全 文 ：地毯草 ISSR反应体系的建立与优化
席嘉宾 , 郑玉忠 , 杨中艺
(中山大学生命科学学院 , 广东 广州 510275)
摘　要:在利用 ISSR技术对地毯 Axonopus compessus(Sw.)Beauv.种质资源的遗传多样性进行研究的实验过程
中 , 对影响 PCR扩增效果的一些因素诸如 DNA 的提取 、 模板 DNA 质量浓度 、 Taq 酶的选择及其用量 、 Mg2+浓
度 、 dNTP的用量以及退火温度等指标进行筛选和优化 , 筛选优化出可用于地毯草 ISSR-PCR分析最适宜的 PCR
反应条件:10 μL PCR 反应体积中 , 10×Taq 酶配套缓冲液 (10 mmol L Tris_HCl , pH 9.0 , 50 mmol L KCl , 0.1%
Triton X_100), 0.75 U Taq DNA 聚合酶 (上海申能博彩), 0.375 μmol L 引物 , 180 μmol L dNTP , 1.5 ～ 2.0 mmol L
MgCl2 , 10 ng 模板 DNA。
关键词:地毯草;遗传多样性;ISSR;实验条件;优化
中图分类号:Q75　　文献标识码:A　　文章编号:0529-6579 (2004)03-0080-05
　　地毯草 Axonopus compessus(Sw.)Beauv.是禾本
科地毯草属的一种多年生草本植物 , 具有匍匐茎蔓
延迅速 , 耐热 、 耐水淹 、 耐贫瘠 、 对管理的要求低
等优点。目前在我国热带亚热带地区被广泛用于建
植公共绿地草坪 、水土保持和公路护坡草坪 。该草
种在我国热带亚热带地区的大部分地区都有野生种
质资源分布。目前世界各国对地毯草种质资源的研
究还只停留在一些简单的调查上 , 还没有把性状的
鉴定与控制性状的基因以及基因的传递和变异规律
的研究结合起来 。而对这一领域的研究 , 无疑可以
为将来地毯草种质资源的开发和利用以及培育具有
自主知识产权的国产草坪草新品系 (种)提供重要
的理论依据[ 1] 。简单重复序列区间扩增多态
(ISSR)DNA分析由 Zietkiewicz等[ 2] 于 1994年建立 。
该技术具有操作简单 、成本低 、快速灵敏 、 多态性
高 、所需 DNA量少以及无需预知研究对象的基因
组序列等优点 , 同时也具有 SSR 的稳定性[ 3] 。因
此 , 近年来已迅速应用于品种鉴定[ 4] 、 种质资源遗
传多样性[ 5] 等领域的研究。但至今未见应用于地毯
草种质资源方面的研究。
ISSR技术虽然具有重复性高 、 原理简单的优
点 , 但不同反应体系也可产生不同的结果。为了确
保 ISSR分析结果的可靠性和重复性 , 进行 ISSR_
PCR反应体系的建立与优化是非常必要的 。本研究
探讨了适合于地毯草种质资源 ISSR反应的最佳体
系 , 为将来进一步利用该标记技术研究地毯草种质
资源的遗传多样性以及构建物理图谱奠定基础。
1　材料和方法
1.1　供试材料
地毯草样品采集于我国的广东 、 云南和马来西
亚等地 。采样时每个样品尽量取同一部位的成熟叶
片 3 ～ 5片 , 同一种群不同个体之间的距离保持在
3 m以上 , 采集的叶样装在密封袋硅胶干燥保存。
采集时间为 2001 年 10月至 2002 年 9 月。合计 15
个居群 , 244个个体 。
1.2　主要实验仪器与试剂
主要 仪 器:Fastprep 植 物 组 织 破 碎 仪
(FastPrep® FP220 , 美 国 Qbiogen);Hoefer DyNa
Quant 200荧光仪;PCR扩增仪 (Biometra pc_48 , 德
国);DF_D型恒压恒流电泳仪 (北京东方仪器公
司);DYY_Ⅲ型水平电泳槽 (北京青云航空仪表
厂);各型号微量移液器 (Eppendorf 公司)。16_2
型高压灭菌锅 (沈阳依专医疗器械厂);各种吸头
(国产)。
主要试剂:ISSR引物购自加拿大大不列颠哥
伦比亚大学 (Univesity of British Columbia , Set.No.9 ,
No.801-900);100 bp DNA Ladder Plus 购自 MBI
Fermentas;Taq polyerase选用上海申能博彩的产品;
dNTP 购自上海生工生物工程有限公司;琼脂糖购
自Gene公司 。其它试剂为国产分析纯。
1.3　植物DNA提取与检测
地毯草总 DNA的提取采用改进的 FastPrep法。
收稿日期:2004-03-18
