全 文 ：江 西 林 业 科 技
Jiangxi Forestry Science and Technology
Vol. 42, No. 2
Apr. , 2014
第 42卷第 2期
2014年 4月
收稿日期：2014-01-02;2014-01-24修回
基金项目：丽水市重点科技合作项目（计划编号：20054012）
作者简介：刘跃钧，男，教授级高级工程师，从事野生植物开发利用研究。E-mail：lslyj66@yeah.net
方竹和合江方竹种质遗传多样性研究
刘跃钧 1，陈世通 2，王立平 3，傅 冰 4
(1.丽水市林业科学研究院，浙江 丽水 323000；2.丽水九龙国家湿地公园管理处，浙江 丽水 323000；
3.遂昌县林业局，浙江 遂昌 323300；4.丽水职业技术学院，浙江 丽水 323000)
摘 要：目的,建立及优化方竹和合江方竹的 ISSR-PCR反应体系，分析其 12个种质资源的遗传多样性。方法,采用
L16（45）正交试验建立、优化 ISSR-PCR反应体系，利用该体系分析 12个不同种源的方竹和合江方竹的遗传多样性。结
果最佳 ISSR-PCR的最佳体系为：1×Reaction Buffer、dNTPs 100 μmol/L、MgCl2 2.5 mmol/L、引物 0.1 μmol/L、Taq 0.8 U
以及 DNA 20 ng。12个供试竹种被分为两大类群，其中除方竹遂昌种源 2外的其他方竹竹种亲缘关系相当接近，归为
一个亚群；合江方竹杭州种源和合江方竹莲都种源归到一个小亚群中。
关键词：方竹；合江方竹；分子标记；遗传多样性；研究
分类号：S759.9:Q3 文献标识码：A 文章编号：1006－2505(2014)02－0014－05
Genetic Diversity of Germplasm of Chimonobambusa quadrangularis
and Ch. hejiangensis
LIU Yue-jun1, CHEN Shi-tong2, WANG Li-ping3, FU Bing4
(1. Lishui City Institute of Forestry Science, Lishui Zhejiang 323000, China;
2. Jiulong National Wetland Park Management Office, Lishui Zhejiang 323000, China;
3. Suichang Forestry Bureau, Suichang Zhejiang 323300, China;
4. Lishui Vocational and Technical College, Lishui Zhejiang 323000, China)
Abstract: The purpose of the establishment and optimization of ISSR -PCR reaction system of Chimonobambusa
quadrangularis and Ch. hejiangensis was to analyze the genetic diversity of its 12 germplasm. Method using L16 (45) orthogonal
test build, optimize ISSR-PCR reaction system, the genetic diversity of 12 different provenances from Ch. quadrangularis and
Ch. hejiangensis was analyzed by the system. Results showed that: The best system for optimal ISSR-PCR: 1 × Reaction
Buffer, dNTPs 100 μmol/L, MgCl2 2.5 mmol/L, primer 0.1 μmol/L, Taq 0.8 U and DNA 20 ng. 12 bamboo species tested were
divided into two groups, the kinship of Ch. Quadrangularis provenances was related close, except the Suichang provenance
No. 2, which classified as a subgroup; The Hangzhou provenance and Liandu provenance of Ch. hejiangensis were normalized
to a small subgroup.
