全 文 ： 研究报告
Research Report
甘蔗与滇蔗茅杂交后代 F1、BC1 表型和 GISH 分析
林秀琴 1 陆鑫 1 刘新龙 1 毛钧 1 字秋艳 1 刘洪博 1 李忠磊 1 李旭娟 1 徐超华 1 李纯佳 1 蔡青*1, 2
1 云南省农业科学院甘蔗研究所/云南省甘蔗遗传改良重点实验室, 开远, 661699; 2 云南省农业科学院生物技术与种
质资源保存研究所, 昆明, 650223
*通讯作者: caiqingysri@163.com
摘 要 滇蔗茅是甘蔗重要的近缘植物资源，在甘蔗种质创新和遗传改良中具有重要利用价值。为了鉴定
甘蔗与滇蔗茅远缘杂交 F1、BC1 真实性后代种质并探明其遗传物质组成，本研究对远缘杂交组合亲本和后
代材料进行了形态学观察、染色体计数、核型分析和染色体荧光原位杂交(genomic in situ hybridization,
GISH)分析。结果：(1)表型鉴定结果显示，F1 叶片具父本滇蔗茅特征，BC1 后代叶片则趋于甘蔗品种。BC1
的节间长度和株高表现出一定的杂种优势，茎径和锤度则逐渐趋于甘蔗品种(ROC10)；(2)细胞学鉴定结果
显示：父本云南 95-20 2n=30，核型属 2B 类型。F1 云野 03-316 2n=54，属 2B 类型；3 个 BC1 后代材料 2n
均为 110，其中云野 06-278 属 2B 类型，云野 06-277 和云野 06-279 属 2C 类型。(3)GISH 结果：在 F1 和 3
个 BC1 材料中均检测到 15 条滇蔗茅野生种外源染色体，但没有检测到重组染色体。以上结果表明 F1 和 BC1
是真实的杂交后代种质，杂交过程染色体遗传方式分别为 n+n 和 2n+n。本研究可为滇蔗茅有利基因向甘蔗
转移提供细胞学证据，为滇蔗茅在甘蔗杂交创新中利用方式的制定提供参考。
关键词 甘蔗, 滇蔗茅, 杂交后代, GISH 技术
Analysis of Intergeneric Hybrids (F1 、 BC1) of
Saccharum×Erianthusrockii using Morphology and GISH Technique
Lin Xiuqin1 Lu Xin1, Liu Xinlong1 Mao Jun1 Zi Qiuyan1 Liu Hongbo1 Li Zhonglei1 Li Xujuan1 Xu
Chaohua1 Li Chunjia1 Cai Qing*1,2
1 Sugarcane Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences / Yunnan Provincial Key Laboratory of Genetic
Improvement for Sugarcane, Kaiyuan, 661699; 2 Biotechnology and Germplasm Resources Institute Yunnan Academy of
Agricultural Sciences, Kunming, 650223
*Corresponding author: caiqingysri@163.com
Abstract Erianthus rockii is an important, closely related genus of Saccharum L., with a great value in
网络出版时间：2016-12-05 09:37:48
网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20161205.0937.004.html
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sugarcane innovation and variety improvement. In order to identify the real F1 and BC1 hybrids of
Saccharum×Erianthus rockii, and prove the genetic composition, the morphological, cytological and GISH
(genomic in situ hybridization) technique were used to analyze the parental, F1 and BC1 hybrids materials.
The results show that: (i) the leaves of F1 progeny were observed alike to the male parent of Erianthus rockii
and the leaves of BC1clones were more alike with sugarcane. The BC1 hybrids appeared heterosis in the
internode length and plant height, while the diameter and brix were tended to similarity to sugarcane
cultivated variety (ROC10); (ii) The cytology identification results has shown that: the somatic chromosome
number of the male parent Yunnan 95-20 (Erianthus rockii) was 2n=30 with a 2 B karyotype; the F1 clone
Yunye 03-316 chromosome number was 2n=54, the karyotype was 2 B; all of the three BC1hybrids have a same
somatic chromosome number2n=110, but different karyotype: the Yunye 06-278 was 2 B type, and both Yunye
06-277 and Yunye 06-279 were 2 C type; (iii) the result of the GISH detected that there were 15 wide
chromosomes from Erianthus rockiiin F1 and three BC1 hybrids, but not any recombination chromosome was
detected by GISH. All the results indicated that the F1 and the three BC1hybrids were the real progenies of
Saccharum×Erianthus rockii intergeneric hybridization, and the chromosome transmission method was n+n
and 2n+n respectively. This study can provide the cytological evidence for identification of the advantageous
genes of Erianthus rockii transfer to sugarcane, and provide a reference for ultilization method of Erianthus
rockii in the sugarcane innovation process.
Keywords Sugarcane, Erianthus rockii, Hybrid, Genomic in situ hybridization (GISH)
甘蔗(Saccharum spp.)是世界重要的糖料作物和可再生能源植物资源。现代甘蔗栽培品种主要是一个世
纪以前由产糖品种热带种(S. officinarum L.)和野生种割手密(S. spontaneum L.)种间杂交形成的复合多倍体
植物(方静平等, 2014)。由于长期的种内杂交制种(热带种和割手密多次杂交或回交后代选育出的品种)，使
得甘蔗近亲繁殖严重，想获得突破性品种难度较大(Wang et al., 2008)。甘蔗的近缘植物如斑茅(Saccharum
arundinaceum)(黄永吉等, 2014)、滇蔗茅(Erianthus rockii)(刘新龙等, 2009)和芒(Miscanthus)(梁绪振等, 2010)
等具有许多野生资源的优良性状，利用远缘杂交方法将这些资源的有益基因导入到甘蔗，可以增加甘蔗的
遗传变异，充分发掘和利用远缘杂交获得的优良后代材料对甘蔗育种工作有重要意义(Deng et al., 2010)。
滇蔗茅(Erianthus rockii)属蔗茅属，与甘蔗的亲缘关系较近(Cai et al., 2005)，在甘蔗遗传改良和培育甘蔗抗
锈病品种中具有较大的利用价值(李文凤等, 2007)。目前，甘蔗与滇蔗茅属间远缘杂交利用研究取得了一些
进展，如国外 Aitken 等(2007)对两属杂交后代进行了分子标记鉴定研究，国内陆鑫等(2012a)对两属杂交后
3

