全 文 ：中国生物工程杂志 China Biotechnology，2012，32(8) :30-35
金发草 LEA3 基因两个剪接体转化酿酒酵母
的抗非生物胁迫功能分析
李 锐1 王文国2 范林洪1 王胜华1*
(1 四川大学生命科学学院 生物资源与生态环境教育部重点实验室 成都 610064)
(2 农业部沼气科学研究所 生物质能技术研究中心 成都 610041)
摘要 对金发草(Pogonatherum paniceum)第 3 组 LEA蛋白(PpLEA3)基因两个剪接体进行分析，
并利用酿酒酵母表达系统分析两个剪接体在不同非生物胁迫的响应差异。以 PpLEA3 基因两个
剪接体(PpLEA3． a 和 PpLEA3． b)的重组载体 pMD19-T-PpLEA3． a 和 pMD19-T-PpLEA3． b 为模板，
PCR法构建酵母表达载体 pYES2-PpLEA3． a 和 pYES2-PpLEA3． b，并转化酿酒酵母细胞得到重组
菌 INV-PpLEA3． a 和 INV-PpLEA3． b。通过比较重组菌和对照菌(转空载体 pYES2)在 NaCl、
NaHCO3、低温、干旱、UV胁迫下的恢复生长状况，结果表明两种重组菌胁迫后的生长情况明显好
于对照菌，两个剪接体对非生物胁迫抵抗力的大小为:PpLEA3． a ＞ PpLEA3． b。两个剪接体在核
酸序列上的差异导致了在蛋白亲水性和结构上的差异，最终导致了在抗逆能力方面的差异。
关键词 LEA3 基因 金发草 可变剪接 转基因酵母 非生物胁迫
中图分类号 Q819
收稿日期:2012-03-13 修回日期:2012-04-25
* 通讯作者，电子信箱:shwang200@ yahoo． com． cn
真核生物的可变剪接可以使一个基因产生多种
mRNA转录本，翻译为多种多肽序列，这一过程会使蛋
白质的多样性大大增加［1］。与此同时，由于可变剪接
会导致肽链氨基酸的增加或减少，在空间结构上会引
起一定的变化，从而使其功能产生一定的变化，这为研
究蛋白质结构与其功能之间的关系提供了一条可选择
的途径。由于可变剪接与人类的癌症等疾病有关，目
前对于可变剪接的研究主要集中在人类和其他动物方
面［2-3］，对于植物方面的研究相对较少［4］。
LEA 蛋白是植物中较为重要的一类抗逆蛋白，已
经在多种植物中被发现，并对其结构和功能作了进一
步的研究。尤其是对第三组 LEA 蛋白，该蛋白在植物
耐受干旱胁迫、冷胁迫、盐胁迫等方面发挥重要作用，
并且在代谢中也起分子伴侣和亲水性溶质的作用［5-8］。
但其具体的作用机制大多限于推测，而实验证明较
少［9-10］。
酿酒酵母作为一种成熟的真核表达系统，酵母细
胞功能鉴定法被认为是鉴定单一外源基因耐逆功能的
良好体系，被广泛地应用到复杂基因功能研究中［11］。
本课题组已经获得了金发草 LEA3 基因的两个剪接体，
该基因的第二个内含子可以保留形成可变剪接［12］。本
研究将金发草 LEA3 基因两个剪接体连接到酵母表达
载体上，并转化酿酒酵母菌株 INVSC1，检测酵母重组
子在非生物胁迫下的存活率，通过酿酒酵母表达系统
鉴定这些差异在细胞内产生的耐受性的差异，以期深
入了解金发草 LEA3 基因的功能及导致基因功能变化
的原因，为进一步研究金发草 LEA3 基因异构体剪接异
构的生物学意义奠定了基础。
1 材料与方法
1． 1 菌株与试剂
大肠杆菌(Escherichia coli)Top10、酿酒酵母
Saccharomyces cerevisiae strain INVSC1(genotype，MATa-а
his3Δ1 leu2 trp1-289，ura3-52，Invitrogen)和穿梭表达载
体 pYES2． 0(Invitrogen公司)由本实验室保存。PCR引
物合成和基因测序均由北京六合华大基因有限公司完
成。限制性内切酶和 T4DNA 连接酶购自大连宝生物
工程公司。酵母提取物与胰蛋白胨购自 OXOID 公司。
DOI：10.13523/j.cb.20120806
2012，32(8) 李 锐 等:金发草 LEA3 基因两个剪接体转化酿酒酵母的抗非生物胁迫功能分析
SD-URA培养基购自 Sigma公司，其它试剂均为国产分
析纯。酿酒酵母感受态细胞的制备及转化按照 Zymo
Research生物科技公司的操作手册进行。
1． 2 方 法
1． 2． 1 金发草 LEA3 基因两个剪接体的亲水性与蛋白
质三级结构预测分析 根据 PpLEA3 基因的两个剪接
体 PpLEA3． a(Genbank ID GU947647)和 PpLEA3． b
(Genbank ID GU947649)的核酸序列利用在线软件
ProtParam (http:/ /www． expasy． ch / tools / protparam．
html)进行亲水性分析。并利用在线软件 HHPRED