Key words: Chimonobambusa quadrangularis; Ch. hejiangensis; molecular markers; genetic diversity; research
寒竹属（Chimonobambusa Makino）隶属于禾本科
植物，其下有八月竹、大明山方竹、寒竹、毛环方竹、武
夷山方竹、永善方竹、大叶方竹、合江方竹、云南方竹
等 20 余种。 我国拥有全部种类， 其主要分布在秦岭
以南各省区，比较集中的地区如四川、贵州等西南各
省区。
由于竹子是一类生物学特性特殊的植物，以地下
鞭延伸为主的无性繁殖方式，以及开花时间、空间上
的不确定造成有性繁育系统的缺乏，所以在亲缘关系
鉴定，遗传图谱的建立等方面都存在着很大的困难。
ISSR［1］(inter sample sequence repeat) 分子标记由于不
受环境及发育阶段的影响， 目前已经成功应用到竹
类的起源、分类、遗传多样性分析以及遗传图谱构建
等方面。
利用 ISSR 分子标记分析浙江省内合江方竹（C．
hejiangensis）和方竹（C. quadrangularis）不同种源之间
DOI:10.16259/j.cnki.36-1342/s.2014.02.010
第 2期
的的遗传多样性，为今后优良竹种的选育等提供理论
依据。
1 材料与方法
1.1 材料及来源
于 2011年 10月采集浙江省内寒竹属 12 种不同
的种质资源 （表 1）。 其中 10 种采自丽水地区各县
（市、区），2 种采自浙江省林业科学研究院竹种园。采
得鲜嫩竹叶后，置于－80 ℃冰箱保存备用。
表 1 寒竹属 12 种不同竹种采集地点
Tab. 1 The collection sites of 12 different species of
Chimonobambusa
1.2 基因组 DNA的提取
用 OMEGA 公司的 Plant DNA Mini Kit 试剂盒提
取竹叶的基因组 DNA。 利用 1.5%的琼脂糖胶电泳检
测其完整性，并用 UV-2802S (上海洪富)测定基因组
DNA 的质量及浓度。
1.3 ISSR-PCR反应条件及程序
通常来说，影响 PCR 结果主要有 5 个因素：引物
浓度、Taq DNA 聚合酶浓度、dNTPs 浓度、DNA 模板
用量、Mg2+浓度，借鉴杨本超 ［2］、王涛 ［3］的反应体系及
参数，设计 5 因素 4 水平正交试验（表 2）并利用正交
实验进行适当优化。 另外，前期的研究发现，反应体
系中加入 2% (v/v)去离子甲酰胺，1% (v/v)甘油，可提
高 PCR反应的特异性，同时使条带清晰。初步确认本
研究的 PCR 反应程序为：95 ℃预变性 5 min；95 ℃变
性 45 s，50 ℃(随引物 Tm 变化)退火 1 min 30 s，72 ℃
延伸 1 min 30 s，重复 30 个循环；72 ℃延伸 10 min，
4 ℃恒温保存。
1.4 ISSR引物的筛选
引物参照哥伦比亚大学(UBC)的第 9 套 ISSR 引
物序列设计合成，共 60 条（UBC821-880），引物由北
京全式金生物技术有限公司合成。 以浙江省林科院
竹种园合江方竹基因组 DNA 为模板，进行引物筛选
1.5 电泳及染色
以所有竹种基因组 DNA 为模板， 利用筛选得到
的引物进行 PCR 反应后，进行 3.5%聚丙烯酰胺凝胶
（EB染色）电泳。 利用 Dolphin-DOC+系统(Wealtec)进
行成像分析，并记录数据。 以 MarkerIII 为 DNA 标准
分子量(北京全式金)。
1.6 数据处理和统计方法
用 Dolphin-DOC+系统自带的读带功能结合人工
方法读带， 电泳图谱上每一条清晰且能重复出现的
条带，代表一个引物结合位点记，记为一个分子标记
(marker)。 在相同的迁移位置上，用（1、0）表示有带或
无带。 利用 NTSYS-pc2.10e 软件计算竹种资源间的
遗传相似性系数， 并用 UPGMA 方法进行聚类分析，
构建聚类图。
2 结果
2.1 正交试验
按照清晰度、重复性及条带多少等遗传多样性的
分析要求进行评分，最佳组合记 16 分，最差组合记 1
分。 根据分数的不同求出每个因素水平下的平均值
ki以及同一因素不同水平间的平均值的极差 R。
种质代号 种名 种源 种质采集地点
1 合江方竹 丽水种源 丽水市林科院百果园
2 合江方竹 杭州种源 浙江省林科院竹种园
3 方竹 莲都种源 1 莲都区城西村
4 方竹 莲都种源 2 莲都区大港头镇栋头村
5 方竹 遂昌种源 1 遂昌县贵阳林场
6 方竹 遂昌种源 2 遂昌县三仁乡林业站附近
7 方竹 松阳种源 1 松阳县竹源乡小竹溪村
8 方竹 松阳种源 2 松阳县三都乡
9 方竹 松阳种源 3 松阳县竹源乡后畲村
10 方竹 景宁种源 景宁县东坑镇杨斜村
11 方竹 庆元种源 庆元林场场部
12 方竹 杭州种源 浙江省林科院竹种园
表 2 ISSR-PCR 正交设计
Tab. 2 The orthogonal design of ISSR-PCR
编号
因素和水平
MgCl2 /
mmol / L
dNTPs /
μmol / L Taq/ U
引物 /
μmol / L DNA/ ng
1 1.0 100 0.2 0.1 10
2 1.0 200 0.4 0.2 20
