全 文 ：玻璃化法超低温保存对大叶藻种子活力的影响*
张凌宇 张沛东
＊＊
田 璐 孙 燕 张秀梅
(中国海洋大学水产学院，山东青岛 266003)
摘 要 通过设置玻璃化法超低温保存的 3 个关键要素，即冰冻保护液处理、玻璃化溶液
脱水时间和冷冻处理，研究了玻璃化法超低温保存对大叶藻种子活力的影响。结果表明:
冰冻保护液处理和玻璃化溶液脱水时间对大叶藻种子活力无显著影响;冷冻处理组种子活
力显著低于对照组，而冰冻保护液和玻璃化脱水处理对冷冻后种子活力的影响不显著，表
明冰冻保护液和玻璃化溶液未对种子起到明显的保护作用;未冰冻保护液处理组玻璃化溶
液脱水 4 h时种子活力显著低于其他脱水时间，而冰冻保护液处理组脱水 4 h 时与其他脱
水时间无明显不同，表明较长时间的玻璃化溶液脱水处理需使用冰冻保护液进行预处理。
研究结果为超低温保存大叶藻种子提供了参考。
关键词 大叶藻;种子;超低温保存;玻璃化;生活力
中图分类号 S937． 3 文献标识码 A 文章编号 1000－4890(2013)2－0501－06
Effects of cryopreservation by vitrification on the viability of eelgrass Zostera marina
seeds． ZHANG Ling-yu，ZHANG Pei-dong＊＊，TIAN Lu，SUN Yan，ZHANG Xiu-mei (Col-
lege of Fisheries，Ocean University of China，Qingdao 266003，Shandong，China)． Chinese Jour-
nal of Ecology，2013，32(2) :501－506．
Abstract:In this paper，three key factors of cryopreservation by vitrification，i． e．，cryoprotec-
tive solution application，dehydration time of vitrification solution，and rapid freezing，were
installed to study the effects of cryopreservation by vitrification on the viability of Zostera marina
seeds． Cryoprotective solution application and dehydration time had no significant effects on the
viability of the seeds． When exposed to rapid freezing，the viability of the seeds was significantly
lower than that of the control，while cryoprotective solution application and dehydration time
showed no significant protective effects on the viability of the seeds． Without cryoprotective solu-
tion application，the viability of the seeds subjected to 4 h dehydration was significantly lower
than that of the seeds subjected to other lengths of dehydration time． With cryoprotective solution
application，no significant difference was found between the viability of the seeds subjected to 4 h
dehydration and that of the seeds subjected to other lengths of dehydration time． These findings
indicated the necessity of cryoprotective solution application to seeds prior to the long period
dehydration by vitrification． This study provides a reference for the cryopreservation of Z． mari-
