全 文 ：GeneticDiversityofAchnatherumSplendens
XUHai-xia, ZHANGXia＊ , WANGShao-ming, YANPing, DUJin-zhou
ColegeofLifeSciences, ShiheziUniversity, Shihezi832003
Abstract　[Objective] StudyonthegeneticdiversitiesofA.splendensfromdiferentareasofxinjiang.[ Method] Thegeneticdiversitiesamongseven
populationsandwithintwopopulationswereanalyzedbyRAPD.[ Result] GeneticclusteringresultspresentedthattherelationshipsamongpopulationsofA.splendensaredirectlyrelatedwithgeographicpositions, andwithinpopulationarerelatedwithhabitats.[Conclusion] RAPDtechniquecanbeusedto
studygeneticdiversityofA.splendens.
Keywords　Achnatherumsplendens;RAPD;Geneticdiversity
Received:March26, 2008　　Accepted:April18, 2008
SupportedbyNationalSpecialProphaseProjectonBasicResearch
(2004CCA02800)andTheProjectofkeyOasisEco-agricultureLaboratory
ofXinjiangProductionandConstructionGroup(200313)andScienceFund
forYoungScholarsofShiheziUniversity(200257).
＊Correspondingauthor.E-mail:Xiazh@shzu.edu.cn
　　Achnatherumsplendens, aperennialherbofGramineae,
distributeswidelyinextremeconditionssuchasdrought,
coldandhighsalt.Withstrongandthickfibrousroots, A.
splendensistheconstructivespeciesingrasslandandsaline
soilindesert, andeasilyformssingle-dominantcommunity.
ThedevelopedrootsendowA.splendenswithanimportant
functionforsalinesoilreclamation, windbreakandsandfixa-
tion, soilandwaterconservation.Itsgreenleavesownpleas-
ingpalatabilityandhighnutrientvalue, couldbeclassified
togoodpasture.Stalkisasuperiorrawmaterialforpaper-
makingandfolkweave.Moreover, alitsroot, stemandleaf
possesmedicinalvalue[ 1-3] .Toprovidereferenceforbeter
approachforexploration, utilizationandpreservationofA.
splendensgermplasmresources, weanalyzedtherelationship
amonggeneticdiferentiation, geographicpositionandhabi-
tatsforA.splendensthroughRAPDtechnique.
Materialsandmethods
Materials
ThehabitatsdataandNo.forexperimentalmaterials
fromdiferentareasofXingjiangarelistedinTable1.
Table1　Thehabitsofexperimentalmaterials
Population
No. Samplingsites Longitude Latitude
Altitude
m
Meanannual
temperature∥℃
Annualprecipitation
mm
Annualrainydays
d
A1 LucaogouTown, HuochengCounty 44°20′ 81°00′ 810 5.5-7.5 200-400 80-100
A2 KaiganQi, KuitunCity 44°30′ 84°30′ 620 5.5-7.5 100-200 60-80
A3 ShangyouTown, HejingCounty 42°18′ 80°05′ 1 610 5.5-7.5 50-100 20-40
A4 QitaiTown, QitaiCounty 44°12′ 90°30′ 848 5.5-7.5 100-200 60-80
A5 MountainousareainBurqinCounty 47°10′ 86°20′ 1 350 2.5-5.6 100-200 60-80
A6 GeneralMountainofthe152CorpinShiheziCity 44°25′ 85°27′ 250 5.5-7.5 100-200 60-80
A7 NorthLakeinShihezi 44°13′ 86°00′ 820 5.5-7.5 100-200 60-80
Methods
TheextractionofgenomicDNAfromA.splendens, opti-
mizationofRAPDreactionsystemandprimerscreeningwere
referredtoreference[ 4] .
Dataanalysis
DNAmarker(λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ)wasrunongel
forjudgingthesizeofamplifiedfragments.RAPDbelongsto
dominantmolecularmarker, theidenticalbandsofdiferent
templatesamplifiedbyasameprimeraretheproductsof
samelocus, namelyhomology, theconversecaleddiversity.
