全 文 ：收稿日期:2010-05-28;修回日期:2010-09-03
基金项目:松嫩草原三种重要牧草———短芒野大麦 、芦苇和羊草
天然种群的表观遗传多样性及其与逆境适应性的可能关系
(30870178/ C020303)
作者简介:李晓玲(1971-),女 , 吉林舒兰人 ,副教授 ,博士 ,主要
从事植物生物技术与植物分子生物学研究工作 ,发表论文近 20篇 ,
E-mai l:lxl5275278@163.com.
文章编号:1673-5021(2010)06-0090-04
星星草和朝鲜碱茅组织培养体系的建立
李晓玲1 , 李克秀1 ,于晓明2
(1.长春工业大学化学与生命科学学院 ,吉林　长春　130012;2.吉林农业科技学院 , 吉林　长春　130000)
　　摘要:分别以星星草和朝鲜碱茅成熟胚为外植体 , 建立组织培养体系。结果表明 , 星星草和朝鲜碱茅成熟胚在
MS+300mg/ L CH+4.0mg/ L 2 , 4 -D +3%蔗糖+0.7%琼脂(pH5.8)培养基上 , 愈伤组织诱导率可分别达到
53.3%和 46.7%。经 MS+300mg/ LCH+1.0mg/ L 2 , 4-D +3%蔗糖+0.7%琼脂(pH5.8)继代培养基中继代培
养后 ,星星草和朝鲜碱茅胚性愈伤组织在 MS+300mg/ L CH +1.0mg/ L 2 , 4-D+0.3 mg/ L 6-BA +3%蔗糖+
0.7%琼脂(pH 5.8)分化培养基上 ,分化率分别达到了 82.5%和 75.7%。两种牧草再生苗生根移栽后成活率均可达
到 95%以上。
关键词:星星草;朝鲜碱茅;成熟胚;组织培养
中图分类号:Q943.1　　　文献标识码:A
　　目前 ,应用生物技术培育高抗 、优质牧草新品
种 ,已成为牧草育种研究领域一个新的研究热点[ 1] 。
星星草(Puccinell ia tenui f lora)和朝鲜碱茅(Puc-
cinell ia chinampoensis)是盐碱斑上较优良的多年生
禾本科牧草 ,耐旱 、耐湿 、耐寒 ,并具有很强的耐盐碱
性。为盐碱地的利用和改良开辟了新的途径[ 2] 。同
时 ,这两种牧草也是耐盐碱牧草品质改良和选育工作
中常用的牧草材料[ 3] ,具有非常重要的经济价值 、生态
价值和遗传价值。本文对星星草和朝鲜碱茅愈伤组织
形成及植株再生体系进行研究 ,为进一步探索其细
胞工程育种和遗传改良提供理论依据和技术支撑 。
1　材料和方法
1.1 　实验材料
星星草成熟种子和朝鲜碱茅成熟种子均采自中
国东北松嫩平原盐生草甸 。
1.2　实验方法
1.2.1　愈伤组织的诱导
以 MS +300mg/ L CH +3%蔗糖 +0.7%琼脂
(pH5.8)为基本培养基 ,分别添加1.0 mg/L 、2.0 mg/ L、
3.0 mg/L 、4.0 mg/ L 、5.0mg/L和6.0mg/L 2 ,4-D作
为愈伤组织诱导培养基。分别将星星草和朝鲜碱茅
成熟种子剥去颖壳 ,用自来水浸泡 8 ～ 10h ,无菌水
冲洗一遍 。然后将种子经常规灭菌后 ,无菌条件下
分别接种于上述愈伤组织诱导培养基上(每种培养
基接种 180 ～ 200粒种子),于 25±1℃条件下 ,暗培
养 4周。
1.2.2　继代培养
各种继代培养基均以MS+300mg/L CH+3%蔗
糖+0.7%琼脂(pH5.8)为基本培养基 ,其中 2 , 4-D
浓度分别调整为 0 mg/ L 、0.5 mg/ L 、1.0 mg/L 、
1.5 mg/L 、2.0 mg/L 和3.0 mg/ L。将愈伤组织继
代转接后 ,置于 25±1℃条件下 ,暗培养 3 ～ 6个月
(继代周期为 30d)。在继代培养过程中 , 及时挑选
较干燥 、较疏松 、生长良好的黄色颗粒状胚性愈伤组
织 ,淘汰非胚性愈伤组织 。
1.2.3　愈伤组织的分化及植株再生
在筛选出的合适继代培养基中 ,分别添加 0 mg/ L、
0.1 mg/L 、0.3 mg/ L 、0.5 mg/ L 、0.7 mg/L 和
1.0 mg/L 6-BA作为愈伤组织分化培养基。选取胚
性愈伤组织 ,接种后置于 25±1℃、80μmol/(m2 ·s)光
照强度 、光照时间为 14h/d的条件下培养 。
1.2.4　生根培养和移栽驯化
