全 文 ：·药材与资源 ·
薏苡 SRAP反应体系的优化
俞旭平1 ,李钧敏2＊ ,金则新2
(1.浙江省中药研究所 , 浙江 杭州　310023;2.台州学院生态研究所 ,浙江 临海　317000)
摘　要:目的　建立稳定可靠的 S RAP 分子标记反应体系 , 为进一步研究薏苡种质资源的分子鉴定提供依据。方
法　采用改进的 SDS 法提取薏苡种子胚基因组 DNA , 并采用单因素试验分析 M g2+浓度 、dNTP 浓度 、BSA 浓度 、
模板 DNA 用量 、引物浓度 、Taq DNA 聚合酶用量等 6 个因素对薏苡相关序列扩增多态性(SRAP)扩增结果的影
响。结果　建立了薏苡最适的 S RAP 反应体系:10 μL PCR 反应体系中 , 含 1 ×Taq 酶配套缓冲液(10 mmol/ L
T ris· HCl , pH 9.0 , 50 mmol/ L KCl , 0.1%T riton X-100), 1.5 mmo l/ L Mg 2+ , 0.15 mmo l/ L dNTP , 10 ng 模板
DNA , 10 pmo l引物 , 0.5 U Taq 酶。结论　所建立的薏苡 SRAP 反应体系具有标记位点清晰 、反应系统稳定等特
点 ,为薏苡种质资源的分子鉴定提供了良好的基础。
关键词:薏苡;SRAP;反应体系;优化
　　DNA 分子标记技术是针对生物的遗传物质进
行的 ,其结果不受外界环境条件 、样品形态和材料来
源的影响 ,可以为中药材鉴定提供更加准确可靠的
手段[ 1] 。相关序列扩增多态性(sequence-related
amplif ied polymorphism ,SRA P)是一种新型的分子
标记系统[ 2] , 又称为基于序列扩增多态性(se-
quence-based amplified polymorphism , SBAP)[ 3] 。
该标记通过独特的双引物设计对基因的开放阅读框
架(ORFs)的特定区域进行扩增 , 上游引物长 17
bp ,对外显子区域进行特异扩增;下游引物长 18
bp ,对内含子区域 、启动子区域进行特异扩增[ 2] 。
因不同个体以及物种的内含子 、启动子与间隔区长
度不同而产生多态性 。SRAP 技术具有简便 、高效 、
产率高 、高共显性 、重复性好 、易测序 、便于克隆目标
片段的特点[ 4 , 5] 。目前已在一些农作物如马铃薯 、
水稻 、油菜等中成功扩增[ 2] ,并已被应用于遗传多样
性分析 、遗传图谱的构建 、重要性状的标记以及相关
基因的克隆等方面[ 6 ～ 8] 。
薏苡 Coix lacryma-jobi L.[ 9] ,别名薏苡仁 ,薏
仁米等 ,原产中国 ,在中国有7 000年以上的栽培驯
化史 。薏苡为禾本科薏苡属一年生或多年生草本植
物 ,是一种高产谷类药粮兼用作物 ,全国各地均有栽
培 ,种质资源极为丰富。种仁可入药 ,并可作为天然
保健食品[ 10] 。本实验以采用改进 SDS 法提取了薏
苡胚基因组 DNA , 并以薏苡胚基因组 DNA 为模
板 ,探讨 SRA P 扩增反应体系中 6种因素对扩增的
影响 ,以期获得薏苡 SRAP 反应的最佳体系 ,为薏
苡种质资源的研究奠定基础 。
1　材料和方法
1.1　材料:供试材料薏苡种子为栽培品种 ,产自浙江
省缙云县新碧镇 ,经浙江省中药研究所王志安高级工
程师鉴定为禾本科植物薏苡 Coix lacryma-jobi L。
1.2　薏苡胚基因组 DNA 的提取:取 10 粒薏苡种
子 ,浸泡 24 h ,取出胚 ,混合 ,采用改进的 SDS 法[ 11]
对薏苡胚基因组 DNA 进行提取 ,其中裂解温度为
55 ℃。DNA 经 0.8%琼脂糖凝胶电泳 ,用 GIS 凝
胶成像分析系统(上海天能科技服务公司)拍照定
量 ,稀释到 20 ng/μL , -20 ℃保存备用 。
1.3　SRAP 扩增体系的优化实验设计:引物序列参
照文献[ 2 ,12] ,共设计 8个正向引物和 11个反向引
物 ,由上海生工生物工程有限公司合成 ,SRAP 引物
序列如表 1所示。
表 1　SRAP 引物序列
Table 1　Sequences of SRAP primers
正向引物(5′-3′) 反向引物(5′-3′)
me-1:TGAG TCCAAACCGGATA- em1:-GACTGCG TACGAA TTAA T-
me-2:TGAGTCCAAACCGGAGC- em2:-GACTGCG TACGAA TTTGC-
me-3:TGAG TCCAAACCGGAA T- em3:-GACTGCG TA CGAA TTGAC-
me-4:TGAGTCCAAA CCGGA CC- em4:-TG AGTCCAAACCGGAGA-
me-5:TGAG TCCAAACCGGAAG- em5:-GACTGCG TACGAA TTAA C-
me-6:TGAG TCCAAACCGGTAA- em6:-GACTGCG TA CGAA TTGCA-
me-7:TGAG TCCAAACCGG TCC- em7:-GACTGCG TACGAA TTCAA-
