全 文 ：中国生物工程杂志 China Biotechnology，2013，33(1) :41-46
根癌农杆菌介导的金发草遗传转化条件的优化*
李美玉 李 锐 于 敏 王胜华＊＊ 陈 放
(四川大学生命科学学院 生物资源与生态环境教育部重点实验室 成都 610064)
摘要 金发草( Pogonatherum paniceum) 是一种多年生岩生草本植物，在生态恢复和景观建设中起
着重要的作用。利用根癌农杆菌介导转化金发草胚性愈伤组织，通过 GUS( β-葡萄糖苷酸酶) 瞬
时表达率研究菌液浓度、浸染时间、乙酰丁香酮( AS) 浓度、葡萄糖浓度、共培养时间等因素对金发
草转化的影响，并利用确定的最佳条件将 GUS基因转入金发草，获得稳定表达转化植株。结果表
明:菌液浓度( OD600 ) 为 0． 6，浸染时间为 10min，添加 20mg /L的乙酰丁香酮( AS) 和 10g /L的葡萄
糖，共培养时间 5d为最佳条件，GUS 瞬时表达率最高。经过抗性筛选后最终获得阳性转基因植
株频率为 57%。再生植株经 GUS 染色和 PCR 检测证明，GUS 基因已成功整合到金发草基因组
中。此转化体系的建立为金发草的遗传改良及相关功能基因的研究奠定了基础。
关键词 金发草 愈伤组织 根癌农杆菌 遗传转化 GUS
中图分类号 Q311
收稿日期:2012-05-28 修回日期:2012-11-07
* 国家自然科学基金资助项目(31070276)
＊＊通讯作者，电子信箱:shwang200@ yahoo． com． cn
金发草(Pogonatherum paniceum)是一种我国本土
栖息的禾本科金发草属植物，广泛分布于亚洲的温带，
热带和亚热带地区，大洋洲及非洲等地区，在我国南方
地区有广泛地分布［1］。金发草形似小竹，自然形态美
观，根系发达，耐旱耐瘠，生长迅速，能在风化岩石、滑
坡裸地等恶劣的生态环境中生长，并形成草坪，是一种
优良的观赏植物和较常见的演替先锋拓殖种群，在水
土保持、生态护坡等方面有着较好的应用前景［1-4］。
金发草作为一种新的园林绿化植物需要进一步的
驯化培育，传统的杂交育种和系统选育方法不仅育种
周期较长，且对种质资源依赖性很强［5-6］。而利用基因
工程可以克服以上困难，对园艺植物抗逆性、抗虫性以
及性状进行改良。其中农杆菌介导转化法是目前较为
常用的方法之一，该方法不仅操作简单，可转移特定的
DNA片段，插入拷贝数较少，外源基因遗传稳定性好，
转基因植物通常可育，而且其转化率一般高于其它转
化方法［7］。因此越来越多的草坪草及园艺观赏植物通
过此方法建立了遗传转化体系［8-10］。
近年来，虽然农杆菌介导的单子叶植物遗传转化
取得了长足的进步，但因单子叶植物感受态细胞稀少、
再生能力弱、转化率低、外源基因表达水平低及实验重
复性差的问题的存在，限制了此技术在单子叶植物遗
传改良方面的应用［11］。金发草不同外植体(茎、叶、种
子等)的再生体系已经建立，其愈伤组织诱导率高，愈
伤组织再生率 100%，且再生植株容易存活［12-13］，这为
金发草的遗传转化提供了极为重要的前提条件。金发
草遗传转化体系的建立不仅可以为金发草的分子遗传
育种奠定一定的基础，而且可以用于其他单子叶植物
的基因功能鉴定。因此，本文在金发草高频再生体系
的基础上，对菌液浓度，浸染时间，共培养时间，乙酰丁
香酮(AS)浓度和葡萄糖浓度等条件进行了优化，建立
了根癌农杆菌介导的金发草遗传转化体系。
1 材料与方法
1． 1 植物材料
金发草种子采自四川遂宁。挑选饱满成熟的种
子，70%的酒精消毒 1min，20% 次氯酸钠浸泡 15min
后，无菌水冲洗 3 ～ 5 次，接种于诱导培养基，然后将诱
导出的愈伤组织转入继代培养基中，两周继代一次，挑
取白色或黄白色多瘤状胚性愈伤组织，作为转化的受
体材料。诱导愈伤组织及继代培养都是在 26 ± 1℃暗
DOI：10.13523/j.cb.20130107
中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol． 33 No． 1 2013
条件下进行。愈伤组织分化成苗在光照时间 12h /d，光
照度为 40 μmol /m2s条件下进行。
1． 2 农杆菌菌株及培养
根癌农杆菌菌株为 EHA105，质粒载体 pBI121 由
本实验室保存。载体携带有 CaMv35S 启动子调控的
GUS报告基因和选择性标记 NPT-Ⅱ基因，抗性标记为
Kan。将 －80℃冻存的农杆菌划线于含有 Kan(50mg /
L)和 Rif(50mg /L)的 YEB 平板上，28℃倒置培养 1 ～
2d，待菌落长出后挑取单菌落接种于含有 Kan(50mg /
L)和 Rif(50mg /L)的液体 YEB 培养基中，28℃，250r /
min振荡培养过夜。
1． 3 培养基
金发草愈伤组织诱导及继代培养基［12-13］:MS +
2mg /L NAA + 1mg /L 2，4-D + 3%蔗糖 + 0． 8%琼脂粉
(pH5． 8) ;分化培养基:MS + 3%蔗糖 + 0． 8%琼脂粉
(pH5． 8) ;共培养基:MS + 2mg /L NAA + 1mg /L 2，4-D