(http:/ / toolkit． tuebingen． mpg． de /hhpred)分析蛋白质
的三级结构。
1． 2． 2 酵母表达载体 pYES2-LEA3． a 和 pYES2-LEA3． b
的构建 根据 PpLEA3 基因的两个剪接体 PpLEA3． a 和
PpLEA3． b 的 序 列 设 计 引 物 LEA-F: 5-
CGCGGATCCATGGCCTCCCACCAGGACAAG-3和 LEA-
R:5-CCGCTCGAGCTAGTGATCCCCGGTGATGGT-3(划
线部分分别为 BamH I 和 Xho I 的酶切位点) ，用引物
LEA-F和 LEA-R分别扩增本实验室构建并保存的两个
剪接体的重组质粒，用 BamH I 和 Xho I 内切酶对 PCR
产物和 pYES2 载体进行酶切，胶回收后，用 T4 连接酶
在 16℃连接过夜，将连接产物转入 E． coli TOP10，从而
得到 pYES2-LEA3． a 和 pYES2-LEA3． b 酵母表达载体，
利用双酶切和 PCR验证是否目的基因插入到酵母表达
载体 pYES2，最后测序验证重组质粒的正确性。
1． 2． 3 酿酒酵母的转化及鉴定 用醋酸锂法，分别将
穿梭载体 pYES2、重组载体 pYES2-PpLEA3． a 和
pYES2-PpLEA3． b 转化酿酒酵母 INVSC1，分别命名为
对照菌 INV(wt)、重组菌 INV-PpLEA3． a(ta)和重组菌
INV-PpLEA3． b(tb)。利用尿嘧啶营养缺陷型培养基
(SD-URA)筛选出重组子，提取酵母基因组 DNA，用引
物 LEA-F和 LEA-R，PCR 检测该基因是否整合到酵母
基因组中。
1． 2． 4 转基因酵母的对非生物胁迫的耐受性分析
在无菌条件下，分别挑取已鉴定过的转化子 wt、ta 和 tb
单菌落，分别接种于 SD-URA 液体培养基中，在 30℃，
200r /min振荡培养 24h，测定其 OD600的值。计算所需
菌液量，使 20ml诱导培养基中菌液的 OD600值为 0． 4，
在 30℃诱导表达 30h。再次测定 wt、ta 和 tb 的 OD600
值，用诱导培养基稀释成相同的浓度(OD2． 0) ，采用不
同的非生物胁迫进行处理，涂布于 SD-URA 固体平板
上 30℃温育 48h，然后对比 wt、ta 和 tb 的存活率，统计
克隆数，照相并记录结果［13］。
(1)转基因酵母的耐盐性分析:取 1ml 诱导的酵母
菌液，离心 30s，弃上清，菌体分别重悬于 1ml的5mol /L
NaCl，置于 4℃胁迫处理 24h，稀释 1000 倍，取 50μl 涂
布于 SD-URA固体平板上，用正常培养的 wt、ta和 tb的
酵母作为对照，30℃下温育培养，直到长出单菌落进行
拍照记录结果。
(2)转基因酵母的耐碱性分析:取 1ml 诱导的酵母
菌液，离心 30s，弃上清，菌体分别重悬于 1ml 的 10%
NaHCO3，置于 30℃，200r /min振荡培养 24h，稀释 1000
倍，取 50μl涂布于 SD-URA固体平板上，用正常培养的
wt、ta和 tb的酵母作为对照，30℃下温育培养，直到长
出单菌落进行拍照记录结果。
(3)转基因酵母对冷冻胁迫忍耐分析:将诱导过的
酵母细胞置于离心管孵育在无水乙醇中置于 － 20℃下
处理 48h后，稀释 1000 倍，取 50μl 涂布于 SD-URA 固
体平板上，用正常培养的 wt、ta 和 tb 的酵母作为对照，
30℃下温育培养直到长出单菌落进行拍照记录结果。
(4)转基因酵母的干旱忍耐分析:真空处理诱导过
的酵母细胞，温育在 8mol /L 山梨醇溶液中在 4℃放置
24h，稀释 1000 倍，取 50μl 涂布于 SD-URA 固体平板
上，用正常培养的 wt、ta 和 tb 的酵母作为对照，30℃温
育 48h，然后对比 wt、ta 和 tb 的存活率，照相并记录
结果。
(5)转基因酵母对紫外照射胁迫忍耐分析:将诱导
过的酵母细胞稀释 1000 倍，取 50μl涂布于 SD-URA固
体平板上，用紫外进行照射(100μJ /cm2)1． 5 min，用正
常培养的 wt、ta 和 tb 的酵母作为对照，30℃下温育培
养，直到长出单菌落进行拍照记录结果。
2 结 果
2． 1 金发草 LEA3 基因两个剪接体的序列特点和蛋白
质特征比较分析
LEA3． a是金发草 LEA3 基因的主要剪接体，ORF
长度为 552bp，LEA3． b 长度为 651bp，在结构上保留了
金发草 LEA3 基因的第二个内含子(图 1)。LEA3 蛋白
是一种亲水性蛋白，它包含的大多数氨基酸残基为碱
性、亲水性，在植物细胞脱水时它可以重新定向细胞内
水分子，束缚盐离子，从而避免细胞损伤和组织过度失
水［14］。亲水性的改变可能会影响蛋白质的功能。本研