Theamplifiedbandsintheelectrophoresispaternwere
markedwith(1)and(0)fordenotingYesandNo, respec-
tively, consequentlythedatamatrixforRAPDphenotypes
andthepercentageofpolymorphicbands(PPB)wereob-
tained.ThesimilarityindexwascalculatedwithNTSYSsoft-
wareandanalyzedforthegeneticrelationshipsamongexperi-
mentalmaterialswiththeunweightedpair-groupmethodu-
singarithmeticaverages(UPGMA).Theformula, Sxy=
2Nxy/(Nx+Ny), wasusedtocalculatesimilarityindex,
NxyrepresentsthenumberofmutualbandsforsampleXand
Y, NxandNyrepresentthenumberofrespectivebandsfor
sampleXandY, respectively.Themax.andmin.difer-
encesofXandYappearedwhenS=0 andS=1, respective-
ly[ 5] .
Resultsandanalysis
Analysisofgeneticdiversityamongpopulations
TheresultsofamplificationwithprimerOPB-20 show
thatRAPDpaternofmixedsamplescontainmostlypolymor-
phicbandsandalthemutualbands, justafewofpolymor-
phicbandsassumenegativeinmixedsamples(Fig.1).
Therefore, mixedsamplescouldbeusedtoanalyzethege-
neticdiversityinsteadoftheindividualswhenthegenetic
variationisslightlyunderestimated.Moreover, thechoicere-
ducesworkloadgreatlyandcanmakearapidasessmentfor
geneticdiversityofmaterials[ 6] .
Eighteenprimersperformedpolymorphicinalsixty
testedprimers, andcouldberegardedasprimersforgenetic
AgriculturalScience＆Technology, 2008, 9(1):21-23, 28
Copyright 2008, InformationInstituteofHAAS.Alrightsreserved. AgriculturalBio-technology
analysisamongpopulations.Thesequencesof18 selected
primerswerelistedinTable2 andsomescreeningresultsfor
primerswereshowninFig.2.
Table2　TheprimersusedforRAPDamongpopulations
No. Sequence(5′-3′) No. Sequence(5′-3′)
OPM-02 ACAACGCCTC OPM-19 CCTTCAGGCA
OPM-04 GGCGGTTGTC OPB-O2 TGATCCCTGG
OPM-06 CTGGGCAACT OPB-03 CATCCCCCTG
OPM-07 CCGTGACTCA OPB-04 GGACTGGAGT
OPM-08 TCTGTTCCCC OPB-05 TGCGCCCTTC
OPM-09 GTCTTGCGGA OPB-19 CCACAGCAGT
OPM-10 TCTGGCGCAC OPT-07 GGCAGGCTGT
OPM-11 GTCCACTGTG OPT-10 CCTTCGGAAG
OPM-17 TCAGTCCGGG OPT-11 TTCCCCGCGA
TheupperistheamplificationresultsfortenindividualsofA6popula-
tion, 1-10denotetenindividuals, A6denotesmixedsamplesoften
individuals;theloweristheamplificationresultsfortenindividualsof
A7population, 1-10denotetenindividuals, A7denotesmixedsam-
plesoftenindividuals.
Fig.1　ContrastonRAPDandPCRamplificationonmixedsam-
plesandvariousindividuals
　　Amplificationwith18selectedprimersandclusteringa-
nalysisshowedthat162 RAPDsitesweredetectedinseven
experimentalA.splendenspopulations, andpercentageof
polymorphicsitesaccountsup68.2%, indicatingsomege-
neticvariationsamongsevenexperimentalA.splendenspopu-
lations(Fig.3).TwoShihezipopulationsatnorthofTians-
hanMountain, Kuitunpopulation, Qitaipopulationand
BurqinpopulationwereclassifiedintoClassIbasedon
RAPDanalysis;Huochengpopulation, whichislocatedat
principalmountainchainandlateralmountainchainofTian-
shan, wasclassifiedintoClassI;Hejingpopulation, which
islocatedatnorthofTianshanMountain, wasclassifiedinto
anotherclas.Thespecialtopographyoftwobasinsaround
withthreemountainsproducedthegeographicalregionsand
diferentgeographicalpopulationhabits, furthermore, formed
thegeneticdiversityamongpopulations.