na seeds．
Key words:Zostera marina;seed;cryopreservation;vitrification;viability．
* 国家自然科学基金项目(30400615)、山东省优秀中青年科学家奖
励基金项目 (BS2011HZ017)和海洋公益性行业科研专项
(2013418043)资助。
＊＊通讯作者 E-mail:zhangpdsg@ ouc． edu． cn
收稿日期:2012-09-10 接受日期:2012-11-11
海草床是三大典型海洋生态系统之一，具有特
别高的生物量和生产力，不仅为许多生物种类提供
潜在的食物和多样的生境及繁育、隐蔽场所，而且在
捕获沉积物、稳定底泥、防风固堤、净化水体、营养物
质循环、固碳(约占整个海洋生态系统每年固碳量
15%)等方面也具有至关重要的作用(Green ＆
Short，2003;沈国英等，2010;Royo et al．，2011)。
然而，由于自然因素和人类活动的影响，世界范围内
几乎所有的海草床正处于不断衰退之中。研究表
明，海草种子在保持种群结构和遗传多样性、维持海
草床及发展新的斑块草床等方面具有巨大的潜在贡
献，而且受到干扰的海草床利用种子进行修复要比
单纯利用营养繁殖修复的时间短，这说明海草种子
生态学杂志 Chinese Journal of Ecology 2013，32(2) :501－506
DOI:10.13292/j.1000-4890.2013.0150
在受损海草床的修复过程中具有重要作用(Orth
et al．，2006;张沛东等，2011)。
超低温保存(cryopreservation)通常使用液氮在
极端温度(－196 ℃)保存生物材料，是现阶段唯一
的一种可以长期保存不同种质资源的安全有效途径
(Engelmann，2004)。其中玻璃化法(vitrification)是
超低温保存的一种，在将材料投入液氮前，利用高浓
度的复合保护剂在 25 ℃或 0 ℃下对材料进行脱水
处理，是植物组织和器官超低温保存的一种有效方
法(Fahy et al．，1984;Takagi，2000;Thammasiri，
2000;Popova et al．，2003)。目前，成功使用玻璃化
法超低温保存的植物种类已达 130 余种(Sakai ＆
Engelmann，2007) ，保存的材料主要集中在种子
(Hirano et al．，2005;何明高等，2010)、原球茎
(Wang et al．，1998)、细胞(Sakai et al．，1990)、花粉
(Kobayashi et al．，1978)、茎尖(Towill，1990;Niino
et al．，1992，2003;周旭红等，2011)、合子胚(Pence，
1991;Ishikawa et al．，1997)等。然而，有关利用玻璃
化法超低温保存海洋高等植物种质资源的研究还未
见报道。
大叶藻(Zostera marina)是分布于中国北方海
域的优势海草种类，属大叶藻科(Zosteraceae)、大叶
藻属(Zostera) (范航清等，2009)。本文以大叶藻为
对象，研究了玻璃化法对大叶藻种子活力的影响，评
价了玻璃化法对大叶藻种子的超低温保存效果，以
期探究超低温保存海洋高等植物种子的可行性，并
为大叶藻种子资源的保护提供参考。
1 材料与方法
1. 1 大叶藻种子的采集与暂养
实验用大叶藻种子于 2011 年 7 月采集于山东
省 荣 成 市 天 鹅 湖(37. 3382°N—37. 3588°N，
122. 5551°E—122. 5793°E)。采集的种子暂养于实
验室，水温 15±0. 5 ℃、盐度 31±1、连续充氧、每日换
水一次。
1. 2 实验设计
玻璃化法超低温保存技术包括材料选择、冰冻
保护液处理、玻璃化溶液脱水处理、冰冻、解冻与洗
涤等 5 个过程，本文着重研究其中 3 个关键要素，即
冰冻保护液处理、玻璃化溶液脱水处理及冰冻处理，
对大叶藻种子活力的影响。其中冰冻保护液处理设
置为未处理和处理 2 个水平，玻璃化溶液脱水时间
设置为0、1、2、3和4 h等5个水平，冷冻处理设置
表 1 实验处理
Table 1 Experimental treatments
组 别 处 理
冰冻保护液
处理
玻璃化溶液
脱水时间(h)
冻存处理
C
Q1
Q2
Q3
Q4
Q5
Q6
Q7
Q8
Q9
L1
L2
L3
L4
L5
L6
L7
L8
L9
L10
无
无
无
无
无
有
有
有
有
有
无
无
无
无