究通过 ProtParam 软件对两个剪接体的亲水性进行了
预测，结果显示剪接体 PpLEA3． a 和 PpLEA3． b 的亲水
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中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol． 32 No． 8 2012
指数分别为 － 1． 254 和 － 0． 977，依据氨基酸分值越低
亲水性越强和分值越高疏水性越强的规律，可知剪接
体 PpLEA3． a亲水能力大于 PpLEA3． b。
不同组别的 LEA 蛋白质序列有着不同的保守基序
(motif) ，多拷贝的 11-氨基酸序列(TAQAAKEKAGE)是
第三组 LEA3 蛋白的特征区域，也是主要的功能区
域［5，15］。LEA3 基因的两个剪接体预测蛋白序列均含
有 7 个完整的 11-氨基酸的重复单元和 2 个不完整的重
复单元，数量上处于禾本科植物的中间水平，高于高粱
的 4 个，少于大麦的 11 个［5］。从预测蛋白的三级结构
来看，两个蛋白都在 N端形成卷曲状结构，在 C 端以线
状结构为主。从两个蛋白的对比来看，PpLEA3． a 要比
PpLEA3． b紧凑(图 2)。
2． 2 酵母表达载体 pYES2-LEA3． a 和 pYES2-LEA
3． b的构建
用引物 LEA-F 和 LEA-R 分别以本实验室保存的
两个剪接体的重组质粒为模板将两个剪接体的 ORF 片
段扩增出来，回收后用 BamH I 和 Xho I双酶切后，回收
双酶切产物，与经同样双酶切的载体 pYES2 进行体外
连接，连接产物转化 E． coli TOP10，在氨苄青霉素的 LB
平板上筛选阳性重组子 pYES2-PpLEA3． a 和 pYES2-
PpLEA3． b。PCR 和双酶切鉴定结果如图 3 所示，插入
的 PpLEA3． a目的片段和 PpLEA3． b目的片段与预期相
一致，说明表达载体构建成功。
图 1 PpLEA3 基因剪接体的基因组结构示意图
Fig． 1 Structure schematic of PpLEA3
gene spliced isoforms
The exons are shown black-shaded boxes
and the intron is shown in line
2． 3 酵母转化及鉴定
分别将穿梭载体 pYES2(阴性对照)、重组质粒
pYES2-PpLEA3． a 和 pYES2-PpLEA3． b 导入酿酒酵母
S． cerevisiae strain INVSc1 菌株中。先在含 2%葡萄糖
的 SC-URA培养基中筛选出重组子，提取酵母基因组
DNA，用引物 LEA-F 和 LEA-R 进行 PCR，扩增出目的
条带，与预计大小相符，而阴性对照没有扩增出该条带
(图 4) ，说明 PpLEA3． a 和 PpLEA3． b 基因已整合到酵
母基因组中。
图 2 PpLEA3 基因剪接体的蛋白质三级结构预测图
Fig． 2 Tertiary structure prediction of
PpLEA3 gene spliced isoforms
(a)PpLEA3． a (b)PpLEA3． b
图 3 表达载体 pYES2-PpLEA3． a和 pYES2-
PpLEA3． b酶切鉴定和 PCR验证
Fig． 3 Restriction enzyme digestion and PCR for
pYES2-PpLEA3． a and pYES2-PpLEA3． b
M:DNA 2000 marker;1，2:pYES2-PpLEA3． a and pYES2-PpLEA3． b
digested with BamHI and XhoI， respectively;3 ～ 5: PCR
amplification of pYES2，pYES2-PpLEA3． a and pYES2-PpLEA3． b，
respectively
图 4 pYES2-PpLEA3． a 和 pYES2-
PpLEA3． b转酵母 PCR鉴定
Fig． 4 Identification of yeast transformed with pYES2-
PpLEA3． a and pYES2-PpLEA3． b by PCR
M:DNA 2000 marker;1:Negative control;
2:pYES2-PpLEA3． a;3:pYES2-PpLEA3． b
2． 4 转基因酵母对逆境胁迫的抗性分析
在未胁迫的情况下，转基因酵母 ta、tb 和对照酵母
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2012，32(8) 李 锐 等:金发草 LEA3 基因两个剪接体转化酿酒酵母的抗非生物胁迫功能分析
