全 文 ：２０１５年５月 四川大学学报（自然科学版） Ｍａｙ．２０１５
第５２卷　第３期 Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ） Ｖｏｌ．５２　Ｎｏ．３
收稿日期：２０１４－０３－１０
基金项目：国家自然基因（３１０７２７６；３１２７０３６０）
作者简介：范林洪 （１９８８－），男，硕士研究生，研究方向为转基因生物安全．Ｅ－ｍａｉｌ：４４７０３８７８６＠ｑｑ．ｃｏｍ
通讯作者：王胜华．Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｈｗａｎｇ２００＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
ｄｏｉ：１０３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０４９０－６７５６．２０１５．０３．０３８
金发草ＧＤＰ－Ｄ－甘露糖焦磷酸化酶基因的
克隆及功能分析
范林洪，李　锐，童永鳌，王胜华
（四川大学生命科学学院 生物资源与生态环境教育部重点实验室，成都　６１００６４）
摘　要：通过ＲＡＣＥ－ＰＣＲ技术克隆得到金发草 ＧＭＰ基因的ｃＤＮＡ全长序列，命名为Ｐｐ－
ＧＭＰａｓｅ（ＧｅｎＢａｎｋ序列号：ＫＦ５８６８４１）．该基因开放阅读框长度为１０８６ｂｐ，编码３６１个氨基
酸，分子式为Ｃ１７８７Ｈ２８７４Ｎ４７４Ｏ５０９Ｓ１７；ＤＮＡ序列由４个外显子和３个内含子组成；该基因与玉
米、水稻、猕猴桃、烟草、拟南芥、番木薯等植物ＧＭＰ基因具有较高的同源性，与二穗短柄草亲
缘关系最近．采用荧光定量ＰＣＲ方法对该基因响应非生物胁迫（盐、干旱和冷胁迫）的表达模
式进行分析，结果表明：在高盐、干旱及低温胁迫后ＧＭＰ基因的表达量都有显著性增加，并
且其催化产物抗坏血酸含量也随之增加．
关键词：金发草；ＧＤＰ－Ｄ－甘露糖焦磷酸化酶；抗逆性；抗坏血酸；基因克隆
中图分类号：Ｑ９４９．７　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：０４９０－６７５６（２０１５）０３－０６８２－０７
Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＧＤＰ－Ｄ－ｍａｎｎｏｓｅ　ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ
ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ｐｏｇｏｎａｔｈｅｒｕｍ　ｐａｎｉｃｅｕｍ
ＦＡＮ　Ｌｉｎ－Ｈｏｎｇ，ＬＩ　Ｒｕｉ，ＴＯＮＧ　Ｙｏｎｇ－Ａｏ，ＷＡＮＧ　Ｓｈｅｎｇ－Ｈｕａ
（Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｂｉｏ－ｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ　Ｅｃｏ－ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，
Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ　ｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈ　ＧＤＰ－Ｄ－ｍａｎｎｏｓｅ　ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ（ＧＭＰ）ｃＤＮＡ　ｆｒｏｍ　Ｐｏｇｏｎａｔｈｅｒｕｍ　ｐａｎｉｃｅ－