无
有
有
有
有
有
0
1
2
3
4
0
1
2
3
4
0
1
2
3
4
0
1
2
3
4
无
无
无
无
无
无
无
无
无
无
有
有
有
有
有
有
有
有
有
有
C，对照组;Q，前处理实验组，研究冰冻保护液和玻璃化溶液脱水时
间对种子活力的影响;L，冷冻处理实验组，研究冰冻保护液和玻璃
化溶液脱水时间对种子超低温保存的影响及超低温保存对种子活力
的影响。
为未处理和处理 2 个水平，经相互组合，形成 20 个
实验处理组(表 1)。
1. 3 实验过程
每个处理组设 3 个重复，每个重复使用 500 粒
大叶藻种子。暂养结束后，随机挑选成熟饱满的种
子 30000 粒，75%酒精溶液浸泡 30 s，无菌海水冲洗
2 次，再用 0. 1% HgCl2 浸泡 15 min，无菌海水冲洗 3
次，平均分配到每个重复。玻璃化法参照 Hirano 等
(2005)的方法进行，其中冰冻保护液处理时间设置
为 6 h;玻璃化溶液脱水于 0 ℃条件下进行;冷冻处
理时间设置为 48 h;解冻与洗涤为 38 ℃水浴条件下
解冻 3 min。实验结束后，立即于每个重复中随机选
取种子 100 粒，测定种子活力。
1. 4 数据处理
通过测定种子生活力(TTCH)、电导率以及相
对电导率评价大叶藻种子活力。这 3 个指标已经被
国际种子检验协会(ISTA)纳入《种子活力测定方法
手册》，且电导率亦被纳入《国际种子检验规程》(颜
启传和邓光联，1996) ，是目前最常用的检测种子活
力的指标。
随机取大叶藻种子 50 粒，利用 TTC 定量法测
定种子的生活力(mg·g－1) (胡晋，2006)。种子去
除种皮，剥出种胚，加入 10 mL 0. 1% TTC 溶液，于
38 ℃恒温水浴、黑暗条件下染色 2 h，再经研磨、离
205 生态学杂志 第 32 卷 第 2 期
心，于 490 nm处测定光密度值。
另取大叶藻种子 50 粒，按照《国际种子检验规
程》(颜启传和邓光联，1996)测定种子的电导
率(μS·cm－1·g－1)和相对电导率(%)。将种子擦
干后称重(m) ，装入 100 mL 烧杯中，加入 80 mL 超
纯水，在 20 ℃生物培养箱中放置 24 h 后测定电导
值(C1) ，然后将浸泡液连同种子在沸水中煮 30
min，冷却至 20 ℃后再测定电导值(C2) ，以超纯水
的电导值为初始值(C0)。计算电导值(C)和相对电
导率(RC)。计算公式 C = (C1 －C0)/m;RC = (C1 －
C0)/(C2 －C0)×100%。
使用 SPSS 17. 0 软件对数据进行单因素方差分
析(one-way ANOVA)和独立样本 T 检验，以 α = 0. 05
作为差异显著水平。利用 Orgin 8. 5软件绘图。
2 结果与分析
2. 1 冰冻保护液处理和玻璃化溶液脱水时间对大
叶藻种子活力的影响
2. 1. 1 定量 TTCH 浓度 对照组大叶藻种子的
TTCH浓度平均为 1. 028±0. 065 mg·g－1;T 检验表
明，同一脱水时间下，除脱水时间为 2 h 时未冰冻保
护液处理和冰冻保护液处理大叶藻种子的 TTCH浓
度存在显著差异外，其余各脱水时间两者之间均无
明显不同;单因素方差分析显示，不同脱水时间下，
未冰冻保护液处理组中对照组种子 TTCH浓度显著
高于其他处理组，而其余各处理组之间无明显不同，
冰冻保护液处理组之间大叶藻种子 TTCH浓度亦无
显著差异(图 1)。
图 1 冰冻保护液处理和玻璃化溶液脱水时间对大叶藻种
子 TTCH浓度的影响
Fig． 1 Effects of cryoprotective solution application and
dehydration time of vitrification solution on TTCH concen-
trations of Zostera marina seeds
* 表示同一簇中数据存在显著差异(P＜0. 05) ，不同小写字母表示
不同脱水时间同组数据差异显著(P＜0. 05)。
2. 1. 2 电导率和相对电导率 对照组大叶藻种子
的电导率和相对电导率分别为 84. 6 ± 4. 33
μS·cm－1·g－1 和(37. 2 ±1. 50)%;T 检验表明，同
一脱水时间下，除脱水时间为 1 h 时未冰冻保护液
处理组大叶藻种子的电导率显著高于冰冻保护液处
理组外，其余各脱水时间两者的电导率和相对电导
率均无显著差异;单因素方差分析显示，不同脱水时
间下，未冰冻保护液处理组和冰冻保护液处理组大
叶藻种子的电导率和相对电导率均无明显不
同(图 2)。
