全 文 ：第 5期
草坪草一般指用于建植草坪的禾本科和少量的
莎草科植物[1]。剪股颖为多年生禾本科剪股颖属植物，
原产于欧亚大陆，是抗寒的冷季型草坪草之一[2]。由于
它具有出苗均匀、叶片细密等优点，已被世界各国广
泛用于建植高档观赏型草坪和运动型草坪。随着生物
技术的发展，运用基因工程手段对草坪草进行品种改
良越来越受到重视，并且已经取得了一定的成就。但
是目前报道最高的愈伤形成率只能达到 68.1%[3]，由
于草坪草种子的休眠特性导致其离体再生频率低，严
重阻碍了草坪草基因工程改良的进行。因此研究草坪
草组织培养条件，提高愈伤形成率，是一个急需解决
的重要课题。利用 GA3在 4 ℃下处理剪股颖种子，打
破其休眠，从而提高了愈伤形成率。同时研究了在不
同激素浓度、不同培养基添加物等培养条件下经 GA3
诱导后冷季型草坪草愈伤组织的形成率，以期为草坪
草基因工程改良提供基础理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
供试草种：冷季型草坪草剪股颖，来源于北京大
GA3诱导时间及诱导后不同培养条件
对匍匐剪股颖愈伤组织形成的影响
黄连成 1，胡鸢雷 2，邓馨 3，孙冬梅 1
（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319；2.北京大学生命科学学院；3.中国科学院植物研究所）
摘 要：为了使基因工程中剪股颖愈伤组织发挥更好的效果，以冷季型草坪草剪股颖的成熟种子为研究材料，通过改变不同培
养基添加物、添加不同质量浓度的 2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）等，研究了在不同培养条件下 GA3诱导对剪股颖愈伤组织形成
的影响。结果表明：不论在何种培养条件下，均以经 50 mg·L-1 GA3溶液中浸泡 4 d的愈伤组织形成最佳；且经 GA3诱导处理后
剪股颖愈伤组织形成的最佳 2，4-D浓度为 5.0 mg·L-1；在培养基中分别添加脯氨酸、酪蛋白或同时添加脯氨酸、酪蛋白均能显
著提高剪股颖愈伤组织形成率。
关键词：剪股颖；GA处理；愈伤组织；培养条件
中图分类号：S482
Different Induction Time and Culture Condition Effect on Cold-Season
Creeping Bentgrass Callus Formation
Huang Liancheng1，Hu Yuanlei2，Deng Xin3，Sun Dongmei1
（1.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319;
2.College of Life Science，Peking University; 3.Institute of Botany，Chinese Academy of Science）
Abstract: To improve the efficiency of callus formation of the cold-season creeping bentgrass，induction experiments were performed
under the condition of changing 2，4-D concentration and adding different additives in the media. The results showed that the opti－
mal callus formation condition was soaking the seeds in 50 mg·L-1 GA3 solution for 4 days under the different culture conditions. The
optimal 2，4-D concentration for callus induction was 5.0 mg·L-1，adding proline or /and casein hydrolysate in the culture medium
can considerably promote the callus formation ratio of creeping bentgrass.