ｕｍ　ｗａｓ　ｃｌｏｎｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ＲＡＣＥ　ｍｅｔｈｏｄ　ｕｓｉｎｇ　ｋｎｏｗｎ　ＧＭＰ　ｇｅｎｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ａｎｄ　ｎａｍｅｄ　ＰＨ－ＧＭＰａｓｅ
（ＧｅｎｅＢａｎｋ　Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ：ＫＦ５８６８４１）．Ｔｈｅ　ＰＨ－ＧＭＰａｓｅ　ＯＲＦ　ｃｏｎｔａｉｎｓ　３６１ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ
ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｆｏｒｍｕｌａ　ｏｆ　ｉｔ　ｉｓ　Ｃ１７８７Ｈ２８７４Ｎ４７４Ｏ５０９Ｓ１７．Ｉｔ′ｓ　ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｉｓ　ｃｏｎｓｉｓｔ　ｏｆ　４ｅｘｏｎｓ　ａｎｄ　３ｉｎ－
ｔｒｏｎｓ．Ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｓ　ＰＨ－ＧＭＰａｓｅ　ｈａｓ　ａ　９８．０６％，９３．０７％，８８．６４％，８６．９８％，
８７．５３％ａｎｄ　８６．４３％ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ　ｗｉｔｈ　Ｚｅａ　ｍａｙｓ，Ｏｒｙｚａ　Ｓａｔｉｖａ，Ａｃｔｉｎｉｄｉａ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ，
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ａｎｄ　Ｍａｎｉｈｏｔ　ｅｓｃｕｌｅｎｔａ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｉｎｄｉｃａｔｅｓ
ＰＨ－ＧＭＰａｓｅ　ｈａｓ　ａ　ｃｏｍｍｏｎ　ａｎｃｅｓｔｏｒ　ｗｉｔｈ　ｏｔｈｅｒ　ｈｉｇｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ，ｆｕｎｇｉ，ｈｉｇｈｅｒ　ａｎｉｍａｌｓ　ａｎｄ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ａｎｄ　ｈａｓ
ａ　ｎｅａｒｅｓｔ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｗｉｔｈ　Ｂｒａｃｈｙｐｏ　ｄｉｕｍｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ＧＭＰ　ｗａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｕｎ－
ｄｅｒ　ｓａｌｔ，ｄｒｏｕｇｈｔ　ａｎｄ　ｃｏｌｄ　ｓｔｒｅｓｓ　ｂｙ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｑｕａｎｔｉｚａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ＧＭＰ　ｗａｓ　ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ
ｉｎ　ｂｏｔｈ　ｔｈｒｅｅ　ｓｔｒｅｓｓ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ（ＡｓＡ）ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｐｏｇｏｎａｔｈｅｒｕｍ　ｐａｎｉｃｅｕｍ；ＧＤＰ－Ｄ－ｍａｎｎｏｓｅ　ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ；Ｓｔｒｅｓｓ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；Ａｓｃｏｒｂｉｃ
ａｃｉｄ；Ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ
第３期 　　 范林洪，等：金发草ＧＤＰ－Ｄ－甘露糖焦磷酸化酶基因的克隆及功能分析 　
１　引　言
ＧＤＰ－Ｄ－甘露糖焦磷酸化酶（ＧＤＰ－Ｄｍａｎｎｏｓｅ
ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ，ＧＭＰ）是维生素Ｃ（ＡｓＡ）生
物合成途径中的关键酶，负责催化Ｄ－１－Ｐ甘露糖
合成ＧＤＰ－Ｄ－甘露糖．维生素Ｃ是一种普遍存在于
植物组织的高丰度小分子抗氧化物质，它可以直
接与单线态氧（Ｏ２１）、超氧自由基（Ｏ２－）、过氧化氢（
Ｈ２Ｏ２）和羟自由基（ＨＯ－）等活性氧反应，因此，
ＧＭＰ作为ＡｓＡ的上游催化酶，在植物抵抗氧化
胁迫中具有重要作用［１　２　３　４］．
然而，目前对 ＧＭＰ基因的相关研究还比较
少，主要集中在ＧＭＰ基因对ＡｓＡ合成途径的影
响上，其中 Ｃｏｎｋｌｉｎ，Ｐ．Ｌ 等人发现拟南芥中
ＧＭＰ基因突变会导致突变株ｖｔｃｌ的ＡｓＡ比野生
株减少约三分之一［５］．一些研究者则进一步对
ＧＭＰ基因表达的改变所引起的后续生理指标或表
型变化进行了分析．李超汉等人通过在马铃薯中
超表达番茄ＧＭＰ基因，考察了ＧＭＰ基因对温度
胁迫的响应，发现超表达的两个株系其 ＧＭＰａｓｅ
活性、ＡｓＡ及ＡｓＡ氧化产物ＤＨＡ含量及其代谢
相关酶活性比正常株系都有增加［６］．Ｋｅｌｅｒ等人
对马铃薯的ＧＭＰ研究过程中发现实验组同对照
组相比出现了早衰现象［７］．
金发 草 （Ｐｏｇｏｎａｔｈｅｒｕｍ　ｐａｎｉｃｅｕｍ （Ｌａｍ．）
Ｈａｃｋ．）是一种在干旱贫瘠等极端环境下生长的禾
本科植物［８］．在我国西南、华中、华南等地区均有
广泛分布［９］，主要生长在水土流失严重，洪涝、干
旱等自然灾害多发地区，对逆境抵抗力极强［１０　１１］．
因而其自身对逆境的响应应十分敏感，与逆境抵
抗相关的基因及生理途径应较为保守．当前ＧＭＰ
基因仅从番茄［１２］、拟南芥［５］、番木瓜［１３］、桃等少数
植物中得到了分离．为了分析ＧＭＰ基因是否参与
抗氧化胁迫响应过程，研究选择金发草作为研究
材料，利用ｃＤＮＡ 末端快速扩增方法（ｒａｐｉｄ　ａｍ－
ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｅｎｄｓ，ＲＡＣＥ）获得了金发草
ＧＭＰ基因的ｃＤＮＡ全长序列．随后对ＧＭＰ基因
进行了生物信息学分析，丙二醛含量及电导率的
测定，干旱胁迫、盐胁迫及冷胁迫下的表达量分
析，同时检测了ＧＭＰ基因下游产物ＡｓＡ的含量．
金发草ＧＭＰ基因的克隆进一步丰富了ＧＭＰ基因
的序列资源，对ＧＭＰ的功能分析则表明ＧＭＰ在