wt生长状态相当(图 5A) ，表明金发草 LEA3 基因两个
剪接体的超表达未对酵母的正常生长造成影响，可以
比较它们对胁迫的耐受性。
在 5mol /L NaCl 胁迫下，三种酵母均能够生长，但
转基因酵母 ta、tb 的存活率明显高于对照酵母 wt(图
5B) ，并且存活率 ta ＞ tb(表 1)。说明在相同盐胁迫条
件下，PpLEA3 基因的表达可明显提高酵母细胞对盐胁
迫的耐受能力。
在 NaHCO3 胁迫下酵母的生长结果表明，当
NaHCO3 溶液浓度为 10%时，对照酵母(wt)无法生长，
而转基因酵母(ta、tb)仍具有一定的存活率(图 5C) ，并
且 ta存活率是 tb的 2． 2 倍(表 1) ，说明 PpLEA3 基因的
表达能够增强酿酒酵母对碱胁迫的耐受能力。
三种酵母在 － 20℃低温胁迫下处理 48h 后的实验
结果表明，转基因酵母(ta、tb)的存活率明显高于对照
酵母(wt) (图 5D) ，ta 和 tb 分别是 wt 的 6． 8 倍和 4． 6
倍(表 1)。说明 PpLEA3 在酵母中表达增强了酵母的
抗冻能力。
8mol /L山梨醇胁迫的结果显示，胁迫下三种酵母均
能够生长，但转基因酵母(ta、tb)生长情况明显优于对照
酵母(wt) (图5E) ，总体上 ta存活数要多于 tb(表1)。说
明三种酵母的抵抗山梨醇能力大小为 ta ＞ tb ＞ wt。
如图 5F所示，转基因酵母在波长 100μJ /cm2 的紫
外照射 90s后，对照酵母存活率为 0，转基因酵母 ta和 tb
虽然也受到了较大的伤害，但是仍有部分重组酵母存活，
而且 ta的存活率明显高于 tb(表 1) ，说明转 PpLEA3 基
因的表达能够提高酵母抵抗紫外照射的能力。
图 5 转基因酵母在不同非生物胁迫条件下的生长
Fig． 5 Growth of wt(INV)and ta(INV-PpLEA3． a)
and tb(INV-PpLEA3． b)yeast under different abiotic
stress conditions
wt:INV;ta:INV-PpLEA3． a;tb:INV-PpLEA3． b
A:Untreated yeast cells; B ～ F: NaCl，NaHCO3， freezing，
sorbitolum，ultraviolet radiation tolerance of yeast cells，respectively
表 1 非生物胁迫下转基因酵母和对照的菌落数目比较
Table 1 Comparison of the number of transgenic
and control yeast colonies under abiotic stress
株系
胁迫处理
wt ta tb
未胁迫 470 490 452
盐胁迫 75 430 310
碱胁迫 0 215 96
冷冻胁迫 76 520 350
干旱胁迫 87 294 230
紫外胁迫 0 24 13
wt:INV;ta:INV-PpLEA3． a;tb:INV-PpLEA3． b
3 讨 论
LEA 蛋白是植物中与抗非生物胁迫有关的一类重
要蛋白，虽然 LEA蛋白的抗逆机制还不清楚，但大量研
究证明第 3 组 LEA 蛋白与抗脱水胁迫相关，主要依靠
其极强的亲水能力增强植物对水分胁迫的耐受能
力［16］。通过在酵母中过表达 PpLEA3 基因的两个剪接
体，检测酵母在胁迫条件下的生长状况，有助于深入了
解 PpLEA3 的功能。我们的结果表明，在多种不同的非
生物因子胁迫下，转 PpLEA3 基因的重组酵母菌比对照
菌(转空载体)具有更强的生活力，同时我们还发现金
发草 LEA3 蛋白基因赋予了酵母忍耐碱性盐(NaHCO3)
和紫外辐射的能力，这与 Wang 等［17］报道的结果相似，
推测其对逆境的抵抗能力更强。
可变剪接是真核生物控制基因表达的一种重要的
转录后调控机制，生物体通过这种机制使有限的基因
得以表达功能多样的蛋白质，通过影响酶活性和亚细
胞定位等方面，控制生物机体的生长发育［18］。在本研
究中，利用酿酒酵母表达体系对 PpLEA3 基因两种可变
剪接进行了分析，PpLEA3． a 剪接体与 PpLEA3． b 相比
保留了第二个内含子，使转录本的长度增加，并且通过
分析可知该内含子以疏水性氨基酸为主，该内含子的
保留不仅减弱了该基因的亲水能力，而且导致其三级
结构产生变化，较 PpLEA3． a疏松。这些变化导致两个
剪接体在酵母中表达后的耐受胁迫能力产生差异，在
本研究所涉及的 5 种胁迫中，PpLEA3． a均比 PpLEA3． b
表现出更强的耐受能力，序列的改变导致了基因结构
的改变，最终导致功能上产生一定的差异。
本研究中的 PpLEA3 基因的两个剪接体在重组的