当再生苗长至 2 ～ 3cm 高时 ,将其转接到生根
培养基 1/2M S+NAA0.1mg/ L +蔗糖 1% +琼脂
0.7%(pH5.8)上 ,进行生根及壮苗培养 ,培养条件
同 1.2.3。待再生苗生根后 ,将根系健壮的小苗置
于培养室(温度 25±3℃、光照时间 14h/d)中炼苗
3d ,再用自来水冲洗掉小苗根部的培养基 ,将其移栽
—90—
第 32 卷　第 6 期　　　　　　　　　　中　国　草　地　学　报　　　　　　　　　　2010年 11 月
　　Vo l.32　No.6　　　　　　　　　　Chinese Journal o f Grassland 　　　　　　　　　 Nov.2010　　
到土壤和蛭石(2:1)的无菌混合基质中 ,置于培养室
中保湿培养 3周后 ,移入温室培养 。
2　结果和分析
2.1　愈伤组织的诱导
星星草 、朝鲜碱茅种子接种到愈伤组织诱导培
养基上以后 , 13 ～ 15d后在纤细 、弯曲白色胚芽基部
才能出现愈伤组织 。当培养基中 2 , 4 -D 浓度为
4.0mg/ L 时 , 诱导率最高 , 可分别达到 53.3%和
46.7%(见表 1)。所有愈伤组织生长均比较缓慢 ,
绝大多数呈灰白色胶水状。用镊子夹去胚芽后 ,将
愈伤组织连同种子一块转入继代培养基 ,大约 1/2的
初代愈伤组织在继代培养过程中能转化为胚性愈伤组
织。
表 1　不同培养基对愈伤组织诱导结果
Table 1　The result of inducing callus by different mediums
培养基
Medium
2 , 4-D 含量
(mg/ L)
Concen tratin of
2 , 4-D(mg/ L)
星星草种子出愈率
Callus indu ction
rate f rom seed s
of Puccinellia tenui f lora
朝鲜碱茅种子出愈率
Callu s induct ion rate
f rom seeds of Puccinellia
chinampoensis
C1 1.0 16.7% 13.3%
C2 2.0 26.7% 20%
C3 3.0 30% 33.3%
C4 4.0 53.3% 46.7%
C5 5.0 40% 40%
C6 6.0 20% 26.7%
2.2　继代培养
星星草和朝鲜碱茅愈伤组织一般要经过 1个继
代周期后 , 才能逐渐转变为表面较干燥 、 结构较疏
松 、 质地较硬的黄色颗粒状胚性愈伤组织。在含有
1mg/L 2 , 4-D 的继代培养基中 , 星星草和朝鲜
碱茅胚性愈伤组织转化率均比较高 , 均可达到
50%以上 。但朝鲜碱茅愈伤组织生长速度比星星草
要慢 。
2.3　愈伤组织的分化及植株再生
星星草胚性愈伤组织在含有 1.0mg/L 2 , 4-D、
不含 6-BA 的分化培养基上 , 只有极个别的愈伤
组织块出现分化 。随着培养时间的延长 , 大部分愈
伤组织表面变褐 、变黑 , 失去分化能力。在培养基
中添加 6-BA 后 , 分化率明显提高 。当培养基中 6
-BA浓度为 0.3 mg/ L 时 , 愈伤组织的分化率最
高 , 达到了 82.5% (见图 1A 和表 2)。随着 6-
BA 浓度的进一步升高 , 呈现分化迹象的愈伤组织
块数也有所增加 , 但分化率呈下降趋势。当培养基
中 6-BA 含量达到 0.7mg/ L 以上时 , 部分愈伤组
织表面也出现了叶片弯曲的浅绿色小芽 , 但小芽生
长缓慢。其中大部分小芽在培养过程中逐渐玻璃化
或枯萎 , 仅少部分小芽能长成完整的植株 。将这样
的愈伤组织及时转接入不含任何植物激素的培养基
中培养 , 则大部分小芽仍能继续生长并发育成正常
的小植株。
A为正在分化的星星草愈伤组织;B为生根培养基中的星星草
再生植株;C 、D 为移栽成活的星星草再生植株。
A:Dif ferentiat ing calli f rom Puccinel lia tenu i f lora;
B:A regenerant f rom Puccinel lia ten ui f lora on rooting medium;
Cand D:Acclim at ized p lan tlet s growing in pots.
