全 文 ： 2012, Vol. 33, No. 05 食品科学 ※基础研究46
一种薏苡抗真菌蛋白的制备及抑菌活性研究
李 晨，白承之，李玉英，王转花*
(化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西大学生物技术研究所，山西 太原 030006)
摘 要：以薏苡(Coix chinensis)种子为实验材料，通过脱脂、水提、Resource S阳离子交换层析和 Superdex 75凝胶
排阻层析等步骤纯化得到一种新的抗真菌蛋白，并对其抑菌活性进行初步鉴定。SDS-PAGE分析显示该蛋白的分子
质量约为 28kD。抑菌活性鉴定表明，该蛋白对链格孢霉(Alternaria alternate)、绿色木霉(Trichoderma reesei)和白
腐菌(Panus conchatus) 3株丝状真菌具有显著的生长抑制活性，并呈现出剂量依赖的特征。本研究建立分离薏苡 28kD
抗真菌蛋白的方法，制备方法简单易行，所得产品纯度达到 95 % 以上。
关键词：薏苡种子；抗真菌蛋白；纯化
Isolation and Antifungal Properties of a New Protein from Adlay Seeds (Coix chinensis)
LI Chen，BAI Cheng-zhi，LI Yu-ying，WANG Zhuan-hua*
(Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering, Ministry Education, Institute of Biotechnology,
Shanxi University, Taiyuan 030006, China)
Abstract：A protein from adlay (Coix chinensis) seeds was isolated by degrease with acetone and ether, extraction with 20 mmol/L
Tris-HCl buffer, ion exchange chromatography on Resource S column and size exclusion chromatography on Superdex 75
column. The purity was higher than 95%. Partial characterization and antifungal activity were assayed. The protein exhibited a
molecule mass of 28 kD in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. This protein could exert potent inhibi-
tory activity toward fungal species including Alternaria alternate, Trichoderma reesei and Panus conchatus in a dose-dependent
pattern. Antifungal protein has become a popular research topic because of their resistance to pathogenic diseases. In this paper,
the studies have demonstrated that adlay seeds have potentially exploitable significance and explored an effective method for the
isolation and purification of antifungal proteins from plant seeds.
Key words：adlay seeds；antifungal protein；purification
中图分类号：Q516 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2012)05-0046-03
收稿日期：2011-08-17
基金项目：国家自然科学基金面上项目(30970611；31171659)；山西省科技攻关计划项目(20100321101)
作者简介：李晨(1981—)，女，博士研究生，研究方向为生物活性物质。E-mail：lichen@sxu.edu.cn
*通信作者：王转花(1956—)，女，教授，博士，研究方向为植物基因工程与蛋白质工程。E-mail：zhwang@sxu.edu.cn
植物种子中普遍含有一种或几种抗真菌蛋白