代 F1 群体进行了 SSR 分析和农艺性状遗传分析(陆鑫等, 2012b)。然而，对这两个种的杂交后代如 F1、BC1
及更高世代的细胞学研究较少。
由于 GISH 具有方便、快速、准确鉴定作物远缘杂交后代染色体组成和染色体遗传行为的特点，在作
物远缘杂交后代染色体的跟踪鉴定中得到了广泛应用(王虹, 2014)。1996 年，D’Hont 等(1995)第一次证实了
应用 GISH 技术可以有效区分甘蔗属热带种和割手密的染色体，其研究表明现代重要甘蔗栽培品种 R570
的基因组含 80%热带种染色体，10%割手密染色体及约 10%的种间交换染色体。这种重要但比例仍较小的
种间染色体交换的出现否认了以前认为这两个种间不会发生重组的观点(D’Hont et al., 1995; Jenkin et al.,
1995)。Piperidis 等(2010a)应用 GISH 技术研究发现在低世代的甘蔗种间杂交品种中含 1~2%种间交换染色
体，表明了这些交换开始于第一代杂种的减数分裂，然后在世代中逐渐积累，这些交换是非同源染色体间
部分同源重组或易位的结果。Piperidis 等(2010b)还应用 GISH 技术对甘蔗与斑茅杂交后代染色体遗传规律
进行研究，结果表明在杂交利用过程中斑茅染色体存在丢失现象，且斑茅染色体未与甘蔗染色体发生重组，
杂交 F1 与 BC2 过程染色体以 n+n 方式传递，而 BC1 过程为 2n+n 方式。此外，荧光原位杂交技术(fluorescent
in situ hybridization, FISH)可在分子水平上为甘蔗染色体提供有效的识别标记，有助于甘蔗物种进化及亲缘
关系分析(王平等, 2015)。
甘蔗与滇蔗茅核型相近，利用一般的核型分析方法无法识别杂交后代染色体来源，亦无法鉴别染色体
的结构变异(如易位、缺失、重组等)；而 GISH 技术不仅可以有效鉴定杂交后代染色体组成，而且可以清
晰直观地跟踪鉴定外源染色体的较小片段。本研究结合形态学标记、细胞学观察和 GISH 技术检测，对甘
蔗属热带种与滇蔗茅远缘杂交 F1、BC1 进行真实性鉴定、染色体组成和遗传方式分析，可为滇蔗茅有利基
因向甘蔗转移提供细胞学证据，为甘蔗与滇蔗茅杂交创新利用方式的制定提供参考。
1 结果与分析
1.1 亲本、F1和 BC1 形态学观察
甘蔗原始亲本热带种越南牛蔗与滇蔗茅云南 95-20 杂交后代 F1 叶片像滇蔗茅，单从叶片形态观察就很
容易鉴定是甘蔗与滇蔗茅的真实杂交后代；当 F1 作母本与甘蔗品种 ROC10 杂交获得 BC1后代时，BC1后
代叶片则趋向于像甘蔗品种 ROC10(图 1)，节间长度和株高表现出一定的杂种优势，茎径和锤度逐渐趋于
甘蔗品种，从形态学上较难鉴定 BC1为甘蔗与滇蔗茅的真实杂交后代材料。此外，杂交后代 F1 遗传了野生
种滇蔗茅易开花的习性，在 11 月底孕穗，12 月中、下旬抽穗开花，BC1后代开花能力减弱。表 1 列出了
亲本、F1 和 BC1 杂交后代材料主要农艺性状。
表 1 亲本、F1 和 BC1主要农艺性状
4