酿酒酵母中都对盐、冷等非生物胁迫具有一定的耐受
能力，但是由于两个剪接体亲水能力和结构上的改变，
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导致重组酵母的耐受力不同，具体的机理还有待进一
步的研究。
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2012，32(8) 李 锐 等:金发草 LEA3 基因两个剪接体转化酿酒酵母的抗非生物胁迫功能分析
Abiotic Stress Tolerance Analysis Two Alternatively Spliced Isoforms of
LEA3 Gene from Pogonatherum paniceum in Yeast
LI Rui1 WANG Wen-guo2 FAN Lin-hong1 WANG Sheng-hua1
(1 College of Life Sciences，Sichuan University，Department of Key Laboratory of Bio-resources and Eco-environment，
Ministry of Education，Chengdu 610064，China)
(2 Research Centre of Biomass Energy Technology，Biogas Institute of Ministry of Agriculture，Chengdu 610041，China)
Abstract It was to analyze the sequence of Pogonatherum paniceum group 3 LEA proteins alternatively
spliced isoforms，and to detect the abiotic stresses tolerance of PpLEA3 spliced isoforms． The two spliced isoforms
of PpLEA3 gene were amplified by PCR reaction using the plasmids pMD19-T-PpLEA3． a and pMD19-T-PpLEA3． b
as the templates，respectively． The yeast expression plasmid of pYES2-PpLEA3． a and pYES2-PpLEA3． b was
constructed and then transformed into yeast to create recombinant INV-PpLEA3． a and INV-PpLEA3． b． Stress
tolerance tests showed that LEA3 yeast transformants exhibited a higher survival rates than the control
transformants under salt (NaCl) ，NaHCO3，freezing，drought and ultraviolet radiation． PpLEA3． a has stronger
abiotic stresses tolerance than PpLEA3． b． The nucleic acid sequence of two splicing isoforms have different
protein hydrophilicity and structure which leading to differences in the stress tolerance．
Key words LEA3 gene Pogonatherum paniceum Alternative splicing Transgenic yeast Ab
檪檪檪檪檪檪檪檪
檪
檪檪檪檪檪檪檪檪
檪
殏
殏殏
殏
iotic stress
姜老师信箱
蛋白质研讨班学员问:
姜老师，您好!我是您蛋白质分离纯化技术专题研讨班的学员。我们准备用溴化氰活化介质偶联 α-银环蛇毒素装
柱，溴化氰活化的琼脂糖 4B是某知名公司的，空柱还没定，说明书上推荐的是 HR 16 /10。请问这款柱子我们可以用吗?急
切盼望您的回复，谢谢!
姜老师答:
学员你好，高兴收到你的反馈。我在课上讲过了，亲和柱适合使用粗短的柱子。HR 16 /10 是高压柱壳，只适合颗粒度
小于 30μm的离子交换或者疏水，本身太细，不适合用作亲和柱。琼脂糖类的层析介质使用低压柱壳，用高压柱壳完全是浪
费。你可以购买国产的常规柱子。亲和柱长度有 5 公分足够了，直径就可以根据体积来定了。
注意我课程里讲过的，亲和柱在有条件情况下，正向上样，反向洗脱更好。
祝实验顺利!
53