植物逆境响应过程中具有重要作用．这些工作均
为深入研究ＧＭＰ基因的功能及利用提供了基础．
２　材料与方法
２．１　植物材料
金发草种子采自四川遂宁，经快速繁殖［１４］得
到大量供实植株．
２．２　菌株与试剂
大肠杆菌菌株 Ｔｏｐ１０由本实验室保存，ｐｕｆ
酶，Ｔａｑ酶、ｄＮＴＰｓ、ｐＭＤ１９－Ｔ 载体购自ＴａＫａＲａ
公司，琼脂糖凝胶回收试剂盒、植物基因组ＤＮＡ
提取试剂盒、ＲＮＡＰｒｅｐ　Ｐｕｒｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｋｉｔ购自天根生
化（北京、）科技有限公司，ＰＣＲ 引物合成和基因
测序由北京六合华大基因有限公司完成．质粒提
取试剂盒购自Ｏｍｅｇａ公司（Ｏｍｅｇａ，ＵＳＡ），其它
化学药品为进口或国产分析纯．
２．３　ＲＡＣＥ方法克隆ＧＭＰ基因的ｃＤＮＡ全长
利用ＴａＫａＲａ的反转录试剂盒，以金发草叶
片总ＲＮＡ为模板合成双链ｃＤＮＡ．通过本实验室
获得的金发草ＧＭＰ基因片段设计３′ＲＡＣＥ特异
引物：
３′ＲＡＣＥ引物序列：３′Ｐ１：５′－ＴＣＴＧＡＴＴＧ－
ＧＴＣＣＴＧＡＴＧＴＣＧ－３′；３′Ｐ２：５′－ＧＧＡＴＴＡＴ－
ＧＧＧＣＴＧＧＣＡＧＴＣＡ－３′；并设计２条通用引物
ＡＰ： ５′－ＧＣＴＧＴＣＡＡＣＧＡＴＡＣＧＣＴＡＣＧＴＡ－
ＡＣＧＧＣＡＴＧＡＣＡＧＴＧ（Ｔ）１８－３′和 ＡＰ１：５′－ＧＴ－
ＣＡＡＣＧＡＴＡＣＧＣＴＡＣＧＴＡＡＣＧ－３′，以合成的双
链ｃＤＮＡ为模板，３′Ｐ１和 ＡＰ为引物进行第一轮
ＰＣＲ，将所得产物用ｄｄＨ２Ｏ稀释２０倍为模板，３′
Ｐ２和ＡＰ１为引物进行第二轮ＰＣＲ．所得产物经
回收后克隆到ｐＭＤ１９－Ｔ 载体上，转化 Ｅ．ｃｏｌｉ
Ｔｏｐ１０感受态细胞．菌落经ＰＣＲ验证后，挑取阳
性菌落送往北京六合华大基因有限公司测序．将
所得序列在ＮＣＢＩ上进行比对分析．
根据３′端片段的测序结果，设计３个特异引
物５′Ｐ１：５′－ＣＴＴＣＴＣＡＡＣＡＡＡＣＣＴＴＴＣＣＡＣＣ－
３′；５′Ｐ２：５′－ＧＧＴＴＣＡＧＴＡＡＧＴＡＡＡＴＣＣＣＡＧ－
ＣＡＴ－３′ ；５′Ｐ３：５′－ＣＴＣＡＧＴＴＣＡＡＴＧＣＧＧＴ－
ＣＡＡＧＧ　ＣＴＣＡＧＴＴＣＡＡＴＧＣＧＧＴＣＡＡＧＧ－３′；
结合上面提到的通用引物ＡＰ和ＡＰ１进行５′端扩
增．扩增产物经电泳检测后回收，构建到ｐＭＤ１９－
Ｔ载体上，取阳性菌落送北京六合华大基因有限
公司测序．所得序列用ＮＣＢＩ进行比对分析．
２．４　ＧＭＰ全长ｃＤＮＡ的获得
根据基因的３′和５′测序结果，拼接后得到
ＧＭＰ基因ｃＤＮＡ全长．将全长序列及其翻译的氨
３８６
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５２卷
基酸序列用 ＮＣＢＩ数据库比较分析，确定基因的
编码区，设计开放性阅读框的特异引物：ＧＭＰ－Ｆ：
５′－ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＡＧＧＣＧＣＴＣＡＴＴＣＴＴ－
３′；ＧＭＰ－Ｒ：５′－ＣＧＡＧＣＴＣＴＣＡＣＡＴＧＡＣＧＡＴ
ＣＴＣＡＧＧＣ－３′．分别以 ＤＮＡ 和ｃＤＮＡ 为模板，
利用基因特异引物 ＧＭＰ－Ｆ和 ＧＭＰ－Ｒ进行ＰＣＲ
扩增，将所得的产物测序验证．
２．５　ＧＭＰ生物信息学分析
测序结果用ＤＮＡＭＡＮ软件进行拼接和比对
分析，用ＧＥＮＳＣＡＮ预测蛋白的氨基酸序列；用
ＮＣＢＩ网站的Ｂｌａｓｔｎ和Ｂｌａｓｔｘ工具进行基因及蛋