Table 1 The main agronomic traits of the parental, F1 and BC1 hybrids
材料名称
The material’s name
节间长度
(cm)
The
internode
length (cm)
株高(cm)
The plant
height (cm)
茎径(cm)
The
diameter
(cm)
锤度(%)
The brix
(%)
叶长(cm)
The leaf
length (cm)
叶宽(cm)
The leaf
width(cm)
越南牛蔗(F1母本)
Yuenan niuzhe (the female parent of F1
progeny)
8.1 102 2.8 19 152 4.5
云南 95-20 (F1父本)
Yunnan 95-20 (the male parent of F1
progeny)
15.8 162 0.75 48 3.2
云野 03-316 (F1, 同时为 BC1母本)
Yunye 03-316 (the F1 progeny, the
female parent of BC1 progenies also)
11.1 140 1.3 17.5 96 4.5
ROC10 (BC1父本)
ROC10 (the male parent of the BC1
progenies)
8.5 165 2.55 22 173 5.9
云野 06-277 (BC1)
Yunye 06-277 (BC1)
8.9 167.7 2.2 21 158 5.2
云野 06-278 (BC1)
Yunye 06-278 (BC1)
10.6 176.7 2.3 19.5 177 5.4
云野 06-279 (BC1)
Yunye 06-279 (BC1)
11.1 168.5 2.4 19 165 5.3
5


A B C D E F G
图 1 亲本、F1 和 BC1叶片
注: A: 越南牛蔗; B: 云南 95-20; C: 云野 03-316; D: ROC10; E: 云野 06-277; F: 云野 06-278; G: 云野 06-279
Figure 1 The leaves of the parental, F1 and BC1 hybrids
Note: A: Yuenan niuzhe; B: Yunnan 95-20 C: Yunye 03-316; D: ROC10; E: Yunye 06-277; F: Yunye 06-278; G: Yunye 06-279

A B C D E F G
图 2 亲本、F1 和 BC1茎段
注: A: 越南牛蔗; B: 云南 95-20; C: 云野 03-316; D: ROC10; E: 云野 06-277; F: 云野 06-278; G: 云野 06-279
Figure 2 The cane stalks of the parental, F1 and BC1 hybrids
Note: A: Yuenan niuzhe; B: Yunnan 95-20; C: Yunye 03-316; D: ROC10; E: Yunye 06-277; F: Yunye 06-278; G: Yunye 06-279
1.2 亲本、F1和 BC1 核型分析
通过染色体制片、显微观察和数目统计，结果父本云野 95-202n=30=14m+16sm，核型属 2B 类型。F1
云野 03-3162n=54=16m+38sm，属 2B 类型，3 个 BC1 后代(云野 06-277、云野 06-278 和云野 06-279)体细
6