图 1　星星草愈伤组织分化 、再生植株生根和移栽情况
Figure 1 　Diffe rentiating calli from Puccinellia tenui f lora ,
r oo t develpoment and acclimation o f regenerants
朝鲜碱茅胚性愈伤组织在在含有1.0mg/ L 2 ,4-D 、
不含 6-BA 的分化培养基上 ,没有出现分化迹象。
在培养基中添加少量的 6-BA(0.1mg/ L)后 ,少数
愈伤组织开始变白变硬 ,表面出现一些小绿点 ,并陆
续分化出小芽(见图 2A 、B)。当培养基中 6-BA 含
量达到 0.3mg/ L 时 ,愈伤组织的分化率最高 ,可达
到 75.7%(见表 2)。进一步提高培养基中 6 -BA
浓度 ,愈伤组织表面生根现象也随之严重 ,分化率则
明显下降。
—91—
李晓玲　李克秀　于晓明　　星星草和朝鲜碱茅组织培养体系的建立
表 2　星星草、朝鲜碱茅愈伤组织在不同培养基上的分化情况
Table 2　The result of dif feretiation of the calli from
Puccinellia tenui f lora and Puccinellia chinampoensis
by different mediums
培养基
Medium
6-BA 含量
(mg/ L)
Con cen t rat in of
6-BA(mg/ L)
星星草愈伤组织分化率
Differetiation rate of
calli f romPuccinel lia
tenui f lora
朝鲜碱茅愈伤组织分化率
Dif feretiation rate of
calli fromPuccinellia
chinampoensis
D1 0 3.3% 0%
D2 0.1 47.6% 32.3%
D3 0.3 82.5% 75.7%
D4 0.5 69.5% 56.2%
D5 0.7 39.8% 45.3%
D6 1.0 13.6% 13.4%
A 、B为正在分化的朝鲜碱茅愈伤组织;
C为生根培养基中的朝鲜碱茅再生植株;
D为移栽成活的朝鲜碱茅再生植株。
A and B are differentiating calli f rom Puccinellia chinampoensis;
C:A regenerant from Puccinellia chinampoensis on rooting medium;
D:A acclimati zed plant let grow ing in a pot.