Key words: creeping bentgrass; GA3 treatment; callus; culture condition
收稿日期：2011-03-06
基金项目：国家高技术研究发展计划（863计划）重点项目子课题（2007AA021403）。
作者简介：黄连成（1986-），男，黑龙江八一农垦大学 2008级硕士研究生。
通讯作者：孙冬梅，女，教授，硕士研究生导师，E-mail : sdmlzw@126.com。
第 23卷 第 5期
2011年 10月
黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报
Journal of Heilongjiang Bayi Agricultural University
23（5）：9~12
Oct. 2011
文章编号：1002-2090（2011）05-0009-04
文献标识码：A
黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报 第 23卷
学林忠平实验室。
供试培养基：MS基本培养基。商品化的 MS盐配
制，pH值范围在 5.6～5.8之间。琼脂 6 g·L-1，蔗糖
30 g·L-1。
1.2 试验方法
1.2.1 种子处理
取剪股颖成熟种子若干，用清水浸泡，去除漂浮
种子，将下层饱满种子用流水冲洗若干次，依次用
70%酒精浸泡灭菌 1 min，0.1%升汞（HgCl2）消毒灭菌
6 min，边消毒边振荡，以使灭菌充分；再用无菌水振
荡冲洗 5次。置于无菌的滤纸上吸干水分备用。
1.2.2 GA3（赤霉素）种子诱导时间对愈伤形成影响
取 1.2.1中消毒后的种子，分别放置到无菌水和
浓度为 50 mg·L-1 GA3 溶液中浸泡 1、2、3、4、5、6、7
和 8 d 后，按每皿 60 粒播种于 MS 基本培养基+
5.0 mg·L-1 2，4-D+0.25 g·L-1 脯氨酸+0.25 g·L-1水解
酪蛋白的培养基平板中，28 ℃下黑暗培养 20 d后统
计愈伤组织形成率以及愈伤组织状态。
愈伤组织形成率计算方法为：形成愈伤的种子
粒数与总粒数之比。
1.2.3 2，4-D浓度对诱导后种子愈伤组织形成率的
影响
将消毒处理的种子放置到浓度为 50 mg·L-1 的
GA3溶液中和无菌水中，4 ℃下浸泡 4 d，备用。以
MSI基本培养基 （MS基本培养基+0.25 g·L-1脯氨
酸+0.25 g·L-1水解酪蛋白）为基础，分别按 1.0，2.0，
3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0 mg·L-1质量浓度标准添
加 2，4-D，121 ℃高温灭菌 20 min后倒平板备用。将
上述处理后种子按每皿 60粒分别播种于平板内，28
℃下黑暗培养 20 d，观察愈伤形成，统计愈伤组织形
成率。
1.2.4 不同培养基添加物对诱导后种子愈伤组织形
成率的影响
以 MS 基本培养基+5.0 mg·L-1 2，4-D 为对照，
分别添加 0.25 g·L-1脯氨酸+0.25 g·L-1水解酪蛋白、
0.25 g·L-1脯氨酸和 0.25 g·L-1水解酪蛋白，121 ℃高
温灭菌 20 min后倒平板备用，将 1.2.2中处理的种子
按每皿 60粒播种，28 ℃下黑暗培养 20 d，观察愈伤
组织状态，统计愈伤组织形成率。
2 结果与分析
2.1 GA不同时间诱导对愈伤组织形成率的影响
草坪草愈伤组织形成率与种子萌发率成正相
关，种子萌发率越高，愈伤组织形成率也越高[4]。实验
表明，4 ℃下，无菌水和 GA3浸渍诱导时间的变化，
对剪股颖种子愈伤组织形成率均有一定影响。处理
相同天数下，GA3诱导的愈伤组织形成率均高于水
处理。利用 GA3处理剪股颖种子 1 d时，愈伤组织形
成率最大可达到 90.72%；4 d 诱导的愈伤组织形成
率为 90.3%，高于 4 ℃下利用无菌水处理剪股颖种
子 4 d时愈伤组织约 86.32%的形成率，高出 4.5%；
同时观察愈伤组织的状态发现，GA3诱导 4 d的种子
愈伤状态明显好于其他处理，GA3诱导的愈伤组织
白色至浅黄色，致密紧实，愈伤块呈现颗粒状（图 1，
图 2）。
图 2 GA3和水处理对剪股颖愈伤诱导影响
Fig.2 GA3 and water treatment on callus induction of creeping bentgrass
注：GA3处理的愈伤组织淡黄色，颗粒状；水处理的愈伤组织颜色发褐，散
图 1 不同种子处理方式、不同处理时间对愈伤形成率影响
Fig.1 Different treatments and periods on callus formation
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第 5期
