards，l997；胡适宜 ，l987)。禾本科植物大多
为 3一细胞花粉 ，其 外壁较 薄 ，对干燥 敏感 ，对 外界不
良条件抵抗力差 ，因而寿命短 。无芒稗花粉活力测
定结果表明在采集后不经任何处理的离体条件下其
活力下降很快，3 h后花粉活力只有 5 左右。而开
花高峰期后不同时间活体花粉活力则可以维持一定
时问，3 h后仍有 17．31 的花粉活力，这可能和花
粉在花药的特定环境中受到一定的保护有关。在不
良环境条件下 ，无芒稗花粉活力难 以保持。从这一
角度来讲即使在 9：3O时无芒稗花粉仍有部分保持
活力，但一旦进入 自然环境中，受 到外界条件的影
响，例如紫外线照射，其活力下降的非常快，发生基
因漂移 的可能性也会减 小。
(3)从测定结 果 来看 ，在 自然状 态下 ，在 9：3O
左 右无芒稗花粉还 有近 2O 的活 力 ，而这 时水稻也
开始开花 ，所 以无芒 稗 花期 与水稻 花期仍 然可 以相
遇 ，因而存在潜在基因漂移 的危 险。
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击后 再处理 24 h可 以提高 转 化效 率 。可能 是 由于
高渗处理使 细胞 质壁 分离 ，从 而 减轻轰 击 时钨粉 对
细胞的伤害 (徐 子勤 ，2001)。
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