全 文 ：第 加 卷 第 4 期
9 19 1年扮 月
复 旦 学 报( 自然科学版 )
J o u 了n a l o f F u d a n U n i v e rs i t y ( N a t u ra l S o i n eo e)
V o l
.
30 N o
.
4
D eo
.
99 1 1
` 、
旱芹人工种子的研制 ’
倪德祥 蒋如敏 张 蓓 岑益群
(环境与资源生物学系 )
沈大棱
(遗传学研究所 )
纪才圭
(材料科学系 )
提 要
用早芹 (A p 伽 , g二 a倪 。死。 s )无菌苗的叶片 、 叶柄作外植体 , 在附加 2 . 4一D
(2
,
4一二氛苯氧乙酸 )1 m g / L 和 K T (激动素 ) o . s m g / L 的 M S 培养基上诱 导
发生大量的胚性愈伤组织 , 在 M S 分化培养墓上获得胚状体 . 用 2% 藻酸钠 与
1% 氛化钙制成的人工种皮包裹胚状体 , 即为旱芹人工种子 . 其转株率达 8 . 5%
~ 9 0
.
0形 , 每颗种皮承受力为 Z k g . 人工种子在无菌条件下长成植株后 , 成功
地进行 了盆栽 . 本文还观察统计了胚状体发育程度 、 低温贮存和光照等内外因
子对人工种子转株率的影响 .
关健词 : 芹菜 , 种子 , 人工方式 ,人工种子 , M S 培养基 .
.沪 ,
0 引 言
人工种子的概念 , 由 M ur as ih ge 在加拿大召开的第四届国际植物组织培养会议上首
次提出 : 利用植物组织培养中具有体细胞胚发生的特点 , 把胚状体包裹在胶囊内形成球
状结构 ,使其具有种子的机能并可直接播种于田间 l[] . K i t ot 和 J a in ke 用聚氢 乙烯包埋
胡萝 卜胚状体 , 首次制成了人工种子 2[J . 随人工种子研制工作的深入 开 展 , 日本 学 者
K a m ad
a 对人工种子的概念提出了新的看法 . 他认为 , 包裹着一个能发育成植株的培养
物 、 组织块或器官 、 含有营养成分 、外面涂膜的胶囊均可称为人工种子 〔“ 」. B叩时 等首次
报道了桑树腋芽的包裹 、 贮藏及萌发的试验结果 〔` 」 ,证实了 K a ln ad : 的观点 .
近 10 年来 , 已研制成的人工种子有首楷 和 胡萝 卜等 约 30 种植物〔` 一1t , 其 中有
L aw er
n ce 对于欧芹 (又名实心芹 ) 〔 . J 、 金冀毅和郭仲深对于冬芹〔 , 〕及我们对于早芹〔o1J 的
人工种子研制的报道 .
本文在早芹人工种子的制作基础上 l0[ 」, 着重研究了早芹胚状体形态发生的规律 , 以
七
收稿 日期 : 19 91 年 1 月 扮 日 .
上海市科委和复且大学自然科学基金资助课题 .
勺
DOI : 10. 15943 /j . cnki . f dxb -jns . 1991. 04. 002
娜 鑫 第 4 期 倪德祥
,等 : 旱芹人工种子的研制
便为制作人工种子取材时选择合适的时间和形态指标 . 另外 , 胚状体发育程度 、温度和光
等有关因子对人工种子转株率的影响我们也作了较系统的研究 , 并取得了一定的结果 .
毒憾
1 材料与方法
1
.
1 材料
1
.
1
.
1 人工种皮 : 藻酸钠 ;
1
.
1
.
2 人工胚乳 : 改良 M S 基本培养基 ,
1
.
1
.
3 外植体取材植物 : 早芹 ( A夕如 , 尹。 oe l` 娜 ) .
1
.
2 人工种子制作的基本流程
.j 2
.
l 天然种子表面消毒 ;
1
.
2
.
2 在无菌条件下培养获得无菌苗 ;
.1 2
.
3 将叶片 、 叶柄等外植体在附加 l m g / L 2 . 4一 D 和 o . s m g / L K T的 M S培养基
上诱导产生的胚性愈伤组织转接到 M S 基本培养基上 , 得到胚状体 ,
。
2
.
4
。
2
.
5
。
2
.
6
..工劝几,二
。
2
。
7
挑选一定生长时期的胚状体 , 悬浮于藻酸钠凝胶液中 ;
滴珠法制作人工种子 (直径 4 m 二 ) , 固化剂为氯化钙 ,
无菌水冲洗人工种子 ,
在无菌条件下于冬M。 基本培养基上萌发 一长成植株 ,一 ` ~ ~ ~ ” ” 2 ~ 一 ’ 一 H ,. ~ 一 ~ ~ 一~ 一~ 犷 .l ’
以上各步中的培养条件为 : 室温 25 士 1 ’ C , 每日照光 1 2 1 , 光强为 ! 5 0 0 1为
.
2
.
8 小植株移栽于盆中 (有菌 )生长 .
砂
沪
2 结果与讨论
2
.