白质同源性搜索；用 ＮＣＢＩ网站的ＣＤＤ（ｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｃｄｄ／ｗｒｐｓｂ．
ｃｇｉ）进行氨基酸序列结构域分析［１５］；用 ＭＥＧＡ　５．
１软件构建分子进化树．
２．６　金发草ＧＭＰ基因非生物胁迫表达模式分析
三种逆境处理方式 对三组金发草植株分别进
行３０％ＰＥＧ４０００的干旱处理，２００ｍＭ　ＮａＣｌ的盐
处理，以及８℃／４℃的冷处理，采集０ｄ，１ｄ，３ｄ，
５ｄ，７ｄ的叶片，用液氮速冻，－８０℃保存备用．
金发草ＧＭＰ的表达分析 提取不同处理后的金
发草总ＲＮＡ，分别逆转录为单链ｃＤＮＡ．以金发草
的５．８Ｓ基因为内参，采用ＳｓｏＦａｓｔｔｍＥｖａＧｒｅｅｎ?Ｓａ－
ｐｅｒｍｉｘ试剂盒对金发草Ｐｐ－ＧＭＰａｓｅ基因进行ＲＴ－
ＰＣＲ扩增（引物１：５′－ＡＴＡＴＧＧＡＧＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴ－
ＧＧＡＧＧＡＧ －３′；引 物 ２：５′－ＣＧＧＴＣＡＡＧＧＡＣＡ
ＧＡＴＧＧＧＴＴＣＡ－３′．），测定ＧＭＰａｓｅ基因表达量．
所得数据按Ｂｕｂｎｅｒ等［１６］的Ｃｔ（２－ΔΔＣｔ）法计算目的
基因的相对表达量．
２．７　电导率、ＭＤＡ及抗坏血酸的含量测定
抗坏血酸包括维生素Ｃ（ＡｓＡ）和脱氢抗坏血
酸（ＤＨＡ），测定抗坏血酸，取０．５ｇ叶片于５％的
偏磷酸中研磨成匀浆，４℃１２　０００ｇ离心１０ｍｉｎ，
取上清取０．３ｍＬ上清液，加入０．７５ｍＬ含５
ｍｍｏｌ．Ｌ－１ＥＤＴＡ的磷酸缓冲液（１５０ｍ ｍｍｏｌ．Ｌ－
１，ｐＨ　７．４）和０．１５ｍＬ　１０ｍｍｏｌ．Ｌ－１的二硫苏糖
醇溶液（ＤＴＴ）．室温下放置１０ｍｉｎ后，加入０．１５
ｍＬ　０．５％ Ｎ－乙基马来酰亚胺，加入０．６ｍＬ的
１０％三氯乙酸（ＴＣＡ）、０．６ｍＬ的４４％正磷酸溶
液、０．６ｍＬ的０．５％ＢＰ－乙醇溶液和０．１５ｍＬ的０．
３％（Ｗ／Ｖ）ＦｅＣｌ３溶液．混匀后４０℃水浴４０ｍｉｎ，
测５２５ｎｍ处的吸光值［１７］．参照Ｋｕｍａｒ等［１８］的方
法测定丙二醛（ＭＤＡ）含量．电导率测定参照王学
奎等［１９］的方法利用电导率测定仪进行测试．
３　结果和分析
３．１　ＧＭＰ全长的克隆
以金发草ｃＤＮＡ为模板，在已获得的中间保
守序列基础上，设计３′ＲＡＣＥ引物，进行２轮
ＰＣＲ扩增，电泳检测得到一条大约为４９０ｂｐ的特
异条带（图１Ｂ），将条带回收、测序，测序结果在
ＮＣＢＩ数据库进行 Ｂｌａｓｔｎ比对分析，确定获得
ＧＭＰ基因的３′端序列．根据已获得的中间片段和
３′端序列，设计特异引物进行５′ＲＡＣＥ扩增，获得
长度大约为７５０ｂｐ（图１Ｃ）的５′端序列．将３′端序
列、５′端序列及已知的中间序列进行拼接，设计扩
增全长基因的引物，ＰＣＲ扩增得到约１０００ｂｐ的条
带．将该条带经亚克隆测序表明，该片段序列为
１０８６ｂｐ．通过Ｂｌａｓｔ比较分析此序列与其他物种
的ＧＭＰ基因序列具有较高的同源性，推断为金
发草 ＧＭＰ基因，命名为 Ｐｐ－ＧＭＰａｓｅ，ＧｅｎＢａｎｋ
登录号为ＫＦ５８６８４１．
图１　ＧＭＰ　３′ｒａｃｅ扩增产物、５′ｒａｃｅ扩增产物和金发草总ＲＮＡ
Ｍ：ＤＬ２０００ｍａｋｅｒ，１：金发草总ＲＮＡ，２：３′ｒａｃｅ扩增产物，３：５′ｒａｃｅ扩增产物
Ｆｉｇ．１　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　３′ａｎｄ　５′ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ＧＭＰ，ＲＮＡ　ｆｒｏｍ　Ｐｏｇｏｎａｔｈｅｒｕｍ　ｐａｎｉｃｅｕｍ