基金项目:科技部重大专项基金资助项目 (J2002-B-006);中山大学张宏达科学研究基金资助项目
作者简介:席嘉宾 (1970年生), 男 , 讲师;通讯联系人:杨中艺;E_mail:adsyzy@zsu.edu.cn
　第 43 卷　第 3 期
2004年　5 月
中山大学学报 (自然科学版)
ACTA　SCIENTIARUM　NATURALIUM　UNIVERSITATIS　SUNYATSENI
Vol.43　No.3
May　2004 　
所提取的总 DNA 首先以 Hoefer (DyNA Quant 200)
荧光仪和紫外分光光度计定量检测其浓度 , 并用 w
=1%琼脂糖凝胶电泳 (0.5×TAE)对所提取DNA
的质量进行检测 。
1.4　试验处理
本实验 DNA模板质量浓度设计 10个处理 , 分
别是 2 , 4 , 6 , 8 , 10 , 20 , 40 , 60 , 80 , 100 ng
μL;Mg2+浓度梯度设置 8 个处理 , 分别是 0.5 ,
0.8 , 1.0 , 1.2 , 1.5 , 2.0 , 2.5 , 3.0 mmol L;dNTP
浓度梯度设置 6 个处理 , 分别是 120 , 160 , 180 ,
200 , 240 , 300 μmol L;Taq酶的使用量设置 6个处
理梯度 , 分别是 0.25 , 0.5 , 0.75 , 1.0 , 1.25 ,
1.50 U;引物的退火温度在理论退火温度上下进行
设置 , 每次设置 4个温度梯度 , 直到筛选出最佳引
物为止。
1.5　ISSR反应以及电泳
本实验初始聚合酶链式反应 (PCR)扩增体系
设定为:0.75 U Taq DNA聚合酶 , 0.2μmol L引物 ,
200 μmol L dNTP , 2.5 mmol L MgCl2 , 10 ng 模板
DNA。本实验 PCR反应程序为:94 ℃, 5 min , 使
模板 DNA变性 , 然后进入下列温度循环;94 ℃变
性45 s 、不同温度下 (根据不同的引物而定)退火
45 s 、 72 ℃延伸 1.5 min , 共计 45个循环;循环结
束后在 72 ℃延伸 7 min;10 ℃, 30 min终止反应 。
扩增反应结束后 , 在 w =1.5%的琼脂糖凝胶中分
离扩增产物 , EB染色 , 电压为 5 V cm 。当溴酚蓝
指示剂距离前沿约 2 ～ 3 cm时停止电泳 。在自动凝
胶成像系统上观察并拍照记录 。
2　结果与分析
2.1　DNA提取
应用改进的 CTAB 微量 Fastprep 法所提取的
DNA呈白色沉淀 , 电泳所显示的 DNA完整 , 带型
清晰一致 (图 1)。从实验效果来看 , 应用这一方
法提取 DNA , 不仅省时省力 , 而且提取效率很高 。
一般每人每天可以提取 100多个样品 , 而且所提取
的总 DNA的浓度基本一致 , 避免了人工研磨样品
所造成的 DNA 浓度不一致 , 进而影响后期逐个调
整模板浓度带来的诸多不便等问题 。
2.2　DNA模板质量浓度
DNA模板最质量浓度是影响 ISSR-PCR扩增
效果的一个重要的因子。模板质量浓度过低 , 扩增
产物不稳定或无扩增产物;模板质量浓度过高 , 又
会相应增加非特异性产物的出现。本实验在 2 ～
100 ng μL 之间设置了 10个模板质量浓度梯度参加
PCR反应 , 退火温度根据理论计算的退火温度
56℃, 用 3 个引物 (835 , 841 , 874)进行扩增实
验 , 实验结果见表 1。
图 1　广东饶平样品总 DNA
Fig.1　Total DNA extracted from the
samples Raoping , Guangdong
表 1　不同模板 DNA质量浓度对 PCR结果的影响1)
Tab.1　Effect of concentration of template DNA on PCR results
引物 模板 DNA质量浓度 (ng·μL-1)
2 4 6 8 10 20 40 60 80 100
835 - + + ++++++ + + + + -
841 - - + - + + + + + + + -
　1)+表示有扩增产物;++表示扩增效率高;+ -表
示扩增产物不稳定;-表示无扩增产物
表 1表明 , 模板 DNA质量浓度对地毯草 ISSR
的扩增结果也存在一定的影响 , 其中当模板质量浓
度在8 ～ 20 ng μL 时均可以扩增出基本相同的带型 ,
而以模板质量浓度为 10 ng μL时最为稳定;当模板