1 胚状体的形态发生
用早芹种子培养获得无菌苗 , 切取叶片 、 叶柄为外植体 , 接种于含 1 m g / L 2 . 4一 D 和
o
.
s m g/ 毛 K T 的 M S 培养基上 . 约经 4O d 的诱导培养 , 得到胚性愈伤组织 , 然后转接到
M S 基本培养基上 , 观察其胚状体发育的过程 .
从第3天开始陆续取样镜检 ,分别可观察到球形 、 心形 、鱼雷形和子叶胚等各个发育时
期的典型结构 (第 3 70 页图 I A ~ D ) . 胚状体的外形色泽随发育过程而明显变化 . 从胚性愈
伤组织转接到 M S 培养基上至第 5 天 , 愈伤组织为乳白色 ;过了 2 或 3 d , 颜色由浅变深 ,
呈黄白色 ;再过 2 或 3 d , 培养物的色泽呈淡黄绿色 ;约培养至 10 d 后 , 培养物 _L 出现绿 J.版,
呈刺状结构 (转绿的子叶顶部 ) ;培养两周后 , 肉眼可见到绿色的胚状体 . 这时的胚状体 , 除
子叶长大外 , 胚轴明显伸长 (第 37 。页 图 I E ) ,胚体长达 1 c m 左右 . 这种过度成熟的胚状
体若用滴珠法制作人工种子 , 是难于将整个胚状体包裹起来的 .
为了观察胚胎发育过程 中不 同形态胚状体的数量变化 , 从培养至第 3 天开始 (仃天
下午 1 时至 2 时 ) 陆续取样 . 用旋涡混合仪 ( X W一 80 型 )将培养物振荡分散处理 Z m拍
盯O 复 一 且 学 报 (自接科学版) 第即 卷 吞 准
加尸
,如
目 1 革芹人工种子的萌发成株过程
人 . 球形胚(顶面观 ) ; B . 心形胚 ; 0 . 鱼甘形胚 ; D , E . 子叶胚 ; F . 人工种子 ;
G
. 人工种子萌发 ; U . 人工种子萌发成株 ; 1 . 植株盆栽
后 , 用 20 目镶丝网过滤得到 2 个细胞以上的培养物 , 并镜检统计不同胚状体的发生率 ,
见表 1 . 统计结果表明 , 将胚性愈伤组织转接到分化培养基上后 , 几天内以 原 胚 的 数
量为主 , 培养至第 3 天 , 原胚的比例仍高达 5 9 . 3% . 随培养时间的延长 , 胚状体不断发
育 , 当培养至第 6 天时 ,球形胚的数量明显增多 , 占总观察数的 51 . 2拓 ;第 9~ 10 天时 , 心
形胚的比例出现了高峰 ,第 10~ 1 天时 , 鱼雷形胚的数量也达最高值 , 第 12 天开始 , 子
叶胚的数 t 急剧增加 , 第 13 天时 已高达观察总数的 38 . 6那 . 虽然以后数量仍有增加的趋
、
第 4 期 倪德祥 ,等 : 早芹人工种子的研制 87 1
钾 鑫 表 1 发育时期不 同胚状体的发生率
如喃 、
发 生 率 (形 )
t厂d—原胚 球形胚 心形胚 鱼雷形胚 子叶胚 畸形胚 观察数 (颗 )3 59 . 3 3 1 . 5 5 . 1 3 . 2 0 . 9 一 2 164 40 . 4 4 5 . 4 6 . 3 7 . 5 2 . 4 一 24 05 3 9 . 4 4 6 . 9 6 . 2 1 . 7 1 . 2 4 . 7 2 4 16 38 . 2 51 . 2 6 . 2 4 . 0 0 0 . 3 32 27 35 . 2 4a . 8 7 . 0 10 . 2 1 . 6 2 . 3 2 568 37 . 6 39 . 5 7 . 0 4 . 7 7 . 8 3 . 5 2 589 4 0 . 5 3 5 . 7 10 . 2 7 . 1 3 , 4 3 . 1 29 410 17 . 7 2 2 . 7 1 1 . 6 19 , 9 19 . 3 8 . 8 18 11 1 18 . 2 2 7 . 1 10 . 5 15 . 5 19 . 4 9 . 3 2 5812 9 . 6 32 . 2 1 0 . 2 11 . 0 29 . 5 7 . 5 14 613 7 . 8 17 . 5 9 . 0 13 . 9 38 . 6 13 . 3 16 614 8 . 7 20 . 5 1 1 . 8 11 . 8 3 4 . 生 12 . 8 19 51 5 15 . 1 14 . 2 9 . 0 17 . 0 48 . 1 10 . 8 2 12
砂
势 , 但胚状体过大 , 无法用来制作人工种子 .
从表 1 还可以看出 , 在胚状体发育过程中存在若明显的不同步现象 , 且出现一定比
例的畸形胚 , 在培养第 10 天至 15 天时期内 , 其比例平均高达 10 . 4% . 由此可见 , 为了保
证人工种子的质量 , 必须提高胚状体的同步性和减少畸形胚的比例 ,在进行人工种子制作
时 , 必须对胚状体进行一定的挑选 .