图 2　朝鲜碱茅愈伤组织分化 、再生植株生根和移栽情况
Figure 2　Differentiating calli from Puccinellia chinampoensis ,
r oo t develpoment and acclimation o f reg ener ants
2.4　生根培养和移栽驯化
大部分星星草和朝鲜碱茅再生植株在分化培养
基上就可生根 ,但根系相对比较弱。将其移入生根
培养基后 ,生根率达到 100%。且小苗在生根培养
基上长势非常好 ,根系健壮(见图 1B 和图 2C)。具
有健壮根系的星星草和朝鲜碱茅再生植株移栽后也
极易成活 ,成活率均可达到 95%以上(见图 1C 、D和
图 2D)。
3 　讨论
禾谷类植物经过体细胞培养后 ,容易引起后代
的各种性状变异 ,而且经常出现一个或少数基因的
突变 ,有利于在不改变品种基本特征的情况下 ,改进
个别性状 ,如降低株高 、提高抗病性等 ,可以弥补杂
交育种等常规育种的不足[ 4 ～ 5] 。因此 ,植物体细胞
克隆变异在禾本科牧草育种方面具有较大的应用潜
力。星星草和朝鲜碱茅是两种重要的禾本科多年生
牧草 ,均具有较强的耐盐碱性和较高的经济价值 ,稳
定高效组织培养体系的建立对这两种牧草细胞工程
育种和基因工程育种工作具有重要的意义。
植物生长调节物质对愈伤组织的诱导及分化具
有十分复杂而重要的影响[ 6 ～ 7] 。在禾本科植物组织
培养中 ,2 , 4-D是公认的诱导愈伤组织最有效的生
长素 。在玉米和大麦等其他几种禾谷类作物组织培
养中 ,也得到了类似的结果[ 8 ～ 10] 。本文的研究结果
也表明 ,2 , 4-D对星星草和朝鲜碱茅愈伤组织的诱
导及愈伤组织在继代培养过程中分化能力的保持均
具有重要的作用。两牧草愈伤组织诱导时 ,均需要
相对较高浓度的 2 , 4-D(3.0 ～ 4.0 mg/ L),而在继
代培养和分化诱导时则需降低培养基中 2 ,4-D含
量(0.5或 1.0 mg/L);细胞分裂素在某些禾本科植
物中具有提高愈伤组织的质量和促进体细胞胚胎发
生的作用[ 11 ～ 12] 。在对星星草和朝鲜碱茅组织培养
研究过程中 ,我们也发现在培养基中添加少量的
6-BA(0.1mg/L 或 0.3mg/L)可促进其愈伤组织
的分化。随着培养基中 6-BA 含量的升高 ,愈伤组
织的分化率则明显下降。
参考文献(References):
[ 1] 　刘立侠 ,李桂明 ,路云侠 ,王德利.中国牧草生物技术的研究现
状和展望[ J].草地学报 , 2009 , 17(3):127-135 , 139.
Liu Lixia , Li Guiming , Lu Yunxia , Wang Deli.Cu rrent status
and prospect in the biotechnology of forage breeding in China
[ J].Acta Agrest ia S inica ,2009 , 17(3):127-135 , 139.
[ 2] 　李建东 , 吴榜华 , 盛连喜.吉林植被 [ M].吉林科技出版社 ,
2001 , 220-225.
Li Jiandong , Wu Bang hua , Sheng Lianxi.Ji lin vegetation [ M].
J i l in S cience and Technolog y Press , 2001 , 220-225.
[ 3] 　徐安凯 , 齐宝林 , 孙中心.碱茅新品种选育研究初报—盐分对
种子发芽的影响 [ J].茶叶科学 , 1994 , 11(1)25-27.
Xu Ankai , Qi Baolin , Sun Zh ongxin.T he primary stu dy on se-
—92—
中国草地学报　2010年　第 32 卷　第 6 期
l ecting and b reeding new variety of Alkalig rass— the effect of
sal t on seed germinat ing[ J].J ourna l Tea S cience , 1994 , 11(1)
25-27.
[ 4] 　朱至清.体细胞无性系变异与植物改良[ J] .植物学通报 ,
1991 , 8:1-8.
Zhu Zhiqing.S omaclonal variation and plant improvemen t [ J].
Ch inese Bu llet in o f Botang , 1991 , 8:1-8.
[ 5] 　赵成章.再论植物体细胞无性系变异及作物改良[ J].生物工
程进展 , 1993 , 4:32-36.
Zhao Chengzhang.Discu ss on plan t somaclonal variat ion and
crop im provement[ J] .P rog ress in B iotechnolog y , 1993 , 4:
32-36.
[ 6] 　李俊琴 ,云锦凤 ,云岚 ,赵宏宇.新麦草幼胚愈伤组织诱导[ J] .
中国草地学报 , 2008 , 30(2):39-44.