me-8:TGAGTCCAAA CCGG TGC- em8:-GACTG CGTACGAATTCTC-
em9:-GACTGCG TA CGAA TTCGA-
em10:-GA CTGCG TACGAA TTCAG-
em11:-GACTGCG TA CGAA TTCCA-
·243·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 40 卷增刊 2009 年
＊ 收稿日期:2009-05-12　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　基金项目:“十五”国家科技攻关计划“中医药疗效及安全性基本问题研究”项目(2004BA721A21)作者简介:俞旭平 ,男 ,高级工程师 ,从事药用植物资源学研究。 　E-mail:imlaohoo@yahoo.com.cn＊通讯作者　李钧敏　E-mai l:lijm@tzc.edu.cn
　　SRAP 扩增条件为 10 μL PCR反应体积包括:
1×Taq 酶配套缓冲液(10 mmol/L Tris · HCl ,
pH9.0 ,50 mmol/L KC l , 0.1%Triton X-100), 1.5
mmo l/L M gCl2 ,0.2 mmol/L 4×dNTP ,10 ng 模板
DNA ,6 pmol引物(上海 Sangon公司),0.5 U Taq
酶(上海华美公司)。
SRAP 扩增反应程序参照文献[ 2 , 12] ,并结合
to uch-down程序改进:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变
性 1 min ,42 ℃退火 1 min(每个循环下降 1 ℃), 72
℃延伸 1 m in ,共 10个循环;94 ℃变性 1 min ,50 ℃
退火 1 min;72 ℃延伸 1 min ,共 25个循环;最后 72
℃延伸 5 m in。
采用单因素试验进行 SRAP-PCR扩增反应体
系的优化 ,共试验了 6个因素各 4个水平(见表 2),
其余条件同上 。所有扩增反应在 PTC —220 PCR
仪(美国 , Bio-rad公司)上完成。扩增产物在 1.6%
的琼脂糖凝胶进行电泳 ,用λDNA/EcoR Ⅰ +Hind
Ⅲ做分子标准量参照物 ,扩增结果用 GIS 凝胶成像
分析系统(上海天能科技服务公司)拍照保存 。
表 2　SRAP-PCR体系优化的因素与水平
Table 2　Factors and levels used in optimization
of SRAP-PCR reaction system
水平
Mg2+浓度/
(mmol· L-1)
dNTP浓度
(mmol ·L -1)
BSA浓度/
(mg ·mL-1)
模板 DNA
量/ ng
引物用量/
pmol
Taq酶用
量/ U
1 1.50 0.15 1 5 2 0.5
2 1.75 0.20 2 10 6 1.0
3 2.00 0.25 3 15 10 1.5
4 2.25 0.30 4 20 14 2.0
2　结果与分析
2.1　薏苡胚基因组 DNA 的提取:DNA 的提取质
量是决定能进一步进行分子生物学操作的关键。本
实验采用改进的 SDS法对薏苡种子胚基因组 DNA
进行直接提取 ,结果见图 1 。由图可知 ,所得胚基因
组 DNA 比较纯净 ,相对分子质量均大于 23 kb ,可
用于后续的分子生物学操作。
2.2　SRAP 扩增体系的优化
2.2.1　模板 DNA 用量对 SRAP 扩增的影响:模板
DNA 用量对 SRAP 扩增结果的影响见图 2 。由图
可知 ,较低的模板 DNA 用量反而可扩增出较多的
条带 ,而当模板 DNA 量增加至 15 ng 和 20 ng 时 ,
扩增条带减少。模板 DNA 量大意味着用于扩增的
模板多 ,可以增大扩增产物的量 ,但同时模板 DNA
中所带的杂质量也增高 ,因此 ,过多的模板 DNA 会
导致扩增效果降低。因此 ,本实验采用的模板 DNA
用量为 10 ng 。
M-λDNA/ EcoR Ⅰ +H indⅢ 相对分子质量标准参照物　1 ～ 11-
部分薏苡种子胚提取 DNA
M-λDNA/ EcoR Ⅰ + Hind Ⅲ relat ive molecular reference sub-
stance　1—11-some ext racted DNA from C. lacr yma-jobi seed
图 1　薏苡种子胚基因组 DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig.1　Agarose gel electrophortogram of genomic DNA
extracted from embryo of C. lacryma-jobi seed
2.2.2　Mg2+浓度对 SRAP 扩增的影响:Mg2+是
Taq酶的激活剂 ,反应混合物中 Mg2+浓度对 PCR
反应的特异性和扩增效率均有影响 。Mg2+不足 , Taq