(antifungal proteins，AFPs)，这类蛋白赋予植物种子或
植株抵抗真菌侵蚀的能力。天然植物 AFPs具有来源广
泛，抗菌谱广，无污染等特点，成为研究的热点之一。
随着研究的深入，发现有些AFPs还可以抑制HIV-1反
转录酶[1-3]。近年来，陆续有多种植物来源的AFPs被纯
化和鉴定[4]，这些蛋白的分子质量大小不同，从几千到
60kD不等。2005年，巴西科学家在高粱种子中纯化并
鉴定了一种分子量为 30kD的抗真菌蛋白[5]。国内学者先
后从花生[6]、黑豆[7]、红扁豆[8]中纯化得到抗真菌蛋白并
对它们的抑菌活性进行了鉴定。
薏苡为禾本科一年生或多年生草本植物，去除外壳
和种皮的种仁可入药，《本草纲目》中提及薏苡种子
“健脾益胃、补肺清热、祛风胜温、强筋骨”。薏
苡种子富含脂肪、多种氨基酸、大量的 V B 1、V B 2 以
及钙、磷、镁、钾等生物活性成分，是非常有价值
的药食同源食品[ 9]。薏苡在我国大部分地区均有种植，
国家对薏苡种子的开发利用也很重视。最近，研究者
从薏苡麸皮中提取出几种可以抑制乳腺癌细胞的小分子
活性物质[10]。2008年，刘静等[11]以薏苡蛋白为实验材
料筛选其中的抗菌成分，获得一种分子质量约 38kD的
抗真菌蛋白。一种植物中可能含有多种 AFPs [12]，有关
薏苡中新的抗菌蛋白及其详细的抑菌活性有待深入研
究。本实验以薏苡种子为材料提取其总蛋白，通过两
47※基础研究 食品科学 2012, Vol. 33, No. 05
步层析分离，纯化得到一种抗真菌蛋白，并对该蛋白
的分子质量和抑菌活性进行研究，为深入开展制备植物
种子来源的抗真菌蛋白提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 菌种、材料与仪器
链格孢霉(Alternaria alternata)、白腐菌(Panus
conchatus)、绿色木霉(Trichoderma reesei)由山西大学
生命科学学院提供；实验所用试剂均为分析纯。
薏苡种子购自当地市场。
Resource S离子交换层析柱、Superdex 75 10/300 GL
层析柱 美国GE Healthcare公司。
1.2 方法
1.2.1 薏苡种子抗真菌蛋白的纯化
薏苡种子经过低温干燥后粉碎，过 0.2mm孔径筛
网，以 3:1(V/m)的比例加入丙酮，4℃搅拌脱脂 3h后减
压抽滤，向所得滤饼中加入乙醚，低温搅拌 3h，减压
抽滤，滤饼低温干燥后即为薏苡种子脱脂粉。取薏苡
种子脱脂粉 20g，加入 200mL浸提缓冲液(20mmol/L Tris-
HCl，pH8.0)，4℃搅拌浸提 6h，12000× g离心，取
上清，加入硫酸铵至80%饱和度，搅拌提取6h，12000×g
离心，沉淀用少量浸提缓冲液溶解后透析，所得蛋白
溶液为薏苡种子水溶性总蛋白。
将上述水溶性总蛋白用平衡缓冲液充分透析平衡
后，上样于 Resource S阳离子交换柱进行分离。平衡
缓冲液为 20mmol/L NH4OAc，pH4.5，洗脱缓冲液为
20mmol NH4OAc，1mol/L、pH4.5的NaCl溶液，控制
流速为 0.5mL/min，用 0.1、0.2、1mol/L的 NaCl洗脱
缓冲液进行不连续梯度洗脱，收集各洗脱峰，并进行
抗真菌活性的分析。
将具有抑菌活性的洗脱组分上样于 Superdex 75
10/300 GL凝胶层析柱进一步分离，缓冲液为 20mmol/L
Tris-HCl，内含 150mmol/L NaCl，pH8.0，控制流速为
0.5mL/min。收集各洗脱峰，进行抗真菌活性的筛选。
1.2.2 SDS-PAGE测定分子质量
采用 SDS-PAGE法[13]测定，以标准分子质量蛋白为
对照，4 %浓缩胶，1 2 . 5 %分离胶。
1.2.3 真菌生长抑制活性测定
采用牛津杯法[14]测定各层析组分的真菌生长抑制活
性，受检真菌为链格孢霉(Alternaria alternate)、绿色
木霉(Trichoderma reesei)和白腐菌(Panus conchatus)。将
供试菌株点植于 PDA培养基中心，于 28℃培养至菌落
直径达到 1～2cm，在距离菌落边缘 1cm处放置灭菌的牛
津杯，各取 200μL样品组(含目的蛋白)和对照组(不含目
的蛋白，其他条件完全相同的缓冲液)，用 0.22μm微
孔滤膜过滤除菌后加入牛津杯内，4℃预扩散 24h，28℃
继续培养 7 2 h，观察菌落生长状况。
2 结果与分析
2.1 薏苡种子抗真菌蛋白的纯化结果
薏苡种子水溶性总蛋白经 Resource S阳离子交换柱
分离，得到 6个蛋白洗脱峰(图 1)。经检测，峰Ⅲ具有
抗真菌活性，将峰Ⅲ上样于 Superdex 75 10/300 GL层析
柱进一步分离，得到两个洗脱峰(图 2)，经测定，峰Ⅰ