胞染色体数目均为 110，核型公式分别为 2n=110=38m+70sm+2st(云野 06-277)、2n=110=106m+4sm(云野
06-278)和 2n=110=102m+8sm(云野 06-279)，其中云野 06-278 属 2B 类型，云野 06-277 和云野 06-279 属
2C 类型(表 2; 图 3)。
表 2 亲本、F1 和 BC1核型分析数据
Table 2 The karyotype of the parental, F1 and BC1 hybrids
材料名称
The material names
染色体数目(2n)
Chromosome number
(2n)
核型
Karyotype
核型类型
Karyotype type
越南牛蔗(F1母本)
Yuenan niuzhe (the female parent of F1
progeny)
80a
云南 95-20 (F1父本)
Yunnan 95-20 (the male parent of F1
progeny)
30 2n=30=14m+16sm 2B
云野 03-316 (F1, 同时为 BC1母本)
Yunye 03-316 (the F1 progeny, the
female parent of BC1 progenies also)
54 2n=54=16m+38sm 2B
ROC10 (BC1父本)
ROC10 (the male parent of the BC1
progenies)
112b
云野 06-277(BC1)
Yunye 06-277(BC1)
110 2n=110=38m+70sm+2st 2B
云野 06-278(BC1)
Yuanye 06-278(BC1)
110 2n=110=106m+4sm 2C
7

云野 06-279(BC1)
Yuanye 06-279(BC1)
110 2n=110=102m+8sm 2C
注: a 表示染色体数目是前人鉴定的结果, 但是结果未发表; b 表示数据来自参考文献, 黄东益等(2000)
Note: a indicate the chromosome number was identifiedby other people, but the result was unpublished; b indicate the datawas from
the referent, Huanget al (2000)

图 3 父本、F1 和 BC1中期细胞染色体和核型
8

注: A、B、C、D 和 E 分别为父本云南 95-20、F1云野 03-316、BC1云野 06-277、BC1云野 06-278 和 BC1云野 06-279 根尖
中期细胞染色体; A’、B’、C’、D’和 E’分别为对应的核型
Figure 3 The metaphase and karyotype of the male parent, F1andBC1hybrids
Note: A, B, C, D and E indicated the root tips’metaphase cells of Yunnan95-20, Yunye03-316(F1 clone), Yunye06-277(BC1 clone),
Yunye06-278(BC1 clone) and Yunye06-279(BC1 clone) respectively; A’, B’, C’, D’ and E’ showed the karyotype respectively
1.3 F1 和 BC1染色体组成 GISH 分析
对 1 个 F1和 3 个 BC1 进行双色 GISH 分析，结果：在 F1(图 4-A’)和 3 个 BC1(图 4-B’、C’、D’、E’、F’
和 G’)根尖中期细胞中均检测到 15 条野生种滇蔗茅染色体(橙红色荧光信号)，含甘蔗染色体数目分别为 39
和 95(黄绿色荧光信号)。双色 GISH 结果没有检测到甘蔗与滇蔗茅属间交换、重组或异位片段的染色体。
结合 2.2 对亲本、F1 和 BC1 染色体数目鉴定结果，可以得出结论：甘蔗与滇蔗茅远缘杂交过程，双亲均形
成 n 配子，染色体以 n+n 方式进行遗传，当利用 F1 子代作母本进一步与甘蔗品种 ROC10 杂交时，染色体
以 2n+n 方式遗传给 BC1后代，即母本 F1 形成了 2n 雌配子，而父本甘蔗品种 ROC10 形成 n 雄配子遗传给
BC1 后代。表 3 为杂交后代 F1 和 BC1 染色体遗传组成 GISH 分析结果。