+3%蔗糖 +0． 8%琼脂粉(pH5． 2) ;继代筛选培养基:
MS + 2mg /L NAA + 1mg /L 2，4-D + 300mg /L Cef +
15mg /L Kan(pH5． 8) ;分化筛选培养基:MS + 300mg /L
Cef + 10mg /L Kan(pH5． 8)。
1． 4 遗传转化
将达到对数期的农杆菌菌液，4℃下 5 000r /min 离
心 5min，收集菌体并用 1 /2MS液体培养基重悬，稀释至
不同菌液浓度(OD600)作为浸染液。选取生长良好的
愈伤组织浸入浸染液中振荡培养 5 ～ 30min，静置 10min
后取出愈伤组织于无菌滤纸上吸干，转入含有不同浓
度的 AS共培养基中暗培养 1 ～ 7d。检测其中某个因素
时，其他因素水平采用 OD600为 0． 6，浸染时间为 10min，
AS浓度为 20mg /L，葡萄糖浓度为 10g /L，共培养天数
为 5d。共培养结束后统计 GUS 瞬时表达率以确定适
宜的转化条件。
共培养之后，将愈伤组织用无菌水冲洗 3 ～ 4 次，
再用 300 mg /L头孢噻呋钠浸泡 20min，将愈伤组织置
于无菌滤纸上吸干并转移至继代筛选培养基中进行继
代筛选。4 ～ 5 周之后，将生长良好的抗性愈伤组织转
移到分化筛选培养基中进行分化筛选。当抗性苗生长
至 6cm高时，将其转移至土壤中栽培。
1． 5 抗性植株的检测
1． 5． 1 GUS 组织化学染色 参照 Jefferson 等［14］的方
法进行组织化学染色，统计 GUS 瞬时表达率及抗性幼
苗染色情况。GUS 瞬时表达率 = GUS 阳性愈伤组织
数 /总愈伤组织数 ×100 %
每个实验重复都是完全随机的放入 10 ～ 30 块外
植体，每个实验重复 3 ～ 5 次，所得结果用平均数表示。
1． 5． 2 转化植株 PCR 分子检测 提取抗性再生植株
和未转化植株(阴性对照)的基因组 DNA，以其为模板，
通过 GUS基因的特异引物进行 PCR 扩增检测抗性再
生植株中 GUS基因的整合情况。PCR 引物序列:F 5-
CAGGAAGTGATGGAGCATCAG-3;R 5-TCGTGCACCA
TCAGCACGTTA-3。目标片段长度为 700bp，PCR 产物
用 1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
2 结果与分析
2． 1 菌液浓度对 GUS瞬时表达率的影响
取不同浓度(OD600 = 0． 2、0． 4、0． 6、0． 9、1． 2)的根
癌农杆菌菌液与金发草愈伤组织进行浸染，结果如图 1
所示:GUS 瞬时表达率随菌液浓度升高而提高，当
OD600为 0． 6 时 GUS 瞬时表达率为最高。在较低浓度
菌液(OD600 = 0． 2)转化率仅为 33%左右，而当 OD600大
于 0． 9，农杆菌过度生长包围整块愈伤组织，影响菌的
清除并导致部分愈伤组织腐烂、死亡(图 1)。因此本文
选择 OD600 = 0． 6 为最佳浸染浓度。
图 1 菌液浓度对 GUS瞬时表达率的影响
Fig． 1 Effect of Agrobacterium concentrations
on GUS transcient expression
2． 2 浸染时间对 GUS瞬时表达率的影响
根癌农杆菌不同的浸染时间对金发草遗传转化频率
有较大的影响(图 2) ，当浸染时间为 10min时，GUS瞬时
表达率最高。但若浸染时间太短，根癌农杆菌不能完全
浸入到愈伤组织;但浸染时间太长，超过 15min 后，根癌
农杆菌不容易被清除而过度繁殖，导致愈伤组织大量褐
化、坏死，这与 Zhao 等［15］的研究结果一致。因此，金发
草愈伤组织遗传转化的最佳浸染时间为 10min。
2． 3 AS和葡萄糖对 GUS瞬时表达率的影响
本实验在共培养过程中添加 20mg /L 的 AS，GUS
24
2013，33(1) 李美玉 等:根癌农杆菌介导的金发草遗传转化条件的优化
图 2 浸染时间对 GUS瞬时表达率的影响
Fig． 2 Effect of infection time on GUS
transcient expression
瞬时表达率可以达到 56%左右(图 3) ，这与 Park［16］，
Liao ［17］和 Zhu［18］等的研究结果一致。但当 AS 浓度高
于 20mg /L时转化率开始降低。添加 AS 50mg /L 浓度
时，其 GUS瞬时表达率仅为 31%，这可能与较高浓度
的 AS对愈伤组织产生毒害作用，导致 GUS瞬时表达率
降低有关［19］。同时，在共培养基中添加 10g /L 的葡萄
糖，GUS瞬时表达率得到提升(图 3) ，这与 Seo［10］的研
究结果相一致。这可能是因为葡萄糖激活了 Vir 基因，
从而促进了转化率的提高［20］。
图 3 AS和葡萄糖对 GUS瞬时表达率的影响
Fig． 3 Effect of acetosyringone and glucose
on GUS transcient expression
2． 4 共培养时间对 GUS瞬时表达率的影响
将愈伤组织与根癌农杆菌共培养后发现，随着共
培养时间的延长，GUS 瞬时表达率也逐渐增加。共培