Analysisofgeneticdiversitywithinpopulations
Sixteenprimerswereselectedfrom60 testedprimersto
analyzethegeneticdiversitywithintwoShihezipopulations
withlitlegeographicalpositiondiferences.Thesequences
of16 selectedprimerswerelistedinTable3 andsome
screeningresultsforprimerswereshowninFig.2.ThePPB
Fig.2　TheresultsofamplificationusingprimerOPM-06,
OPM-07, OPM-08andOPM-09
Fig.3　Theclusteringresultsofsimilaritycoefficientsforseven
populations
forGeneralMountainpopulationandNorthLakeare62.2%
and78.5%, respectively.
Table3　TheprimersusedforRAPDwithinpopulations
No. Sequence(5′-3′) No. Sequence(5′-3′)
OPM-02 ACAACGCCTC OPB-01 GTTTCGCTCC
OPM-06 CTGGGCAACT OPB-02 TGATCCCTGG
OPM-07 CCGTGACTCA OPB-03 CATCCCCCTG
OPM-08 TCTGTTCCCC OPB-04 GGACTGGAGT
OPM-09 GTCTTGCGGA OPB-05 TGCGCCCTTC
OPM-10 TCTGGCGCAC OPB-20 GGACCCTTAC
OPM-19 CCTTCAGGCA OPT-07 GGCAGGCTGT
OPM-20 AGGTCTTGGG OPT-10 CCTTCGGAAG
Discussion
Abouttherelationshipbetweenbotanicalpopulations
andgeologicaldistribution, ecologicaltypes, therearedifer-
entacademicviews.Somereportsshowthatgeneticdiversity
ishighlyrelatedwithgeologicaldistance[ 7] , andalsoreverse
viewpoint[ 8] .WeanalyzedthediversitiesofwildA.splendens
amongpopulationsandwithinpopulationsthroughRAPDand
theresultsshowedahighcorrelationbetweengeneticdis-
tanceandgeologicaldistance, whichwasprobablybecauseof
itspropertiesofanemophilousflowerandcrospolination.
Thegeneticdiferentiationofbotanicalpopulationisrelated
toitsgeologicalposition, distributionrange, breedingsystem
andseeddispersalmethod, thatistosay, thesmalergenetic
diferentiationinbotanicalpopulationifthebreedingsystem
(especialythepolinationmethods)andseeddispersal
methodaremorebeneficialtogeneflowamongpopulations.
Inthepresentstudy, twoShihezipopulationsarelocatedthe
nearestinalexperimentalmaterials, posessedmoregene
flowandmax.geneticsimilarity.
IntwoShihezipopulations, thewethabitofGeneral
Mountainismoresuitableforplantgrowthcomparedwith
22 AgriculturalScience＆TechnologyVol.9, No.1, 2008
Northpopulationwithslightsalineenvironment, butPPB
(62.3%)islowerthanthatofNorthLake(78.5%), ex-
hibitinglowergeneticdiference.Geneticdiversityistheac-
cumulationoflong-termevolution, whichpresentstheevolu-
tionpotentialandalsoreflectstheadaptabilityofplantsto
existencestress.Theresultsareinaccordancewiththege-
neticclusteringresultsofHemerocalislilioasphodelusL.in
reference[ 9] , meanwhile, suggestingthatRAPDtechnique
canbeusedforstudyinggeneticdiversityofA.splendens.