图 4 杂交后代 F1和 BC1 GISH 分析
注: A 和 A’为云野 03-316(F1)的 GISH 图; B, B’和 E’为云野 06-277(BC1)的 GISH 图; C, C’和 F’为云野 06-278(BC1)的 GISH 图;
D、D’和 G’为 06-279(BC1)的 GISH 图; A, B, C 和 D 为 DAPI 复染效果; A’, B’, C’, D’, E’, F’和 G’为双色 GISH 结果
Figure 4 The GISH results of F1 and BC1 hybrids
Note: A and A’ showed the GISH result of F1 clone Yunye03-316; B, B’ and E’ showed the GISH result of BC1 progeny
Yunye06-277; C, C’ and F’ showed the GISH result of BC1 progeny Yunye06-278; D, D’ and G’ showed the GISH result of BC1
9

progeny Yunye06-279; A, B, C and D were counterstained with DAPI; A’, B’, C’, D’, E’, F’ and G’ were the result of the bi-color
GISH
表 3 F1、BC1染色体组成 GISH 分析
Table 3 The chromosome composition of the F1 and BC1 hybrids by GISH


后代材料名称
The name of the hybrids

2n 数目
2n number
来自甘蔗的数目
Chromosome
from sugarcane
来自滇蔗茅的数目
Chromosome from
Erianthus rockii
观察细胞数
Cells
云野 03-316(F1)
Yunye 03-316(F1)
2n=54 39 15 5
云野 06-277(BC1)
Yunye 06-277(BC1)
2n=110 95 15 3
云野 06-278(BC1)
Yunye 06-278(BC1)
2n=110 95 15 3
云野 06-279(BC1)
Yunye 06-279(BC1)
2n=110 95 15 3

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图 5c 正常和异常减数分裂过程
注: c 表示图片来自文献, Wu 等(2014)
Figure 5 The procedure of the normal meiosis and abnormal meiosis
Note: c indicated the picture was from the reference by Wu et al (2014)
2 讨论
利用甘蔗与近缘植物资源蔗茅(Erianthus)进行属间远缘杂交利用，有望创制出宿根性好、抗逆性、抗
病性强的后代种质材料。对后代种质材料进行真实性鉴定和染色体遗传分析是重要的工作。蔗茅属内染色
体类型较丰富，其中斑茅 2n 为 20、40 和 60 三种类型(蔡青等, 2002)，蔗茅 2n 为 20(王先宏等, 2011)，滇
蔗茅 2n 为 30(林秀琴等, 2013a)，甘蔗属热带种 2n=80，甘蔗栽培品种染色体数目多，一般 2n>100(吴海兰
等, 2013)。吴嘉云等(2014)的研究表明：甘蔗与斑茅杂交后代染色体遗传特性非常复杂，F1 过程染色体以
n+n 方式遗传，而 BC1过程较复杂，形成了不均等的 2n 配子，在不同的 BC1 后代材料中其体细胞染色体
数目和含斑茅染色体数目均存在较大差异，另外，在 13 个 BC1 材料中有 4 个被检测出含超 2n 配子染色体
(比例约为 31%)，即在 BC1 材料中检测出含斑茅染色体数目超出了 F1，其研究提出了减数分裂形成异常配
子的两种可能机制：模式Ⅰ，包括 NHC 和 SDR；模式Ⅱ，包括 FDR 和 NSC，如图 5。Wang 等(2010)对
甘蔗与蔗茅杂交 F1 的染色体遗传组成进行分析，结果表明甘蔗与蔗茅杂交种 F1 染色体组成为 n+n 和 2n+n
两种方式(n 为整倍或非整倍的 n)。本研究应用 GISH 技术在杂交后代 F1 和 3 个 BC1材料中均检测到含 15
条滇蔗茅野生种染色体，结合对亲本和后代材料染色体数目鉴定的结果，说明了甘蔗与滇蔗茅属间远缘杂
交 F1 和 BC1过程，染色体分别以 n+n 和 2n+n 方式进行遗传，然而，在 F1 和 BC1后代细胞中甘蔗和滇蔗
茅两套染色体单独存在，GISH 技术没有检测到交换、重组、断裂、丢失或异位的染色体。根据吴嘉云等
(2014)报道的减数分裂异常及 2n 配子形成机制类型(图 5)，结合本研究染色体数目鉴定结果和染色体组成
GISH 结果进行分析，笔者认为甘蔗与滇蔗茅杂交 F1 形成 2n 雌配子的机制为 FDR 类型。FDR 型 2n 配子
比 IMR 更易存活。然而这与 Hermann 等(2012)报道甘蔗 2n 配子形成机制多属于 SDR 类型的结果不同。对
产生孢子的器官进行光学显微观察有助于我们了解 2n 配子形成的机制，这对于转移甘蔗近缘属优良基因
具有重要意义。核型分析结果表明，除 BC1 云野 06-277 有一对近端着丝粒染色体外，其余都为中着丝粒
或近中着丝粒染色体，云野 03-316(F1)、云野 06-278(BC1)属 2B 类型，云野 06-277(BC1)和云野 06-279(BC1)
属 2C 类型，核型类型均属于比较原始的类型，2C 比 2B 较进化。
甘蔗与滇蔗茅杂交 F1 花粉母细胞减数分裂异常、花粉完全败育(林秀琴等, 2016)，所以在甘蔗育种中
F1 只能用作母本与甘蔗进行杂交或回交，F1 作母本可形成 2n 配子遗传给 BC1。但是，这种含整套野生种
11