养 5d时 GUS 瞬时表达率最高(图 4)。而共培养 7d
后，虽然 GUS瞬时表达率较高，但此时根癌农杆菌过度
生长，导致愈伤组织褐化、死亡。因此最适共培养时间
为 5d。
2． 5 抗性植株的检测
2． 5． 1 GUS染色检测 对抗性愈伤组织进行 GUS 组
织化学染色分析，结果显示，金发草愈伤组织的 GUS 基
图 4 共培养时间对 GUS瞬时表达率的影响
Fig． 4 Effect of co-cultivation time on
GUS transcient expression
因表达比较强，绝大部分抗性愈伤组织可被染成蓝色
(图 5-B，C) ，抗性植株的叶片以及根部都可出现蓝色，
而未转化的愈伤组织及对照植株未出现蓝色(图 5D-
G)。说明 GUS基因已在金发草中正常表达。
图 5 转基因金发草的 GUS染色及再生
Fig． 5 GUS staining and regeneration
of transformed P． paniceum
A:Untransformed P． paniceum callus． B，C:GUS-positive callus．
D:Plantlet regenerated from untransformed P． paniceum callus． E:
GUS-positive kanamycin-resistant Plantlet． F:GUS-positive root． G:
GUS-positive leaves． H: Regeneration of kanamycin-resistant
Plantlet． I:Transplanting of kanamycin-resistant Plantlet
2． 5． 2 PCR检测 提取 GUS 染色阳性的抗性植株的
基因组 DNA，并利用特异引物进行 GUS基因的 PCR 扩
增。结果如图 6，阳性植株均可扩增出 700bp 的片段，
与预期 GUS的扩增片段大小一致，而未转化植株没有
目的片段出现。由此证实外源基因已整合到金发草转
34
中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol． 33 No． 1 2013
化植株的基因组中。
图 6 转化植株 PCR扩增 GUS的结果
Fig． 6 PCR amplification of a 700b Pfragment of GUS
gene from transformed P． paniceum
M:DL2000 DNA marker;P:pBI121;U:Untransformed plantlet;
1-3:Transformed plantlets
3 讨 论
根癌农杆菌介导的遗传转化是目前研究最清楚、
应用最广泛的转化方法，并受很多因素的影响［21］。本
文成功建立了根癌农杆菌介导的金发草转化体系，并
优化了该体系的主要因素，得到最优的转化条件为:菌
液浓度 OD600为 0． 6，浸染时间为 10 min，20mg /L 的乙
酰丁香酮(AS) ，10g /L的葡萄糖及共培养时间 4d，并得
到金发草的转化率达 78． 9%。
根癌农杆菌介导的金发草转化体系，去除愈伤组
织诱导时间，从愈伤组织转化到再生抗性芽仅仅需要
60d左右，而且转化的过程较为简单，容易操作。在较
短时间内，就可以完成转化、筛选、GUS 检测及分子鉴
定的全过程，并得到转基因的金发草植株(图 5-H，I)。
这主要由于金发草较高的 GUS 瞬时表达率，以及其高
频再生率。另外在本实验中，金发草每块愈伤组织可
被分成若干小块来进行浸染，此增加了愈伤组织的浸
染面积，也提高了转化率。
在转化过程中，若菌液浓度过高，浸染时间或共培
养时间太长，都有可能导致农杆菌过度增殖，附着在愈
伤组织并对其产生毒害甚至导致愈伤组织褐化、死亡。
不同外植体最佳共培养时间有很大差异，Ashok［22］等报
道大麦有效转化 GUS 的共培养时间为 2 ～ 3d，Zhao［15］
报道盐地碱蓬共培养 4d 后得到最高转化率。而本研
究发现共培养 5d时，金发草愈伤组织的转化率最高。
酚类化合物是单子叶植物转化不可缺少的物质，
它是 Vir 基因的活化因子，可启动 T-DNA 转移［23-24］。
不同的植物在遗传转化的过程中，最适宜的 AS 浓度也
大不相同［25］。本文，在共培养基中加入 20mg /L 的 AS
能明显促进转化率的提高。
农杆菌介导的高效率的金发草转化体系的建立及
转化体的获得，为金发草基因改良奠定了基础。同时
该转化系统的成功构建及优化在一定程度上解决了单
子叶植物的转化效率低的问题，为金发草和其他单子
叶植物相关基因功能的转基因鉴定提供了有力的
工具。
参考文献
［1］王文国，李锐，王胜华，等． 基于 GIS的水土保持植物金发草
的适生区与生境分析． 中国水土保持，2010，(6) :33-35．
Wang W G，Li R，Wang SH H，et al． GIS-Based analysis on
suitable distribution area and habitat of Pogonatherum paniceum，