４８６
第３期 　　 范林洪，等：金发草ＧＤＰ－Ｄ－甘露糖焦磷酸化酶基因的克隆及功能分析 　
３．２　ＧＭＰ基因基因组序列分析
利用扩增Ｐｐ－ＧＭＰａｓｅ　ＯＲＦ的引物，以基因
组ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，获得１条１８００ｂｐ
左右的条带，将该条带亚克隆测序分析发现，该
基因含有４个外显子、３个内含子（图２Ｂ）．内含
子大小分别为５８６、８７和６９ｂｐ，内含子和外显子边
界符合ＧＴ－ＡＧ规则［２０］．
图２　ＧＭＰ的ｃＤＮＡ全长、ＯＲＦ的克隆及外显子分
析
Ａ：Ｍ表示ＤＬ２０００ｍａｋｅｒ，１表示金发草ｃＤＮＡ，２表示
金发草ＤＮＡ全长；Ｂ：灰框表示外显子，黑线表示内含子
Ｆｉｇ．２　 Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈＧＭＰ　ａｎｄ
ＯＲＦ３ａｎｄ　ｅｘｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ｒｅｇｉｏｎ
３．３　ＧＭＰ基因生物信息学分析
对获得的Ｐｐ－ＧＭＰａｓｅ　ｃＤＮＡ序列进行生物信
息学分析，结果表明：该基因开放阅读框全长为
１０８６ｂｐ，编码３６１个氨基酸，分子式为Ｃ１７８７Ｈ２８７４
Ｎ４７４Ｏ５０９Ｓ１７，蛋白质分子量约为３９．６８ｋｕ，理论等
电点ｐＩ＝６．３３，理论推导半衰期为３０ｈ，不稳定
参数为３０．４９，属于稳定蛋白．同源性分析结果表
明，金发草 ＧＭＰ与玉米、水稻、猕猴桃、烟草、拟
南芥、番木薯ＧＭＰ的同源性分别为９８．０６％、９３．
０７％、８８．６４％、８６．９８％、８７．５３％、８６．４３％，在
ＮＣＢＩ网站上将氨基酸序列进行ＣＤＤ搜索，发现
该蛋白质具有一个 ＧＤＰ－葡萄糖结合位点，在Ｃ－
末端包含六肽重复序列的左手平行的β－螺旋
（ＬＢＨ）域，该结构域具有酰基转移酶活性（图３）．
将金发草的ＧＭＰ蛋白与来自其他高等植物、
真菌、高等动物和细菌的ＧＭＰ蛋白进行多序列比
对，用 ＭＥＧＡ５．１软件的 ＮＪ法构建系统进化树
（图４）．结果表明这些蛋白有一个共同的祖先，之
后进化成不同的类群，金发草与二穗短柄草、可
可、番茄、桃、拟南芥的高等植物先聚为一类，再相
继与真菌，高等动物、细菌等聚类，聚类结果和物
种分类学结果基本一致．
３．４　胁通处理下 ＭＤＡ含量和电导率测定的结果
植物体内，自由基作用于脂质，使其发生过
氧化反应，氧化终产物为丙二醛，会引起蛋白质、
核酸等生命大分子的交联聚合，且具有细胞毒性．
因此，丙二醛的含量可以反映植物受伤害的程度．
实验测定金发草在冷、盐、旱三种处理下的丙二醛
含量（图５Ａ），结果表明，在三种处理后的７天里，
丙二醛的含量不断上升，表明植物受到胁迫的伤
害也在不断增加．
在植物在逆境下，细胞膜膜透性增大，细胞
内的电解质外渗，从而使植物的电导率增加．因
此植物电导率的大小与逆境胁迫强度正相关［１９］．
实验测定金发草在三种胁迫下的电导率，结果如
图５Ｂ，由图可知金发草电导率的大小随着冷、盐、
旱胁迫时间的增加不断增大，在处理７后电导率
分别比没处理的增高了９０％、９１％和９３％，说明
植物受到的胁迫伤害在不断加深．
３．５　协迫处理下ＧＭＰ相对表达量的变化
如图５Ｃ所示，金发草ＧＭＰ基因在盐处理后
变化最明显，在２００ｍＭ 的盐处理７２ｈ后表达量
是处理前的３．５倍；在８℃／４℃冷处理和干旱处理