酶作用效率低 ,dNTP 同样要竞争 Mg2+ ,因此反应体
系中 Mg2+浓度非常重要[ 22] 。不同 Mg2+浓度对
SRAP 的扩增结果如图 2 所示。由图 2 可见随着
Mg
2+浓度的增加 ,扩增产物差异不大 ,但比起其他浓
度 ,浓度为1.5 mmol/L时扩增产物的条带最亮也最
清晰 ,因此 ,Mg2+的适宜浓度为 1.5 mmol/L。
2.2.3　dN TP 浓度对 SRA P 扩增的影响:dN TP 浓
度的变化对 SRAP 带的数量和强弱有一定的影响
(图 2)。当 dN TP 浓度为 0.15 mmol/ L 和 0.2
mmol/L 时 ,条带数目较多 ,清晰度较高;当 dNTP
浓度增加到 0.25 mmol/L 和 0.3 mmol/L 时 ,相对
分子质量小的条带缺失。同时考虑到经济原因 ,因
此 ,本实验采用的 dNTP 浓度为 0.15 mmol/ L。
2.2.4　BSA 浓度对 SRAP 扩增的影响:BSA 对薏
苡 SRA P扩增有一定的影响(图 2)。当 BSA 质量
浓度从 1 mg/mL 增加至 3 mg/mL 时 ,SRAP 扩增
条带亮度增加 ,但 BSA 质量浓度为 3 mg/mL 时与
0 mg/mL 时没有明显的差异 ,且相对分子质量小的
条带的清晰度略差 。因此 ,本实验不添加 BSA 。
2.2.5　引物用量对 SRAP 扩增的影响:引物浓度
的变化对 SRAP 扩增条带的影响较大(图 2)。随着
引物浓度的增加 , SRAP 扩增条带数量增加 ,清晰度
也增加。当引物浓度分别为 10 pmo l时 ,亮度最高 ,
条带最多 ,效果最好;但当浓度增加为 14 pmo l时 ,
条带亮度开始变弱 。因此 ,本实验采用的引物浓度
·244· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs　第 40 卷增刊 2009 年
分别为 10 pmol。
2.2.6　Taq 酶用量对 SRAP 扩增的影响:Taq 酶单
位的变化对 SRAP扩增产物的影响见图2。Taq 酶用
量为 0.5 U时 ,条带亮度最大 ,而当 Taq 酶用量增加
至 1 U时 ,条带亮度变弱 ,且部分条带出现缺失。因
此 ,从经济角度考虑 ,本实验采用 0.5 U的 Taq酶。
M-λDNA/ EcoR Ⅰ +H ind Ⅲ 相对分子质量标准参照物　1～ 4-DNA 用量为 5 、10 、15 、20 ng　5 ～ 8-Mg2+浓度分别为 1.5 、1.75 、2.0 、
2.25 mmol/ L　9～ 12-dNTP 浓度分别为 0.15 、0.2 、0.25 、0.3 mm ol/ L　13 ～ 16-BSA 浓度分别为 0 、1 、2 、3 m g/mL 　17 ～ 20-引物
(me1/ em8)用量分别为 2 、6 、10 、14 pmol　21～ 24-Taq酶用量分别为 0.5 、1 、1.5 、2 U
M-λDNA/ E coR Ⅰ +H indⅢ relat ive moleculaur reference subs tance　1～ 4-5 、10 、15 、20 ng template DNA　5～ 8-1.5 、1.75 、2.0 、
2.25 mmol/ L Mg2+　9～ 12-0.15 、0.2 、0.25 、0.3 mmol/ L dNTP　13～ 16-0 、1 、2 、3 mg/mL BSA　17～ 20-2 、6 、10 、14 pmol primer
(me1/ em8)　21～ 24-0.5 、1 、1.5 、2 U Taq polym erase
图 2　不同条件对薏苡 SRAP扩增的影响
Fig.2　Effect of various conditions on SRAP amplification of C. lacryma-jobi
3　讨论
实验通过单因素试验的方法 ,对 Mg2+浓度 ,
dN TP 浓度 ,BSA 质量浓度 ,模板 DNA 的量 ,引物
用量 , Taq DNA 聚合酶量等 6种因素对反应结果的
影响 ,经过优化实验 ,建立了薏苡的 SRAP-PCR最
佳反应体系:10 μL PCR反应体系中 ,含 1×Taq酶
配套缓冲液(10 mmo l/L Tris · HCl , pH9.0 , 50
mmo l/L KCl , 0.1%T ri ton X-100), 1.5 mmol/ L
Mg 2+ ,0.15 mmol/ L dNTP , 10 ng 模板 DNA , 10
pmol引物 , 0.5 U Taq酶 。以此反应条件 ,共筛选
出 11对 SRAP 引物:me1 ～ em2 ,me1 ～ em8 ,me1 ～
em11 , me2 ～ em5 , me2 ～ em8 , me3 ～ em1 , me3 ～
em3 , me5 ～ em1 , me6 ～ em7 , me8 ～ em5 , me8 ～
em6。此方法可用于不同产地薏苡种质资源的鉴定。
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