a plant for soil and water conservation． Soil and Water
Conservation in China，2010，(6) :33-35．
［2］陈红，王海洋． 不同基质环境条件下金发草的种群结构差异．
西南农业大学学报(自然科学版) ，2004，(4) :448-451．
Chen H，Wang H Y． Differentiation of population structure of
Pogonatherum paniceum on different substrates． Journal of
Southwest Agricultural University(Natural Science) ，2004，26
(4) :448-451．
［3］马丹炜，王胜华，罗通，等． 环境因子对岩生植物金发草遗传
多样性的影响． 中山大学学报(自然科学版) ，2006，45(2) :
73-77．
Ma D W，Wang SH H，Luo T，et al． Effects of environmental
factors on the genetic diversity of Pogonatherum paniceum，Acta
Scientiarum Naturalium Universitaties Sunyatseni，2006，45(2) :
73-77．
［4］王海洋，彭丽，李绍才，等． 岩生植物金发草生长特征研究． 应
用生态学报，2005，(8) :1432-1436．
Wang H Y，Peng L，Li SH C，et al． Growth characteristics of
rock plant Pogonatherum paniceum． Chin J Appl Ecol，2005，16
(8) :1432．
［5］ Gao C X，Liu J X，Nielsen K K． Agrobacterium-mediated
transformation of meadow fescue (Festuca pratensis Huds．)．
Plant Cell Rep，2009，28:1431-1437．
［6］ Ge Y X，Norton T，Wang Z Y． Transgenic zoysiagrass (zoysia
japonica ) plants obtained by Agrobacterium-mediated
transformation． Plant Cell Rep，2006，25:792-798．
［7］陈章良． 植物基因与分子操作． 北京:北京出版社，1995，
191-230．
Chen ZH L． Plant genes and molecular manipulation． Beijing:
Beijing Press，1995，191-230．
44
2013，33(1) 李美玉 等:根癌农杆菌介导的金发草遗传转化条件的优化
［8］ Sergio G N，Isabel A，Lucas del C A，et al． Agrobacterium
tumefaciens-mediated transformation of the aromatic shrub
Lavandula latifolia． Mol Breeding，2000，6:539-552．
［9］ Wang Z Y，Ge Y． Agrobacterium-mediated high efficiency
transformation of tall fescue (Festuca arundinacea Schreb．)．
Plant Physiol，2005，162:103-113．
［10］ Seo M S，Bae C H，Choi D O， et al． Investigation of
transformation efficiency of rices using Agrobacterium Tumefaciens
and high transformation of GPAT (glycerol-3-phosphate
aeyltransferase)generelative to chilling tolerance． Korean J Plant
Biotechnlogy，2002，29:85-92．
［11］魏开发，刘逸萍，林子英，等． 农杆菌介导单子叶植物遗传转
化问题与对策． 植物学通报，2008，25(4) :491-496．
Wei K F，Liu Y P，Lin Z Y，et al． Problems and solutions in
Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of
Monocotyledons． Chin Bull Bot，2008，25(4) :491-496．
［12］Wang W G，Zhao X G，Zhuang G Q，et al． Simple hormonal
regulation of somatic embryogenesis and /or shoot organogenesis in