DNA质量浓度低于 4 ng μL 时 , 无扩增产物;而当
DNA质量浓度大于 80 ng μL 时扩增产物不稳定。
在检测地毯草遗传多样性的研究中 , 我们所采用的
地毯草 DNA模板的质量浓度为 10 ng μL。
2.3　Mg2+和 dNTP 浓度
在确定了模板质量浓度以后 , 我们就 Mg2+和
dNTP 浓度设计了互作组合浓度 , 希望找出一个合
理的 , 能够扩增出清晰带型的浓度组合 , Mg2+和
dNTP 浓度对 PCR扩增结果的影响如表 2所示 。
表 2表明 , 当Mg2+浓度在 0.5 ～ 1.5 mmol L之
间时 , 虽然有带型出现 , 但扩增产物不稳定 , 且扩
增出的带型较少 , 并常常出现非特异性产物。当大
于或等于2.5mmol L时 , 扩增产物不稳定或无扩增
产物出现 。而当 Mg2+浓度为 1.5 mmol L 和 2.0
mmol L时 , 均能得到清晰稳定的条带 , 且无非特
异性扩增。因此我们确定 Mg2+的最佳用量为 2.0
mmol L或 1.5 mmol L , 具体所选用浓度视具体引物
而定。
81　第 3 期 席嘉宾等:地毯草 ISSR反应体系的建立与优化
在所确定的几个 dNTP 浓度中 , 当 dNTP 的浓
度大于 240μmol L时 , 无扩增产物或扩增产物不稳
定。当浓度为 120μmol L和 200 μmol L时 , 虽然无
非特异性扩增出现 , 但是所得到的带型比较模糊 ,
辨认带型比较困难。当 dNTP的浓度为 180 μmol L ,
Mg
2+的浓度为 1.5 mmol L 和 2.0 mmol L 以及当
dNTP的浓度为 160 μmol L , Mg2+浓度为 2.0 mmol L
时 , 都可以得到比较清晰的带型 , 不过以 dNTP 浓
度为 180 μmol L 和 Mg2+的浓度为 2.0 mmol L 组合
所得到的带型最为清晰 , 无非特异性扩增 , 且重复
性也高。
表 2　Mg2+和 dNTP浓度对　
PCR扩增结果的影响1)
Tab.2　Effect of concentrations of Mg2+ and
dNTP on PCR results
dNTP浓度
(μmol·L-1)
c(Mg2+) (mmol·L-1)
0.5 0.8 1.0 1.2 1.5 2.0 2.5 3.0
120 + - + + + + + + - -
160 + - + - + + + ++ + - -
180 + - + - + + ++ ++ + - -
200 + - + - + + + + + - -
240 - + -+ - + -+ - + + - -
300 - - + - + -+ - + - - -
1)+表示有扩增产物;++表示扩增效率高;+ -表示
扩增产物不稳定;-表示无扩增产物所用引物为 841;所用
样品采自云南思茅。
2.4　Taq酶的选择与用量
在确定了模板质量浓度 、 Mg2+以及 dNTP 浓度
后 , 实验设置了 0.25 , 0.5 , 0.75 , 1.0 , 1.25 ,
1.50 U酶含量梯度 , 结果表明 , 在 10 μL 的反应体
系中 , 使用 0.5 ～ 0.75 U Taq酶含量均可以得到重
复清晰的带型 , 无非特异性扩增 , 但当高于 1.0 U
个单位时 , 虽然也能得到扩增产物 , 但同时也出现
非特异性扩增产物 , 同时扩增产物主带相连 , 模糊
难以辨认 。因此在地毯草 ISSR-PCR的反应体系
中 , Taq酶的用量以 0.5 ～ 0.75 U范围中所扩增的
反应效果最佳 。在我们所构建优化的地毯草 ISSR
-PCR的反应系统中 , Taq酶的用量取 0.75 U。
许多实验已证明 , 当其它条件一致时 , 对同一
样品使用不同厂家的 Taq酶产品 , PCR扩增的带谱
会有所不同。不仅如此 , 在实验中还发现 , 即使是
同一厂家的Taq酶产品 , 在分析同一批样品时也应
尽量选择同一批次生产的 Taq酶产品 , 否则也会出
现带型不稳以及亮带等现象 (图 2), 影响实验效
果。
所用引物为889 , 退火温度是59 ℃, 所用样品
图 2　上海申能博彩公司不同批次
Taq 酶的 PCR结果
Fig.2　PCR results obtained from different batches of
TaqDNA polymerase
为马来西亚样 (a 为样品 1;b 为样品 2;c为样品
3)。其中 1a , 1b , 1c 为同一批 Taq酶产品扩增出