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芨芨草遗传多样性研究
徐海霞 ,张霞＊ ,王绍明 ,阎平 ,杜金洲　(石河子大学生命科学学院 , 新疆石河子 832003)
基金项目　国家重大基础研究前期研究专项资助项目(2004CCA02800);
新疆兵团绿洲生态农业重点实验室资助项目(200313);石河子
大学科学研究青年基金项目(200257)。
作者简介　徐海霞(1972-), 女 , 河南郑州人 ,硕士 , 副教授 ,从事植
物遗传学研究。 ＊通讯作者。
收稿日期　 2008-03-26　　修回日期　 2008-04-18
　　研究芨芨草的遗传多样性 ,探讨不同地理种群的遗传分化
与地理位置及生境的关系 ,以期为芨芨草种质资源的开发 、利用
与保存提供参考。
1　材料与方法
1.1　材料　试验材料采自新疆不用产地 ,生境资料见表 1。
　　表 1 新疆 7个居群的生境资料
居群编号 采集地点 经度 纬度 海拔∥m 年平均温度∥℃ 年降水量∥mm 年降水日∥d
A1 霍城县芦草沟镇 44°20′ 81°00′ 810 5.5～ 7.5 200～ 400 80～ 100
A2 奎屯开干旗 44°30′ 84°30′ 620 5.5～ 7.5 100～ 200 60～ 80A3 和静县上游镇 42°18′ 80°05′ 1610 5.5～ 7.5 50～ 100 20～ 40
A4 奇台县奇台镇 44°12′ 90°30′ 848 5.5～ 7.5 100～ 200 60～ 80A5 布尔津县山区 47°10′ 86°20′ 1350 2.5～ 5.6 100～ 200 60～ 80
A6 石河子 152团将军山 44°25′ 85°27′ 250 5.5～ 7.5 100～ 200 60～ 80
A7 石河子北湖 44°13′ 86°00′ 820 5.5～ 7.5 100～ 200 60～ 80
1.2　方法　芨芨草总 DNA的提取 、RAPD反应体系优化及引物
筛选参考文献 [ 4]的方法进行 。
1.3　数据分析　以标准分子量(λDNA/EcoRⅠ +HindⅢ)为对
照 ,判断扩增产物的分子量大小 。 RAPD为显性标记 ,同一引物
不同模板的扩增条带一致的带被认为具有同源性 ,属于同一位
点的产物;所有模板都具有的带为共有带 ,表示无多态性;其余
类型的带为多态带 。按扩增有带(1)和扩增无带(0)记录电泳
带谱 ,形成 RAPD表型数据矩阵 ,统计多态带的比率(PPB)。用
NTSYS-pc2.02j数据软件计算相似性系数 S(Similarity),进行非
加权算术平均数聚类(UPGMA)分析样品间的遗传关系 。相似
性系数的计算公式:Sxy=2Nxy/(Nx+Ny),式中 , Nxy代表样品
X和 Y共有带的数目 , Nx、Ny代表样品 X和 Y各自具有的带数。
当 S=0时 ,两者差异最大;S=1时 ,两者相似性最大。
2　结果与分析
2.1　居群间的遗传多样性分析　用引物 OPB-20对混合样品及
其各单株的样品进行扩增 ,结果(图略 ,详见第 22页 Fig.1)表
明 ,混合样品的 RAPD带谱中包含了个体样品扩增中的所有单
态带和大部分多态带 ,仅有少数多态带在混合样品中出现扩增
阴性 。因此 ,在略微低估遗传变异能力的情况下 ,混合样品可以
作为个体样品的代表 ,对整个居群的遗传多样性进行评价。
在筛选所有 60条引物中 ,有 18条对样品表现出多态性 ,可
作为居群间分析所用引物 ,序列见表 2,部分引物筛选结果见第
22页 Fig.2。
　　表 2 居群间 RAPD分析所用引物
编号 引物碱基顺序(5′～ 3′) 编号 引物碱基顺序(5′～ 3′)
OPM-02 ACAACGCCTC OPM-19 CCTTCAGGCAOPM-04 GGCGGTTGTC OPB-02 TGATCCCTGG