caryopsis cultures of Pogonatherum paniceum (Poaceae)． Plant
Cell Tiss Organ Cult，2008，95:57-67．
［13］Wang W G，Wang S H，Wu X A，et al． High frequency plantlet
regeneration from callus and artificial seed production of rock plant
Pogonatherum paniceum (Lam．)Hack． (Poaceae)． Sci Hortic，
2007，113:196-201．
［14］ Jefferson R A． DNA transformation of Caenorhabditis elegans:
development and application of a new gene fusion system．
University of Colorado，USA:Boulder CO，1985．
［15］ Zhao S Z， Ruan Y， Sun H Z， et al． Highly efficient
Agrobacterium-based transformation system for callus cells of the
C3 halophyte Suaeda salsa． Acta Physiol Plant，2008，30:729-
736．
［16］ Park S H，Lee B M，Sslas M G，et al． Shorter T-DNA or
additional virulence genes improve Agrobactrium-mediated
transformation． Theor Appl Genet，2000，101:1015-1020．
［17］Liao C H，You S J，Prasad V，et al． Agrobacterium tumefaciens-
mediated transformation of an Oncidium orchid． Plant Cell Rep，
2003，21:993-998．
［18］ Zhu Q，Wu F T，Ding F， et al． Agrobacterium-mediated
transformation of Dioscorea zingiberensis wright， an important
pharmaceutical crop，Plant Cell Tiss Organ Cult，2009，96:317-
324．
［19］ Amoah B K，Wu H，Sparks C，et al． Factors influencing
Agrobacterium-mediated trasient expression of uidA in wheat
inflorescence tissue． J Exp Bot，2001，52:1135-1142．
［20］ McLean B G， Greene E A， Zambryski PC． Mutants of
Agrobacterium VirA that activate vir gene expression in the
absence of the inducer acetosyringone． J Biol Chem，1994，269
(4) :2645-2651．
［21］ Monique F，van Wordragen，Hans J M Dons． Agrobacterium
tumefaciens-mediated transformation of recalcitrant crops． Plant
Mol Biol Rep，1992，10(1) :12-36．
［22］ Ashok K S，Dirk B，Horst L． Agrobacterium tumefaciens-
mediated genetic transformation of barley (Hordeum vulgare L．)．
Plant Sci，2007，172:281-290．
［23］Hansen G，Das A，Chilton M D． Constitutive expression of the
virulence genes improves the efficiency of plant transformation by
Agrobacterium． Proc Natl Acad Sci USA，1994，91:7603-7607．
［24］Smith R H，Hood E E． Review and interpretation:Agrobacterium
tumefaciens transformation of monocots． Crop Sci，1995，35(2) :
301?309．
［25］董喜才，杜建中，王安乐，等． 乙酰丁香酮在植物转基因研究
中的作用． 中国农学通报，2011，27(5) :292-299．