的带型;2a , 2b , 2c为另一批 Taq酶产品扩增出的
带型 , ck为负对照。
2.5　退火温度
通过对所选引物的退火温度对扩增结果影响的
梯度实验结果表明:虽然根据理论退火温度的计算
公式 Tm =4(G+C)+2(A+T)计算出的几个引物
的退火温度分别为:引物 840理论温度为 56 ℃,
引物 887的理论温度为 42 ℃, 引物 890的理论温
度为 52 ℃。但是在地毯草的 PCR扩增反应中 , 理
论退火温度下所扩增出的带型并不理想甚至无带型
出现 。而当引物 840 的实际退火温度为 45 ℃, 引
物 887的实际退火温度为 48 ℃, 引物 890的实际
退火温度为 60 ℃时带型最为清晰。其它所选引物
在扩增出清晰带型时的理论退火温度和实际退火温
度也存在着较大的出入 。
这一结果与他人在其它植物上的试验结果一
致[ 6 , 7] 。
2.6　优化系统对地毯草叶样的扩增效果
在 ISSR反应体系中 , PCR扩增结果很容易受
诸多因素的影响 , 如模板质量浓度与纯度 、 Taq酶
的选择与用量 、 Mg2+质量浓度 、 dNTP 的用量 、 扩
增反应程序以及退火温度等 , 为了获得重复性和可
靠性较高的带谱 , 提高地毯草遗传多样性分析的准
确性 , 我们有必要在实验前对其影响因子进行合理
的构建和优化 , 筛选出最为理想的反应条件。通过
反复实验研究 , 认为地毯草分析较为适宜的扩增条
件是:10μL PCR反应体积中 , 1×Taq酶配套缓冲
液 (10 mmol L Tris_HCl , pH 9.0 , 50 mmol L KCl , w
=0.1%Triton X_100), 0.75 U Taq DNA聚合酶 (上
82 中山大学学报 (自然科学版) 第 43 卷　
海申能博彩), 0.375 μmol L 引物 , 180 μmol L
dNTP , 1.5 ～ 2.0 mmol L MgCl2 , 10 ng模板 DNA。
利用该反应体系对加拿大哥伦比亚大学提供的
100个引物进行了筛选 , 从所筛选出的引物对地毯
草遗传多样性的检测研究中我们发现 , 用该优化系
统所产生的 ISSR标记位点清晰 , 反应系统稳定 ,
检测多态性能力较强 , 并具有较好的重复性 (见图
3), 可用于地毯草遗传多样性的分析和研究。
图 3　引物 889 对云南思茅 16个地毯草
个体扩增的 ISSR带型
Fig.3　ISSR profiles of 16 samples from Simao(Yunnan)
population , using primer 889
M:100 bp DNA ladder plus
3　讨　论
完整 、 高质量的 DNA 是获得重复性好 、 准确
可靠的 ISSR-PCR结果的保证 。有关植物 DNA 提
取的方法很多 , 其中以 Doyle 等人于 1987年提出的
CTAB法的应用最为广泛[ 8] 。本实验采用了改进的
CTAB微量 Fastprep法进行 DNA提取 。该法是在室
温下采用 FastPrep 植物组织破碎仪代替传统的
CTAB液氮研磨植物叶片法 , 具有快速 、 便捷和微
量的好处 。同时 , 这一提取方法非常适用于野外采
样后用硅胶干燥草坪植物叶片样品的保存和提取 ,
而且也使 ISSR技术在草坪植物遗传多样性检测中
的标准化以及规模化成为可能 。模板 DNA 质量浓
度对地毯草 ISSR的扩增结果的影响范围较对较小 ,
如果所建的扩增系统比较好的话 , 模板 DNA 质量
浓度在 8 ～ 20 ng μL 的范围均可以扩增出基本相同
的带型 , 因而在具体的实验中 , 模板 DNA 浓度可
以不作为重点优化的对象 。
Mg
2+浓度是影响 ISSR-PCR结果的一个重要
因素 。Mg2+浓度不仅影响 Taq酶的活性 , 还能与反
应液中的 dNTP 、 模板 DNA及引物结合 , 影响引物
与模板的结合效率 、 模板与产物的解链温度以及产
物的特异性和引物二聚体的形成[ 9] 。在一般的 PCR
反应中 , 0.5 ～ 2.0 mmol L是较合适的 Mg2+浓度范
围[ 10] , 本研究所得到的 Mg2+优化浓度范围 1.5 ～
2.0mmol L 也证实了底物这一点 。而 dNTP 是 ISSR
-PCR反应的原料 , dNTP 浓度过高 , 会导致 PCR
错配 , 从而使扩增出现非特异性扩增;浓度过低 ,
又会影响合成效率 , 甚至会因过早的消耗而使产物