2.2 2，4-D浓度对诱导后种子的愈伤组织形成率的
影响
利用 2.1的实验结果，对剪股颖种子进行 4 d处
理后，在其他条件不变，改变 2，4-D浓度的 MSI培养
基中，剪股颖接种培养 4 d后开始萌芽，20 d后有乳
白色、表面湿润的愈伤组织出现，但体积较小，20 d
后愈伤组织体积增大且颜色逐渐转变为淡黄色，但
大部分仍为乳白色。试验中发现，无论是 GA3诱导还
是水处理，愈伤组织形成率均以 2，4-D质量浓度为
5.0 mg·L-1时为最高；且 GA3诱导的种子愈伤组织形
成率在不同 2，4-D浓度下，均高于水处理。实验同时
表明，2，4-D浓度变化会影响到愈伤组织的形成率，
无论是 GA3 诱导还是水处理，在 2，4-D 浓度为
1.0~5.0 mg·L-1时剪股颖愈伤组织形成率随着浓度增
加而增加，5.0 mg·L-1后随着 2，4-D浓度增加开始下
降（图 3）。
通过对愈伤组织的观察也发现，2，4-D 浓度为
5.0 mg·L-1时，诱导愈伤组织的质量最好，培养出的愈
伤组织大多数为颗粒状、淡黄色；依据前人结论，
2，4-D浓度过高会影响其下一步愈伤组织的分化[5-8]。
因此研究选定 2，4-D质量浓度为 5.0 mg·L-1。
2.3 不同添加物对诱导后种子愈伤组织形成率的影响
组织培养中常用含有氨基酸、激素和酶等的有
机物质，或椰乳、香蕉和马铃薯等成分较为复杂的天
然复合物[9]。在愈伤组织诱导的培养基中添加不同的
营养物质会对愈伤组织的形成产生不同的影响。实
验结果表明，无论是 GA3诱导的剪股颖种子还是水
处理后的，添加脯氨酸或水解酪蛋白的培养基中，愈
伤组织形成率均高于没有添加物的基本培养基，如：
经 GA3诱导后，在培养基中分别添加脯氨酸、水解酪
蛋白时，愈伤组织形成率分别比对照提高了 3.21%
和 5.49%；当两者同时添加时，愈伤组织形成率可提
高 12.85%（图 4）。该结果表明在培养基中添加水解
酪蛋白和脯氨酸对诱导愈伤组织的形成具有促进作
用，这一结果与丁鑫[10]等研究石刁柏花药愈伤组织培
养时结果一致。
3 讨论
在草坪草组织培养中，愈伤组织及体细胞胚胎
发生、发育受多方面影响[11]，包括生理[12-13]、形态[14]、生
化[15]等因子。生产实践已经证明，GA3能解除芽和种
子的休眠，促进萌芽，可以代替有些种子打破休眠所
需的光照或低温层积[16]。实验中利用 GA3和 4 ℃同时
处理用于打破种子休眠以提高萌芽率进而提高愈伤
组织形成率，通过对种子进行处理后，在不同培养条
件下的实验均证明了经 GA3诱导后，种子的愈伤组
织形成率得到了明显提高，最高可达到 90.72%。
2，4-D是植物愈伤组织诱导和体细胞胚胎发生
诱导的基本激素之一。Heng Zhong等报道，剪股颖体
细胞愈伤组织形成率的最高 2，4-D浓度为18 μM[17]，
而孙荣江等报导诱导愈伤形成的 2，4-D 浓度在
2 mg·L，单独使用时 2，4-D浓度可高达 15 mg·L-1[18]，
实验中诱导后种子形成愈伤的最佳 2，4-D 浓度为
5.0 mg·L-1 ，与文献报道不完全相符，可能与所用的
种子来源不同有关，实验所用的种子为寒地型剪股
颖，而针对实验的研究材料最适 2，4-D 浓度为
5.0 mg·L-1在前人研究的范围之内。
在植物组织离体培养中，为了促进培养物的生
长，经常在培养基中添加一些有机物，如水解酪蛋
白、脯氨酸、谷氨酰胺等等。高等植物中脯氨酸在抗
逆胁迫、花粉育性及离体培养等诸多方面都具有重
要功能[19]。实验在培养基中添加了 0.25 g·L-1脯氨酸
和水解酪蛋白后愈伤组织诱导率都明显提高。
愈伤组织一般从种子盾片处诱导发生，有发芽
图 3 不同 2，4-D浓度对种子处理后愈伤形成率影响
Fig.3 Different treatment and concentrations
of 2，4-D on callus formation
图 4 不同添加物对种子处理后愈伤形成率影响
Fig.4 Different treatments and additives on callus
黄连成等:GA3诱导时间及诱导后不同培养条件对匍匐剪股颖愈伤组织形成的影响 11
黑 龙 江 八 一 农 垦 大 学 学 报 第 23卷
能力的种子均能诱导产生愈伤组织，不萌动的种子
则偶有愈伤组织发生[20]。实验中发现剪股颖发芽的种
子基本上都可以形成愈伤组织与王贺飞[21]结论一致。
但有关如何打破休眠的报道不一致，在试验中选用
GA3诱导在 4 ℃条件下处理来打破种子休眠，起到了
提高愈伤组织形成率的效果。
（致谢：研究所用剪谷颖材料由北京大学生命科
学学院林忠平教授提供，特此致谢。）
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