3 1.0 300 0.6 0.3 30
4 1.0 400 0.8 0.4 40
5 1.5 100 0.4 0.3 40
6 1.5 200 0.2 0.4 30
7 1.5 300 0.8 0.1 20
8 1.5 400 0.6 0.2 10
9 2.0 100 0.6 0.4 20
10 2.0 200 0.8 0.3 10
11 2.0 300 0.2 0.2 40
12 2.0 400 0.4 0.1 30
13 2.5 100 0.8 0.2 30
14 2.5 200 0.6 0.1 40
15 2.5 300 0.4 0.4 10
16 2.5 400 0.2 0.3 20
刘跃钧等：方竹和合江方竹种质遗传多样性研究 15
江 西 林 业 科 技 第 42卷
根据表 4 分析结果，可以得出各因素对寒竹属竹
子 ISSR-PCR反应影响大小顺序依次为：dNTPs、Taq、
MgCl2、引物以及 DNA模板。 正交试验的统计结果（表
3）与电泳结果（图 1）相对比显示，统计结果与第 13组
体系最为接近， 只在 DNA用量及引物浓度上稍有差
异。 DNA 用量、引物浓度分别在 20 ng 及 0.1 μmol/L
时反应水平最高。 引物浓度与扩增结果上有一定的
关系，引物过少会造成扩增量不足，浓度过大会产生
引物二聚体以及非特异性扩增，因此必须选择合适的
引物浓度。
DNA 是 PCR 反应的模板，主要制约扩增的产量
及特异性，过低时会造成无扩增条带；过高可能会造
成弥散或非特异性扩增。 最终确定适合寒竹属竹子
ISSR-PCR 的最佳反应体系为 ：1×Reaction Buffer、
dNTPs 100 μmol / L、MgCl2 2.5 mmol/L、引物 0.1 μmol
/L、Taq 0.8 U以及 DNA 20 ng。
图 1 正交试验电泳图
Fig. 1 Electrophorogram of orthogonal experiment
表4 引物编号及其序列 Y=(C 或 T) R=(A 或 T)
Tab. 4 Primer code and sequence Y = (C or T) R = (A or T)
2.2 引物筛选
以浙江省林业科学研究院竹种园合江方竹基因
组 DNA 为 PCR 反应模板，最终筛选出 5 条较好的引
物（表 4）。 5 条有引物在 12 份寒竹属竹种中共扩增
出 79 条 DNA 带，条带大小介于 100～3 000 bp 之间，
结果见表 5。 其中，编号为 UBC855 的引物扩增出的
条带最多，共 18条；编号为 UBC854 的引物扩增条带
数最少，仅有 12 条。编号为 UBC868的引物扩增条带
的多态性比率为 100%。 5个引物共扩增出 47条多态
性带，平均多态性比率为 59.4%。 5 个引物均可以用
来建立不同竹种的指纹图谱，其中以编号为 UBC868
的引物区分效果最好。
2.3 寒竹属竹种之间的遗传相似性分析
用 NTSYS-pc2.10e 分析软件计算各竹种间的
Jaccard遗传相似性系数，结果见表 6。 12 个寒竹属种
质资源遗传相似性系数分布于 0.2353～1.000之间。
表 5 5 个有效 ISSR 引物的扩增结果
Tab. 5 The amplification results of 5 valid ISSR primers
编号 MgCl2 dNTPs Taq 引物 DNA
k1 4.75 8.5 3.5 6.55 5
k2 3 6.0 3.75 3.5 6
k3 4.5 2.75 4 5.5 4.5
k4 7.15 1.75 8.25 3.75 3
R 4.15 6.25 4.75 3.05 3
表 3 正交试验分析
Tab. 3 The orthogonal experiment & analysis
引物编号 引物序列
UBC835 A(GA)7GYT
UBC843 C(TC)7TRC
UBC854 T(CT)7CRG
UBC855 A(CA)7CYT
UBC868 (GAA)6
编号
条带数
/ 条
多态性条带
/条
多态性比率
/%
UBC835 17 7 41.2
UBC843 15 6 40.0
UBC854 12 6 50
UBC855 18 11 61.1
UBC868 17 17 100
总数 79 47 292.3
平均 15.8 9.4 59.4
表 6 12 个寒竹属竹种的 Jaccard 相似性系数
Tab. 6 Jaccard similarity coefficient of 12 species of of Chimonobambusa
种质代号 3 12 7 10 9 4 11 2 5 8 1 6
3 1.0000
12 0.8824 1.0000
7 0.8824 1.0000 1.0000
10 0.8824 1.0000 1.0000 1.0000
9 0.9412 0.8235 0.8235 0.8235 1.0000
4 0.8824 0.7647 0.7647 0.7647 0.9412 1.0000
11 0.8824 0.7647 0.7647 0.7647 0.9412 1.0000 1.0000
2 0.5294 0.4118 0.4118 0.4118 0.5882 0.6471 0.6471 1.0000