2. 2 超低温保存对大叶藻种子活力的影响
2. 2. 1 定量 TTCH浓度 不同脱水时间下，单因素
方差分析显示，未冰冻保护液处理+玻璃化溶液脱
水+冷冻处理组及冰冻保护液处理+玻璃化溶液脱
水+冷冻处理组大叶藻种子 TTCH 浓度均无显著差
异;相同脱水时间下，单因素方差分析表明，对照组
大叶藻种子的 TTCH浓度极显著地高于其他两个冷
冻处理组，而未冰冻保护液处理组和冰冻保护液处
理组之间无明显不同(图 3)。
2. 2. 2 电导率和相对电导率 对电导率而言，不同
图 2 冰冻保护液处理和玻璃化溶液脱水时间对大叶藻种
子电导率(A)和相对电导率(B)的影响
Fig． 2 Effects of cryoprotective solution application and
dehydration time of vitrification solution on the conductivity
(A)and relative conductivity (B)of Zostera marina seeds
* 表示同一簇中数据存在显著差异(P＜0. 05)。
305张凌宇等:玻璃化法超低温保存对大叶藻种子活力的影响
图 3 冰冻对大叶藻种子 TTCH浓度的影响
Fig． 3 Effect of rapid freezing on TTCH concentrations of
Zostera marina seeds
同一簇中不同小写字母表示数据存在显著差异(P＜0. 05)。
图 4 冰冻对大叶藻种子电导率和相对电导率的影响
Fig． 4 Effect of rapid freezing on the conductivity (A)and
relative conductivity (B)of Zostera marina seeds
同一簇中不同小写字母及同一列中不同数字表示数据存在显著差异
(P＜0. 05)。
脱水时间下，未冰冻保护液处理+玻璃化溶液脱水+
冷冻处理组中脱水时间为 4 h时大叶藻种子的电导
率达到 176. 4 μS·cm－1·g－1，显著高于其他脱水时
间，而其他脱水时间之间无明显不同;冰冻保护液处
理+玻璃化溶液脱水+冷冻处理组大叶藻种子的电
导率在不同脱水时间之间无显著差异。相同脱水时
间下，单因素方差分析表明，对照组大叶藻种子的电
导率显著低于其他 2 个冰冻处理组，而未冰冻保护
液处理组和冰冻保护液处理组之间无明显不同(图
4A)。
对相对电导率而言，不同脱水时间下，未经冰冻
保护液处理+玻璃化溶液脱水+冷冻处理组中脱水
时间为 4 h时大叶藻种子的相对电导率最高，达到
66. 6%，显著高于脱水时间为 0、1 和 2 h 处理组，而
与脱水时间为 3 h 处理组之间无显著差异;冰冻保
护液处理+玻璃化溶液脱水+冷冻处理组大叶藻种
子的相对电导率在不同脱水时间条件下无明显不
同。相同脱水时间下，单因素方差分析表明对照组
大叶藻种子的相对电导率显著低于其他 2 个冻存处
理组，而未经冰冻保护液处理组和冰冻保护液处理
组之间无明显不同(图 4B)。
3 讨 论
3. 1 冰冻保护液处理对大叶藻种子活力的影响
在玻璃化法超低温保存种质资源时，通常使用
高剂量的可溶性糖类作为冰冻保护液对种质资源进
行预处理，这对于提高超低温保存细胞和组织的存
活率极为有效(Uragami et al．，1989;Yamada et al．，
1991) ，因为糖类能够提高溶液的粘滞度，促进玻璃
态的形成，并由此保持膜和蛋白结构的稳定(文彬，
2011)。也有研究表明，蔗糖引起的高渗透压能够
诱导内源性脱落酸的形成(Buchheim et al．，1989) ，
促进种子休眠并抑制种子的吸涨作用，从而保持种
子的低含水量(葛苏洁和李淑娟，2011)。Hirano 等
(2005)研究发现，玻璃化法超低温保存白芨(Bletil-
la striata)种子时，含有 0. 3 mol·L－1 蔗糖的冷冻保
护液处理能够提高种子的生活力，授粉后 3 个月的
种子进行含有预处理的玻璃化保存，其种子活力与
对照组差异不显著，而对石楠(Photinia serrulata)茎
尖的玻璃化超低温保存则不需要进行含可溶性糖类
的预处理(王越和刘燕，2006) ，这说明玻璃化法超
低温保存种质资源时应该根据种质资源的种类和保
存材料来判断是否需要进行冷冻保护液处理。本实
验结果发现，除脱水时间为 4 h 外，其他各脱水时间
冷冻保护液处理组大叶藻种子的 TTCH浓度均高于
未冷冻保护液处理组，而电导率和相对电导率均低
于未冷冻保护液处理组(图 1、图 2) ，说明冷冻保护
液对大叶藻种子的预处理能够提高种子的生活力。