后 ＧＭＰ 的表达量也显著性升高；结果显示，
ＧＭＰ基因的表达量和盐胁迫、冷胁迫、干旱胁迫成
正相关，推测是因为ＧＭＰ基因对逆境下的植物做
出响应，从而达到调节其抗逆机制．前人结果表
明ＧＭＰ基因是合成维生素Ｃ的关键酶，且维生
素Ｃ在植物抗逆性中发挥着重要作用，同本研究
结果一致．
３．６　抗坏血酸含量测定
通过测定冷处理、盐处理和旱处理不同时间的
抗坏血酸（包含ＡＳＡ　ａｎｄ　ＤＨＡ）含量（图５Ｄ），发
现随着时间推移都有所升高，但在第５ｄ后又有
所下降，原因可能是由于处理条件下，不利于植
物生长所致．由于抗坏血酸的合成受ＧＭＰ酶基因
限制，所以推论ＧＭＰ酶基因表达量升高，促使了
抗坏血酸含量升高．
５８６
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５２卷
图３　金发草ＧＭＰ蛋白序列的ＢＬＡＳＴ分析
＊表示ＧＤＰ－葡萄糖结合位点，Δ表示辅酶Ａ结合位点
Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅ　ＢＬＡＳＴ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ＧＭＰ　ｐｒｏｔｅｉｎ
图４　ＧＭＰ蛋白分子进化分析
Ｆｉｇ．４　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＧＭＰ
Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ　ｃａｃａｏ（ＥＯＹ１８０２１．１）；Ｓｏｌａｎｕｍ　ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ（ＮＰ＿００１２３４０２５．１）；Ｐｒｕｎｕｓ　ｐｅｒｓｉｃａ（ＢＡＨ０３２９８．１）；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｔｈａｌｉａｎａ（ＮＰ＿１８１５０７．１）；Ｂｒａｃｈｙｐｏ　ｄｉｕｍｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ（ＸＰ＿００３５５８２６１．１）；Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ　ｏｒｙｚａｅ（ＸＰ＿００１８２０１７２．２）；Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ　ｉｍ－
ｍｉｔｉｓ（ＸＰ＿００１２４７８０５．１）；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ　ｓｆｌａｖｕｓ（ＸＰ＿００２３７４２６０．１）；Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｏｘａｌｉｃｕｍ（ＥＰＳ３３４９６．１）；Ｓｏｒｅｘ　ａｒａｎｅｕｓ（ＡＣＥ７７６５７．
１）；Ｓｕｓ　ｓｃｒｏｆａ（ＮＰ＿００１２３１５８７．１）；Ｍａｃａｃａ　ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（ＢＡＥ８７２５８．１）；Ｌｏｘｏｄｏｎｔａ　ａｆｒｉｃａｎａ（ＸＰ＿００３４０６０９５．１）；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
（ＢＡＡ０７７４５．１）；Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＷＰ＿０１９７２５１９７．１）