OPM-06 CTGGGCAACT OPB-03 CATCCCCCTG
OPM-07 CCGTGACTCA OPB-04 GGACTGGAGTOPM-08 TCTGTTCCCC OPB-05 TGCGCCCTTC
OPM-09 GTCTTGCGGA OPB-19 CCACAGCAGTOPM-10 TCTGGCGCAC OPT-07 GGCAGGCTGT
OPM-11 GTCCACTGTG OPT-10 CCTTCGGAAGOPM-17 TCAGTCCGGG OPT-11 TTCCCCGCGA
(下转第 28页)
23XUHai-xiaetal.GeneticDiversityofAchnatherumSplendens
3-fullRACEcoreset,按照试剂盒说明书进行操作 。 5-RACE采
用的引物为 X-RT、X2F1、X2F2、X2R1和 X2R2;3-RACE采用的
引物为 X2F1和试剂盒里的 3-adaptor引物 。
1.2.4　TA克隆。将用胶回收试剂盒回收的 PCR产物 , 与
pMD18-T载体 、T4DNA连接酶混合 。 10 μl反应体系的组成为:
pMD18-TVectorDNA1μl, InsertDNA4 μl, SolutionI5 μl。 16
℃连接过夜 ,并转化大肠杆菌 JM109的感受态细胞 ,在含 X-Gal、
IPTG、Amp的 LB培养基上 , 37℃培养过夜直至长出白色菌落。
1.2.5　感受态细胞的制备 、重组质粒转化大肠杆菌。参照文献
[ 7]进行 。
1.2.6　阳性克隆的筛选 。挑选若干白色菌落 ,用 10μlddH2 O
混合后 ,取 1 μl菌液采用相应的引物进行 PCR检测 。检测条件
为 25μl反应体系 ,其组成为:菌液 、上 、下游引物各 1μl, dNTP
(2.5mmol/L)2μl, MgC12(25mmol/L)1.5μl, 10×Bufer2.5
μl, Taq0.25μl,加 dH2O至 25μl。反应条件为:94 ℃预变性 5
min, 94 ℃变性 30s, 56℃退火 30s, 72℃延伸 0.5 ～ 1.0 min, 35
个循环 , 72℃延伸 10 min,取 5μl反应产物电泳检测。
1.2.7　DNA测序和序列分析 。得到的阳性克隆经 PCR验证
后 ,将阳性菌穿刺培养后送上海英俊公司测序 。采用 ABI公司
的 3730型全自动 DNA测序仪 。对测序结果采用 Multalin软件
进行 cDNA序列比对分析 。
2　结果与分析
2.1　猪十二指肠总 RNA提取　所提取的 RNA28 S和 18 S的
带型较好 ,亮度比接近 2∶1,此外 , A260 /A280=2.01 ,说明 RNA
完整性很好 ,在提取过程中没有降解 ,纯度较高 ,可以用于 RT—
PCR扩增(图 1)。
2.2　猪 GPX2基因片段兼并引物扩增　在反转录合成第一链
cDNA后 ,以反转录产物为模板 ,采用兼并引物对 P1和 P2进行
PCR扩增 ,扩增出 1条约 330bp的条带(图 2),经 TA克隆 ,测序
分析后 ,该片段正是目的基因片段 。
2.3　GPX2基因的 5-RACE和 3-RACE克隆分析　在获得 1段
已知 GPX2基因片段的基础上 ,设计反转录引物 X-RT和巢氏引
物对(Nestprimers):X2F1 /X2R1和 X2F2/X2R2 ,采用 TaKaRa
5-fullRACEcoreset扩增 GPX2基因片段 5 -端序列 ,同时用引
物对 X2F1/3-adaptor以第一链 cDNA为模板扩增 GPX2基因 3 -
端序列 。经巢氏扩增后 ,用引物对 X2F2 /X2R2扩增出 1条约
300bp的目的基因片段(图 3第 2泳道),用 X2F1/3-adaptor引物
对扩增出了 1条约 700bp的目标基因条带(图 3第 1泳道)。经