本研究结果与 Hirano 等(2005)对白芨种子超低温
405 生态学杂志 第 32 卷 第 2 期
保存的研究结果一致。冷冻保护液处理能够提高大
叶藻种子的生活力可能是因为可溶性糖是植物体内
的保护性物质，对植物抵抗低温和脱水胁迫都有益
处(文彬，2011)。
3. 2 脱水时间对大叶藻种子活力的影响
玻璃化溶液脱水处理是玻璃化法超低温保存种
质资源的关键步骤之一。PVS2 溶液是最常用的一
种玻璃化溶液脱水剂，可以促进植物材料玻璃化状
态的形成，具有一定的毒性，且毒性的大小与浓度的
高低和浸泡时间的长短直接相关(Matsumoto et al．，
1994)。脱水时间取决于材料的特性，包括植物的
基因型、抗冻性及细胞的年龄、生理状态等，处理时
间过长可能会导致材料的过度脱水而使细胞受损
(Niino et al．，1992)。不同植物材料的最佳脱水时
间各不相同并与脱水时的环境温度有关。如使用
PVS2 玻璃化溶液对束花石斛(Dendrobium chrysan-
thum)种子脱水处理 45 min(何明高等，2010) ，姜
(Zingiber officinale)的成熟芽在 25 ℃下脱水处理 40
min(Yamuna et al．，2007) ，灯心草(Juncus spp. )的
茎芽在 25 ℃ 下脱水处理 30 min(Niino et al．，
2007)。本实验结果发现，不同脱水时间下各处理
组之间大叶藻种子的 TTCH 浓度、电导率和相对电
导率均无显著差异(图 1、图 2) ，表明 4 h 内的脱水
处理 PVS2 溶液未对大叶藻种子产生毒害作用。同
时也说明，4 h内的 PVS2 玻璃化溶液脱水处理大叶
藻种子可能没有得到充分的脱水，然而上述植物组
织在各自的脱水条件和脱水时间下均取得了良好的
保存效果，这可能是由于大叶藻种子种皮较厚，在本
实验设置的玻璃化溶液浓度和处理时间条件下不能
充分脱水，从而影响超低温保存后种子的活力。
3. 3 玻璃化法对大叶藻种子的保存效果
玻璃化法是目前较为理想的植物种质资源长期
稳定的超低温保存方法，其设备要求简单、材料处理
简便，具有广泛的应用前景(Takagi et al．，1998;En-
gelmann，2004)。超低温保存中保存材料的选择至
关重要，因为不同材料的遗传组成并不完全相同
(奎丽梅等，2009;唐一春等，2009;陈永霞等，
2010;李卫芬等，2010)。以生物多样性保护为目的
的超低温保存，应该尽可能保存完整的种子或胚轴
(文彬，2011) ，因此本实验选择大叶藻种子作为超
低温保存材料。
本实验结果发现，无论是否进行冷冻保护液和
玻璃化溶液脱水处理，冷冻后大叶藻种子的活力均
比对照组显著降低(图 3、图 4) ，这可能是因为:(1)
冷冻保护液处理强度不够，虽然冷冻保护液处理后
大叶藻种子活力提高，但与未冷冻保护液处理组无
显著差异(图 1、图 2) ;此外，单因素方差分析显示，
经冷冻后未冷冻保护液处理组和冷冻保护液处理组
之间大叶藻种子活力无明显不同(图 3、图 4) ，说明
本实验使用的冷冻保护液浓度过低或是处理时间不
够;(2)玻璃化溶液脱水时间不够，本实验设置
了 0 ～ 4 h 的脱水时间，结果发现，不同脱水时间下
各处理组之间大叶藻种子活力均无显著差异(图 1、
图 2) ;此外，单因素方差分析显示，大叶藻种子经冷
冻后，除未冷冻保护液处理组的电导率和相对电导
率外，不同脱水时间条件下各处理组之间的 TTCH
浓度、电导率和相对电导率均无明显不同(图 3、图
4) ，表明大叶藻种子可能没有得到充分的脱水，从
而影响种子的超低温保存效果; (3)解冻过程中升
温较慢，大叶藻种子出现脱玻璃化，导致细胞内冰晶
形成以及原生质各组分之间发生分割，伤害质膜和
细胞器，从而导致种子活力的下降(文彬，2011)。
结果还发现，经冷冻后未冷冻保护液处理组大叶藻
种子在脱水时间为 4 h时的电导率和相对电导率均
显著高于其他脱水时间而冷冻保护液处理在不同脱
水时间下种子的电导率和相对电导率均无明显不同
(图 4) ，说明冷冻保护液处理不仅影响大叶藻种子
的活力，还能够影响种子的脱水时间和冷冻效果。
适宜的冷冻保护液处理浓度和时间、玻璃化溶液脱
水时间以及解冻方式需要在今后的工作中进一
步探究。
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作者简介 张凌宇，女，1988 年生，硕士研究生，研究方向为
海洋高等植物恢复生态学。E-mail:ddzlyoo5@ 163． com
责任编辑 李凤芹
605 生态学杂志 第 32 卷 第 2 期