６８６
第３期 　　 范林洪，等：金发草ＧＤＰ－Ｄ－甘露糖焦磷酸化酶基因的克隆及功能分析 　
图５　冷、盐、旱处理下金发草叶片各个物质的变化
Ａ：表示三种处理下丙二醛的含量变化；Ｂ：表示三种处理下电导率变化；Ｃ：表示三种不同处理下 ＡｓＡ和ＤＨＡ的含量变化；
Ｄ：表示三种不同处理ＧＭＰ相对表达量的变化；＊表示Ｐ＜０．０１
Ｆｉｇ．５　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｔｒｅｓｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ＭＤＡ，Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ　ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ，ＡＳＡ　ａｎｄ　ＤＨＡ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ａｎｄ　ＧＭＰａｓｅ　ｍＲＮＡ
ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
４　讨　论
ＧＭＰ是植物维生素Ｃ生物合成的第一个关
键酶．Ｃｒｏｎｊｅ，Ｃ．等［２１］研究发现，在番茄中过表
达酵母的ＧＭＰ基因，使得ＡｓＡ的含量在叶中升
高７０％，绿色果中升高了５０％，红色果中升高了
３５％，说明该基因的确是 ＡｓＡ 生物合成的关键
酶，它的表达和ＡｓＡ积累密切相关．
金发草主要分布在水土流失较为严重、极易遭
受干旱、洪涝等自然灾害的地区，对逆境的抵抗能
力极强［１０］．研究克隆金发草的 ＧＭＰ基因，命名
为Ｐｐ－ＧＭＰａｓｅ基因，并进行生物信息学分析，研
究其在逆境中的作用，通过分析表明，Ｐｐ－ＧＭ－
Ｐａｓｅ基因具有 ＧＭＰ基因的相应结构，是合成金
发草抗坏血酸的关键酶，推测该基因在植物抵抗
逆境中发挥做重要作用．
ＡｓＡ作为重要抗氧化剂，是植物光保护、细胞
生长和发育等方面不可缺少的物质．许多研究表
明ＡｓＡ与植物的抗逆性密切相关．Ｂａｒｔｈ等［２２］研
究表明，拟南芥突变植株ｖｔｃ１因缺乏ＡＳＡ，植株
对氧化损伤的抵抗力降低使得植株过早进入衰老
阶段．黄文敏等［２３］发现，外源的ＡｓＡ对促进细胞
生长分裂，维持细胞抗氧化功能等方面起着重要
作用．李汉超等［２４］过表达番茄的 ＧＭＰ基因，发
现两个转基因株系比野生型植株的抗坏血酸含量
增加，且耐低温能力增强．本研究对金发草进行
了冷、盐、旱三个胁迫处理，比较在各个胁迫下Ｐｐ－
ＧＭＰａｓｅ基因表达量，发现其表达水平比在正常
条件下有显著升高，同时测定其下游催化产物抗
坏血酸含量，发现也随之升高，说明Ｐｐ－ＧＭＰａｓｅ
在金发草抵抗氧化胁迫中起着重要作用，这与前
人研究结果基本一致．
研究通过对金发草ＧＭＰ基因的克隆及分析，
阐明了Ｐｐ－ＧＭＰａｓｅ基因系列信息和结构特点．分
７８６
　 四川大学学报（自然科学版） 　 第５２卷
析金发草非生物胁迫（冷、盐和干旱胁迫）中该基因
表达模式和抗坏血酸的含量，推论Ｐｐ－ＧＭＰａｓｅ基
因在植物抗逆中具有重要作用．同时，本研究为
进一步考察Ｐｐ－ＧＭＰａｓｅ基因功能及作用机理提供
了条件，为利用基因工程技术提高植物抗逆性、延
缓植物衰老奠定了基础．
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