单链化 , 影响扩增效果[ 10] 。在一般的 PCR反应中 ,
dNTP 浓度在 20 ～ 200 μmol L 的范围是比较合适的
浓度范围[ 10] 。在我们的实验中 , 发现最为理想的
dNTP 浓度是 180μmol L。
在 ISSR-PCR反应体系中 , Taq酶的种类以及
使用量直接影响扩增反应的成功与否 。使用高浓度
的 Taq酶不仅提高了成本 , 而且也容易产生非特异
性扩增产物;而当 Taq酶浓度过低时 , 则会导致产
物的合成效率下降 。同时不仅不同厂家从不同菌株
上分离的Taq酶在性能上可能有些差异 , 而且同一
厂家不同批次的产品也有可能存在一定的差异 , 因
此 , 为了减少实验误差 , 应尽量使用同一厂家同一
批次生产的产品。
在同一 PCR反应系统中 , 退火温度不同 , 产
生错配的程度也不同 , 通常较低的温度在保证引物
与模板结合稳定性的同时 , 也会使引物与模板之间
未完全配对的一些位点间得到扩增 , 即产生一定的
错误扩增。因此 , 在允许的范围内 , 选择较高的退
火温度可减少引物和模板之间的非特异性结合 , 提
高PCR反应的特异性[ 10] 。此外 , 同一引物 , 不同
植物样品所用的退火温度可能大不相同 , 如余艳等
用 ISSR 技术检测沙冬青 Ammopiptanthus mongolicus
时 , 引物 880 和 889 的退火温度分别为 52℃和
50℃[ 6] , 而我们在做地毯草样品时发现这两个引物
的最佳退火温度分别是 62℃和 59℃。
在筛选地毯草的适宜引物时 , 所选引物如果在
大部分地毯草的 DNA 样品中都不能扩增出带型 ,
可以说明该引物的序列与地毯草基因组的同源性较
低 , 不宜用来作为地毯草植物 ISSR-PCR扩增的
引物。这就要求实验前筛选或设计引物时一定要慎
重 、辩证。目前国际上研究者所用引物基本上均为
加拿大哥伦比亚大学生产的引物试剂盒 , 不过现在
我国上海生工 (Sango)公司也已自行开发出 ISSR
引物试剂盒 , 这为今后国内相关领域的研究提供了
极大的便利 。
当然 , 影响地毯草产生良好清晰带型的因素很
多 , 在具体的实验中 , 不同的系统构建和优化需要
灵活调节 , 只有这样 , 才能得到重复性强的结果。
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Establishment and Optimization of ISSR Reaction System for Carpetgrass
XI Jia_bin , ZHENG Yu_zhong ,YANGZhong_yi
(School of Life Sciences , Sun Yat_sen University , Guangzhou 510275 ,China)
Abstract:Factors which affect the ISSR analysis in the study of the genetic diversity of carpetgrass , such as genomic
DNA extraction , concentration of template DNA , Taq DNA polymerase , Mg2+ concentration , dNTP and annealing
temperature , were studied for optimizing conditions of the ISSR_PCR.The results showed that the conditions being
suitable for ISSR_PCR of carpetgrass were as follows:1×Taq buffer (10 mmol L Tris_HCl , pH 9.0 , 50 mmol L KCl ,
0.1%Triton X_100), 0.75 U TaqDNA(produced by Shenneng company), 0.375μmol L primer , 180μmol L dNTP ,
1.5 ～ 2.0 mmol L MgCl2 , and 10 ng template DNA.
Key words:carpetgrass;genetic diversity;ISSR;experimental conditions;optimization
84 中山大学学报 (自然科学版) 第 43 卷