具有抗真菌活性。
2.2 抗真菌蛋白分子质量测定
97.4kD
66.2kD
43kD
31kD
20.1kD
14.4kD
Marker 1 2
Marker.分子质量标准品；1.薏苡种子水溶性
总蛋白；2 .薏苡种子 2 8 k D 抗真菌蛋白。
图 3 薏苡种子抗真菌蛋白的 SDS-PAGE分析
Fig.3 SDS-PAGE of purified antifungal protein from adlay seeds
图 1 薏苡种子抗真菌蛋白的 Resource S阳离子交换层析
Fig.1 Cation exchange Resource S cation exchange column chromatog-
raphy for the protein from adlay seeds
30
20
10
0
Ⅰm
A
U
洗脱体积 /mL
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
Ⅴ
Ⅵ
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
N
aC
l浓
度
/(m
ol/L
)
8
6
4
2
0
－2
m
A
U
洗脱体积 /mL
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Ⅰ
Ⅱ
图 2 阳离子交换层析活性洗脱峰Ⅲ的 Superdex 75凝胶排阻层析
Fig.2 Size exclusion chromatographic of fraction III obtained in
Resource S cation exchange column fraction on Superdex Peptide HR
10/300 column
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采用 SDS-PAGE法测定薏苡种子抗真菌蛋白的分子
质量，以标准蛋白的相对迁移率和分子质量的对数做标
准曲线，根据目的蛋白的相对迁移率，得出其分子质
量约为 28kD。电泳结果(图 3)显示，与薏苡种子水溶性
总蛋白(泳道 1 )相比，目的蛋白(泳道 2 )得到了高度纯
化，其表观纯度大于 9 5 %。
2.3 真菌生长抑制活性检测
由图 4 可知，目的蛋白可明显抑制供试霉菌的生
长。由于抗真菌蛋白的抑制作用，两株主要依靠菌丝
延伸增殖的霉菌，链格孢霉和白腐菌(图 4A、C )，在
菌落边缘形成类似弦月的抑制形态(图 4A-1和图 4C-2)。
绿色木霉(图 4B)依靠孢子增殖，菌丝可以绕过抗真菌蛋
白的抑制区继续扩散，抑制区的菌落形成了一个类似抑
菌圈的抑制形态(图 4B)，随着用样量的增大，呈现出明
显的剂量依赖效应，而在相同条件下，对照组(图 4B-0)
菌丝扩散没有受到影响，菌落边缘呈现规则的圆形。
3 结 论
本实验通过Resource S阳离子交换层析和Superdex 75
凝胶排阻层析，从薏苡种子中纯化出一种可以抑制链格
孢霉(Alternar ia al ternate)、绿色木霉(Trichoderma
reesei)和白腐菌(Panus conchatus)生长的抗真菌蛋白。
目前，由于抗生素的大量使用，耐药菌株和多重
耐药菌株不断增加，使抗感染治疗成为难题。随着社
会的进步，多种添加剂因为不符合新的安全要求而被停
止使用。植物种子来源的抗真菌蛋白因来源广泛，抗
菌谱广，不易产生抗药性，无毒副作用[ 1 5 ]等特点，在
新型药物开发、食品添加剂、化妆品和保健食品等方
面有广阔的开发前景[ 1 6 ]。本实验以薏苡种子为研究对
象，获得了一种新的薏苡 28kD抗真菌蛋白，对 3株常
见的农业致病真菌有显著的生长抑制作用。该蛋白的结
构特征以及是否具有抗肿瘤作用正在进一步研究中。本
研究建立的薏苡抗真菌蛋白提取技术简单，目的蛋白纯
度较高，为进一步研究其抗病机理及植物原添加剂应用
于农作物保护和食品工业领域奠定基础。
参 考 文 献 ：
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0
0 1
A B
1
2
3
0
5
4
C
20
1
A.链格孢霉(Alternaria alternate)，0.对照组，1.样品用量 2.82
μg；B.绿色木霉(Trichoderma reesei)，0.对照组，1～5.样品
用量分别为 2.82、1.41、0.71、0.36、0.18μg；C.白腐菌(Panus
conchatus)，0.对照组，1～2.样品用量分别为 1.41、2.82μg。
图 4 薏苡种子抗真菌蛋白对 3 株真菌生长抑制的剂量依赖性实验
Fig.4 Effect of P antifungal protein aging
. .