Li Junqin , Yun Jin feng , Yun Lan , Zhao H ongyu.Callus induc-
t ion of immature em bryo of P sath y rostachys juncea [ J].Chi-
nese Journa l o f Grass land , 2008 , 30(2):39-44.
[ 7] 　史铁伟 ,韩冰 ,王强.大针茅成熟胚愈伤组织诱导及分化的探
索[ J].中国草地学报 , 2009 , 31(6):64-70.
Shi Tiewei , H an Bing , Wang Qiang.Callu s indu ction an d di f-
f erent iation of mature embryos of S t ip a g rand is [ J] .Ch inese
Journa l o f Grass land , 2009 , 31(6):64-70.
[ 8] 　Bohorova NE , Luna B , Briton RM.Regeneration potent ial of
t ropical , and subt ropical , midalt itude , and high lan d maiz e in-
breds[ J].Mayd ica , 1995 , 40:275-281.
[ 9] 　Bregit zer P , Campb ell RD , Wu Y.Plant regeneration f rom b ar-
ley callus:ef fect s of 2 , 4-dichlo rp henoxy acet ic acid and ph eny-
lacetic acid[ J] .P lant Cell Tissue Organ Cu lt , 1995 , 43:229-
235.
[ 10] 　X Q H uan g , Z M Wei. High-frequen cy plan t regeneration
through callu s ini tiation f rom mature emb ry os of maiz e(Zea
Mays L.)[ J].P lan t Cell Rep or ts , 2004 , 22(11):793-800.
[ 11] 　Dahleen LS , Bregi tz er P.An imp roved media sy stem for high
regenerat ion rates f rom barley immature emb ry o-derived cal-
lus cultures of commercial cu lti vars[ J] .Crop Sci , 2002 , 42:
934-938.
[ 12] 　Chang Y , von Zit zewi tz J.H ayes PM.High f requency plan t
regeneration f rom immature emb ry os of an eli te barlry cul ti-
var(Hord eum vulgare L.cv.M orex)[ J] .Plant Cel l Rep ,
2003 , 21:733-738.
Establishment of Tissue Culture System for
Puccinellia tenui f lora and Puccinellia chinampoensis
LI Xiao-ling1 , LI Ke-xiu1 , YU Xiao-ming 2
(1.School of Chemistry and Li fe S cience , Changchun University o f Technology ,
Changchun 130012 , China;2.J ilin Agricultural Science &Technology College , Changchun 130000 , China)
Abstract:Tissue culture sy stem w as developed for plant reg eneration f rom mature embryo -de rived
calli o f Puccinel lia tenui f lora and Puccinel l ia chinampoensis , respectively.The resul ts show ed that the
induction rates of primary calli f rom mature embryo s of Puccinel lia tenui f lora and mature embryo s of
Puccinel lia chinampoensis we re up to 53.3% and 46.7% on callus induction medium contained M S basal
salt s and vitamins , 300mg/L CH , 4.0mg/ L 2 , 4-D and 3% sucro se and solidif ied wi th 0.7% agar
(pH5.8), respectively.After the calli w ere subcultured on subculture medium contained MS basal sal ts
and vi tamins , 300mg/L CH , 1.0mg/L 2 ,4-D and 3% sucro se and so lidi fied w ith 0.7% agar(pH5.8), the
dif ferentiation rates f rom embryo genic calli f rom the tw o kinds of fo rage w ere 82.5% and 75.7% on dif-
ferent iation medium contained MS basal sal ts and vi tamins , 300mg/L CH , 1.0mg/ L 2 ,4-D , 0.3 mg/ L 6-
BA and 3% sucrose and solidi fied wi th 0.7%agar(pH5.8), respect ively.The surviv al rate of all regenera-
nts wi th st rong roo ts w ere mo re than 95% af ter they w ere t ransplanted to soil.
Key words:Puccinel lia tenui f lora ;Puccinel l ia chinampoensis;Mature embryo;Tissue culture
—93—
李晓玲　李克秀　于晓明　　星星草和朝鲜碱茅组织培养体系的建立