2
.
2 芹菜人工种子的制作
将成熟 (在分化培养基上培养 10 ~ 13 d , 外形上出现绿点的子叶期 )胚状体 , 挑入由改
良 M S 组成的人工胚乳与 2那藻酸钠配制成的凝胶液中 . 胚状体悬浮于凝胶液中 , 用滴管
从胶液中吸出单个胚状体 (含凝胶掖 ) , 用滴珠法将含胚的溶液滴入固化剂 l %氯化钙中 ,
固化 30 ~ 60 m in , 即可裕到每颗耐压强度达 Z k g 左右的人工种子 (图 I F ) , 这强度明显
高于所报道的 l[ 尸 ` 吕二一般所用藻酸钠的浓度为 3% ~ 5% , 制成的人工种子平均每颗的耐
压强度只有 0 . 8~ 1 . 2 k g . 我们所以能得到这种高强度的人工种子 , 是由于对藻酸钠的消
毒工艺及人工胚乳中的金属离子进行了变革和调控的结果 (另文报道 ) . 将人工种子丑 于
1
、 , 。
— 】牲口 培养基上进行无创培养 3~ s d , 即可萌发成株 (图 I G )
.
尹
从图 I G 中可见 , 在人工种子萌发过程中 , 出现了子叶先突破种皮后再长出胚根的现
象 , 而天然种子一般先长出胚根后再出现子叶 , 这与胚发育的空间 、 营养供给和种皮的结
构特点有关 . 天然种子 内的胚胎发育一开始就受到种皮的包裹和着生位置的限制 , 故胚
体远比胚状体小且位置 固定 ,另外 , 天然种子种皮上的种孔等结构为胚根突破种皮和苗吸
收水娇口营养创造了条件 . 然而当胚状体被包裹成颗粒时 , 子叶和胚根在人工种子内的位
界是随机的 , 且种皮上也无专门供胚根伸出的特殊结构 . 因此 , 当人工种子萌发时 , 子叶

第 4 期 倪德样 ,等 : 旱芹人工种子的研制 3 73汀 伽
表 3 温度对转株率的影响
项 目 2 5 士 l o C 室温 ( 199 0 . 3 . 2 4~ 19 9 0 . 4 . 2 4 ) o4 C处理 10 d
人工种子总数 (颗 )
转株数 (颗 )
转株率 (另 )
8 0
72
9 0 0
6 0
36
60
`
0
4 0
1匀
47
.
6
表 4 o4 C贮存时间对转株率的影响
5
40197
5
402357
八é
40375人工种子总数 (颗 )
转株数 (颗 )
转株率 (形 )
4 0
36
9 0
.
0
4 0
2 6
65
.
0
4 0
17
42
.
5
4 0
7
17
.
5
4 0
5
12
.
5
4 0
5
12
.
5
如味 、
保证人工种子生产效率的一个重要课题 .
2
.
3
.
3 光照处理对转株率的影响
将人工种子分别置于光强 1 5 0 lx (每天照光 12 h) 和经黑暗培养 10 d 后再置于照
光组相同条件下 ( 2 5 土 1℃ ,培养基质为冬M s ) 培养至 1 个月时统计转株率 (见表 5 ) .`
表 5 光照处理对转株率的影响
项 目 光照 黑暗处理 10 d
人工种子总数 (颗 )
转株数 (颗 )
转株率 (落 )
80
7 2
9 0
_
0
80
62
78
.
5砂 从表 5 可见 , 光照和黑暗处理对人工种子的转株效果不一 照光有利于人工种子的
转株生长 , 可使转株率高达 90 . 0拓 , 但经 10 d 黑暗处理后再置 于光下培养 , 其转株率为
78
.
5%
, 有降低的趋势 . 这是因为人工种子内的子叶期胚状体在包裹成颗粒时 ,胚体 已部
分呈绿色 , 处于能进行光合自养的状态 ,若把它长时期 ( 10 d) 置于黑暗中 , 显然不利于光
合作用而影响转株率 . 这也说明了人工种子与天然种子萌发成株时的所需条件是不相同
的 , 一般天然种子萌发是不需光照的 .
本文初步建立了早芹人工种子制作的工艺流程和实验系统 , 并对影响人工种子转株
率的因素进行了探索和讨论 , 这将为人工种子的商品化生产打下基础 .
户
参 考 文 献
仁1 j M u r a s h i g o T . T h e Im P a o t o f P l a n t T姚 u e C u l t o r e . I n : T h o r p e T e d . T il e I n t e r n a t lo :飞a l
A s s o e i a t i o n f o r P la n t T is s u e C u l t u r e
.
A l b e r t a : U n iv e r s i t y o f C a l g a r y , 1 9 7 8
.
1 5~ 26
.
〔 2 〕 K it t o S , J a n i o k J . P o ly o x a s a n A r t if ie i a l S e e d C o a t f o r A s e x u a l E m b塔 0 5 万。 , ` S e i e , e e ,