染色体的渗入系后代材料，可能给甘蔗背景染色体带来巨大的累赘(王玉海等, 2016)，与大量外源染色体转
入栽培种的渗入系相比，寻找携带外源遗传物质较少的易位系、异代换系、异附加系后代材料在育种上更
好利用，其中小片段易位系(遗传比较稳定)是转移外源有利基因的最有效方式(罗巧玲等, 2014; Huang et al.,
2015)。李小军等(2016)应用 GISH 技术鉴定了小麦与中间偃麦草的 19 个二体代换系和 1 个二体附加系。他
们认为对这些材料进行组织培养、电离辐射和杀配子染色体等方法处理容易获得易位系，它们的利用价值
更高，这可为甘蔗遗传改良、甘蔗与滇蔗茅杂交创新利用方式的制定提供重要借鉴和参考。
本研究用形态学和细胞学分析方法，鉴定了 1个 F1和 3个BC1均为甘蔗和滇蔗茅的真实杂交后代材料，
这两个种远缘杂交 F1 和 BC1 过程，染色体分别以 n+n 和 2n+n 的方式进行遗传。利用作物栽培品种与野生
种的远缘杂交是利用野生种有利基因(病虫的抗性基因)的一个重要途径，由于滇蔗茅具有抗蔗茅柄锈病的
优良性状，挖掘来自滇蔗茅抗锈病新基因并转入甘蔗，丰富甘蔗锈病抗源，在甘蔗的遗传改良研究中具有
重要利用价值。进一步构建 F1 后代(抗锈病)及高感锈病亲本、杂种 F2 及 BC1群体，筛选与抗病基因紧密连
锁的分子标记，进行抗病基因染色体定位具有重要的研究意义。
3 材料与方法
3.1 材料
属间远缘杂交亲本及后代材料用塑料桶栽种在亲本圃，材料由国家农作物种质资源平台和国家甘蔗种
质资源圃提供，亲本、F1 和 BC1 组成见表 4。
表 4 杂交组合亲本、F1和 BC1组成情况
Table 4 The combination of the parental, F1 and BC1 hybrids ofthe hybridization
杂交世代
Generation

后代材料名称
The name of the hybrids
母本
Female parent
父本
Male parent
F1 云野 03-316
Yunye 03-316
越南牛蔗
Yuenan niuzhe
云南 95-20
Yunnan 95-20
BC1 云野 06-277
Yunye 06-277
云野 03-316
Yunye 03-316
ROC10
BC1 云野 06-278
Yunye 06-278
云野 03-316
Yunye 03-316
ROC10
BC1 云野 06-279 云野 03-316 ROC10
12