Dong X C，Du J ZH，Wang A L，et al． Role of Acetosyringone in
plants transformation researcher． Chinese Agriculture Science
Bulletin，2011，27(5) :292-299．
Optimization of Genetic Transformation Conditions in Pogonatherum
paniceum Mediated by Agrobactrium tumefaciens
LI Mei-yu LI Rui YU Min WANG Sheng-hua CHEN Fang
(Key Laboratory of Bio-resources and Eco-environment of Ministry of Education，College of Life Sciences，
Sichuan University，Chengdu 610064，China)
Abstract A perennial herbaceous plant，Pogonatherum paniceum，plays an important role inecological
restoration and landscape construction． To establish highly efficient transformation system， factors which
54
中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol． 33 No． 1 2013
influenced transformation including Agrobacterium concentration，infection time，concentration of acetosyringone
and glucose，and co-culture time were studied with the mature embryo callus of Pogonatherum paniceum based on
the variance of GUS (β-glucuronidase)trsnsient expression rate． The results showed that the transformation
efficiency was improved with Agrobacterium concentration of OD600 = 0． 6，incubation for 10 min，co-culture time
for 5d． Acetosyringone with the concentration of 20mg /L and 10g /L glucose could significantly enhance the
transformation rate． Utilizing this system，more than 57% kanamycin resistance selection efficiency was
obtained． GUS gene has successfully integrated into the plant genome by GUS and PCR detection． The
establishment of this transformation system lays a foundation for genetic modified and study of functional genes of
Pogonatherum paniceum．
Key words Pogonatherum paniceum Callus Agrobactrium tumefaciens Transformation GUS
科学出版社新书
Lewin基因 X(中文版) J． E．克雷布斯等 著 江松敏 译
Benjamin Lewin的《基因》出版之时就已经为这本书设定了很高的标准，并成为一本分子生物学与分子遗传学领域国际
通用的优秀参考书籍。过去几十年中的 9 个版本见证着分子生物学与分子遗传学日新月异的变化。作为《基因》系列的最
新版本，《Lewin基因 X》(中文版)对分子生物学和分子遗传学进行了精彩的论述，内容涵盖了基因的结构、序列、组织和表
达。为了提供分子生物学领域中快速多变的最新知识，21 位科学家编写和修正了其各自领域的相关内容。全新的第 3 章
“分子生物学与遗传工程中的方法学”，提供了分子生物学中实验技术的概念和操作方法介绍;全新的第 8 章“基因组进
化”，把在前一版本中分散于各章节的信息进行了组合、扩展和更新，并汇集于这章;第 22 章“mRNA的稳定性和定位”被重
新编写以便于涵盖更多更新的前沿内容;第 30 章“调节性 RNA”增加了 RNAi途径的知识;大量崭新的精美插图反映了相关
领域的最新进展，尤其是有关染色质结构与功能、表观遗传学，以及真核生物中非编码 RNA和微 RNA所介导的调控。
更多信息请登录 www． lifescience． com． cn
64