TA克隆并测序验证后 ,上述片段正是猪 GPX2目标基因片段 。
2.4　GPX2基因序列分析　克隆测序的 5 -端片段和 3 -端片
段经序列拼接后 ,获得了 1条 924bp的 GPX2基因 mRNA序列 ,
该序列 3 -末端完整 ,距 5 -端起始密码子 ATG约 100 bp,将该
基因提交 NCBIGenBank数据库 ,序列编号为 DQ98982。该基因
在第 114 ～ 116位置序列为 TGA,编码 1个硒代半胱氨酸残基
(Sec)。 Multalin比对分析显示 ,该基因与人 、鼠 、牛、狗等物种
GPX2基因有很高的序列同源性(图略 ,详见第 26页 Fig.4),进
一步证明克隆的基因就是猪 GPX2基因。
　　　　　　　　注:1, 2分别为猪十二指肠
总 RNA的提取样品。
图 1　猪十二指肠总 RNA的提取结果
　　　　　　注:M为marker;1为GPX2
RT—PCR片段。
　　　　　　图 2　GPX2目的基因片段
RT—PCR扩增结果
　　　注:M为 marker;1为GPX2的 3 -RACE产物;
2为 GPX2的 5-RACE产物。
　　　　　　图 3　GPX2基因RACE扩增
(上接第 23页)
　　采用筛选出的 18条引物对供试材料进行扩增 、聚类分析
后发现(图略 ,详见第 22页 Fig.3),在 7个芨芨草居群中共检
测到 162个 RAPD位点 ,其中多态性位点占 68.2%,表明 7个
居群间有一定程度的遗传分化 。在天山以北的 2个石河子居
群与奎屯居群 、奇台居群 、布尔津居群聚为第一类 ,位于天山主
脉和侧脉之间的霍城居群聚为第二类 ,天山以南的和静居群与
其他居群相差较远 ,聚为第三类 。新疆三山夹两盆的特殊地
形 ,造成地理区域分隔及不同地理种群生境的异质性 ,进而形
成种群间的遗传多样性 。
2.2　居群内的遗传多样性分析　从 60条引物中筛选出 16条
引物 ,对地理位置相距较近的 2个石河子居群作遗传多样性分
析 ,引物编号和碱基序列见表 3,部分引物筛选结果见第 59页
Fig.1,多态带的比率为将军山居群 62.2%,北湖居群 78.5%。
3　讨论
笔者通过 RAPD技术对野生芨芨草居群间与居群内的遗
传多样性进行研究 ,发现遗传距离与地理距离之间有很大相关
性 ,这可能与芨芨草是风媒花 、异花授粉特性有关 。植物居群
间的遗传分化与其地理位置、分布范围 、繁育系统 、种子散播方
式有关 ,即植物居群的繁育系统(主要是传粉方式)和种子传
播方式越是有利于居群间的基因交流 ,植物居群间的遗传分化
越小 。该研究中 , 2个石河子居群的地理位置最近 ,因此基因
间的交流频繁 ,两者间的相似性系数最大 。在石河子 2个居群
中 ,北湖居群处于轻度盐碱环境 ,将军山居群处于湿润的山脚
下 ,生态环境比北湖居群更适应植物生长 , 但多态带的比率
(62.2%)却小于北湖居群(78.5%),遗传变异的水平比北湖
居群低 。
　　表 3 居群内 RAPD分析所用引物
编号 引物碱基顺序(5′～ 3′) 编号 引物碱基顺序(5′～ 3′)
OPM-02 ACAACGCCTC OPB-01 GTTTCGCTCC
OPM-06 CTGGGCAACT OPB-02 TGATCCCTGG
OPM-07 CCGTGACTCA OPB-03 CATCCCCCTGOPM-08 TCTGTTCCCC OPB-04 GGACTGGAGT
OPM-09 GTCTTGCGGA OPB-05 TGCGCCCTTC
OPM-10 TCTGGCGCAC OPB-20 GGACCCTTAC
OPM-19 CCTTCAGGCA OPT-07 GGCAGGCTGT
OPM-20 AGGTCTTGGG OPT-10 CCTTCGGAAG
28 AgriculturalScience＆TechnologyVol.9, No.1, 2008