5 0.9412 0.8235 0.8235 0.8235 1.0000 0.9412 0.9412 0.5882 1.0000
8 0.9412 0.8235 0.8235 0.8235 1.0000 0.9412 0.9412 0.5882 1.0000 1.0000
1 0.3529 0.2353 0.2353 0.2353 0.2941 0.3529 0.3529 0.5882 0.2941 0.2941 1.0000
6 0.4706 0.3529 0.3529 0.3529 0.4118 0.3529 0.3529 0.5882 0.4118 0.4118 0.5294 1.0000
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第 2期
2.4 寒竹属竹种之间的聚类分析
在基于 Jaccard 遗传相似系数的 UPGMA 聚类图
(图 2)中，笔者把 12 个供试竹种分为两大类群：合江
方竹丽水种源，合江方竹杭州种源，方竹松阳种源 1
聚成一个类群，其余 9个竹种聚成另一个大类群。 合
江方竹杭州种源和合江方竹莲都种源虽归到一个小
亚群中，但相似性系数不是很高，只有 0.5582。
图 2 12 个寒竹属竹种的 UPGMA 聚类图
Fig. 2 UPGMA dendrogram of 12 species of Chimonobambusa
3 讨论
研究结果表明，除方竹遂昌种源 2 外的其他方竹
竹种亲缘关系相当接近， 相似性系数介于 0.7647～
1.0000 之间，其中方竹松阳种源 2、3，方竹遂昌种源
1，为同一竹种；方竹莲都种源 2 和方竹庆元种源为同
一竹种；方竹杭州种源、方竹景宁种源和方竹松阳种
源 1为同一竹种。 可以认为，相同的几种方竹竹种可
能引至一样的原产地。 至于方竹遂昌竹种 2 具体为
何竹种，有待通过形态学、分子生物学等手段做进一
步考证。 合江方竹杭州种源和合江方竹莲都种源虽
归到一个小亚群中，但相似性系数只有 0.5582，可能
是受环境因素影响或者引种混乱所致，同样需要做进
一步的研究。
虽然 ISSR分子标记技术在寒竹属竹种亲缘关系
鉴定上的运用目前未见报道，但其他分子标记技术在
竹类植物的研究上有较多应用。 Watanabe［4-5］等以及
Kobayashi先后利用 RAPD 分子标记技术研究了世界
和亚洲竹类植物的系统分类和进化关系; Gielis 等 ［6］
利用 RAPD 分子标记技术研究了刚竹属 42 种 31 个
种下等级的差异；Trevor等［7］利用 ITS序列结合 AFLP
分子标记技术研究了刚竹属种之间的亲缘关系，测定
了刚竹属 20 个竹种的 ITS 序列， 同时利用 AFLP 分
子标记技术进行了分析比较。
通过本研究部分理清了丽水市各县市引种的合
江方竹及方竹的亲缘关系，为今后的研究及寒竹属竹
种笋竹两用林的发展奠定了一定基础。
参考文献：
［1］ Zietkiewicz E, Rafalske A, Labuda D.Genome finger printing
by simple sequence repeat (SSR) anchored polymerase chain
reaction amplification［J］.enomics，1994，20:76-183．
［2］ 杨本超,肖炳光,陈学军,等.基于 ISSR 标记的烤烟种质遗传
多样性研究［J］.遗传，2005，27(5):753-758．
［3］ 王涛 .烟草遗传多样性的 RAPD 和 ISSR 分析［D］.福建 :福
建农林学院硕士学位论文，2005．
［4］ Watanabe M，Ito M，Kurita S. Chloroplast DNA phylogeny of
Asian bamboos (Bambusoideae，Poaceae) and its systematic
implieation［J］.Journal of Plant Research,1994,107:253-261．
［5］ Kobayashi M. Phylogeny of world bamboos analyzed by
restrietion fragnent length polymorphisms of chloroplast DNA
［M］. London: Aeademie Press,1997:227-236．
［6］ GielisJ，Everaertl，Loose M. Genetic variability and relation-
ships in Phyllostachys using random amplified polylnorphic
DNA ［M］. London : Academie Press，1997:107-124．
［7］ Trevor R Hodkinson et al. A Comparison of ITS Nuclear rD-
NA Sequence Data and AFLP Markers for Phylogenetic
Studies in Phyllostachys (Bambusoideae,Poaceae) ［J］.Journal
of Plant Research，2000，113:31．
刘跃钧等：方竹和合江方竹种质遗传多样性研究 17