Yunye 06-279 Yunye 03-316
3.2 表型鉴定
甘蔗和滇蔗茅杂交亲本、F1 和 BC1实验材料用塑料桶栽种在亲本圃，以成熟期对主要农艺性状进行观
察测定，每个材料测三株取平均值。
3.3 染色体数目鉴定与核型分析
根尖预处理：取亲本、F1 和 BC1 根尖(约 1cm 长)，用对二氯苯水饱和溶液和 0.002 mol/L 8-羟基喹啉等
体积混合溶液，室温预处理4 h，0.075 mol/L KCl低渗1 h(室温)，现配卡诺氏固定液 I(无水乙醇：乙酸=3:1)4℃
固定 24 h，用 70%乙醇 4℃保存备用。
采用酸解法制备根尖染色体玻片标本：从 70%乙醇溶液中取出根尖，水洗两次，每次 10 min，加 1N HCl
与 45%醋酸等体积混合液，水浴锅，60℃处理 8~10 min，水洗 1 次(10 min)备用。将根尖分生区组织切下
放在一张干净的载玻片上，滴改良的苯酚卡宝品红染色液，迅速用镊子将已解离的分生区组织铗碎，去除
残渣，盖上盖玻片，用铅笔轻轻敲片，用滤纸吸掉多余的染色液，最后用大拇指压片使细胞平整，染色体
处于同一平面上。
显微观察及染色体数目统计：在显微镜上观察玻片标本，至少选 20 个完整的、染色体形态清晰、分
散的中期细胞进行染色体数目统计。
核型分析：按照李懋学和陈瑞阳(1985)统一标准进行核型分析，具体见林秀琴等(2013a)发表的文章。
3.4 基因组荧光原位杂交(GISH)过程
根尖预处理：同 3.3。
采用酶解法制备根尖染色体玻片标本：取出根尖水洗两次，每次 10 min，切下分生区组织，0.25 N HCl
处理 3~5 min (时间长短取决于分生区组织的大小)，水洗(1 次 10 min)，用 2%纤维素酶和 0.5%离析酶混合
液解离细胞，37℃水浴 40~60 min (时间长短取决于分生区组织的大小)，用水轻轻洗掉酶液(两次, 每次
10min)，灭菌水后低渗 3~4 小时，轻轻吸掉水(以免破坏疏松的分生区组织)，加适量现配的卡诺氏固定液
Ⅰ，将疏松的分生区组织捣碎制备成细胞悬浮液，将细胞悬浮液滴在-20℃预冷的防脱载玻片上，轻轻吹
气，将载玻片放在酒精灯外焰上微烤，室温晾干约 30 min。-20℃冰箱保存备用。
基因组 DNA 探针的制备：采用 CTAB 法提取甘蔗属热带种越南牛蔗(母本)、蔗茅属滇蔗茅云南 95-20
(父本)、甘蔗栽培品种 ROC10 (回交父本)和玉米基因组总 DNA，对 DNA 样品进行纯化、回收和浓度、纯
度检测，于高压灭菌锅处理 DNA 样品 121℃，10 min，获得小片段(300~500 bp)DNA 模板，热带种越南牛
蔗和栽培品种 ROC10 DNA 模板用 Biotin-High Prime 标记，蔗茅属滇蔗茅云南 95-20DNA 模板用 DIG-High
13

Prime 标记，方法和步骤参照德国 Roche 公司产品试剂盒使用说明书。用以封阻同源序列的玉米 DNA 模板
不进行标记。
GISH 实验步骤：用标记的越南牛蔗和云南 95-20 探针以及未标记的玉米封阻 DNA 混合液(玉米封阻
DNA 和探针的浓度比例根据实验需要进行调整)，对 F1 云野 03-316 根尖中期细胞染色体进行原位杂交，
当对 BC1 根尖中期细胞染色体进行原位杂交时，增加了 ROC10 探针；GISH 实验过程参照林秀琴等(2013b)
的方法。经杂交封片之后，在荧光显微镜(德国 Ziess, Axioskop 2 plus)下观察，经 DAPI 复染的染色体呈蓝
色荧光信号，Biotin-High Prime 标记的甘蔗染色体呈黄绿色或绿色荧光信号，DIG-High Prime 标记的野生
种滇蔗茅染色体呈橙红色或橙黄色荧光信号，采用 Metasystem ISIS 和 IKaros 软件进行拍照、图像处理和
核型分析等。
作者贡献
蔡青、林秀琴和陆鑫是本研究的实验设计和实验研究的执行人；刘洪博、字秋艳和李忠磊完成数据分
析；李旭娟、徐超华和李纯佳参与实验设计，试验结果分析；蔡青是项目的构思者和负责人，指导实验设
计，数据分析，论文写作与修改；刘新龙和毛钧参与论文写作和修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家现代农业产业技术体系甘蔗产业技术体系开远综合试验站( CARS-20-6-13)；农业部作
物种质资源保种项目(2016NWB017); 国家农作物种质资源平台(NICGR2016-044)资助。
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