全 文 ：李 婧，曾 媛，龚 胜，等． 大花三色堇 FPNI － PCＲ反应体系的优化［J］． 江苏农业科学，2016，44(5):72 － 75．
doi:10． 15889 / j． issn． 1002 － 1302． 2016． 05． 019
大花三色堇 FPNI － PCＲ反应体系的优化
李 婧，曾 媛，龚 胜，李霆格，杨文汉，王 健
(热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室 /海南大学园艺园林学院，海南海口 570228)
摘要:融合引物与巢式聚合酶链式反应(fusion primer and nested integrated PCＲ，FPNI － PCＲ)是一种分离并扩增已
知序列旁未知序列的有效方法。以大花三色堇(Viola × wittrockiana Gams．)为材料，为提高 FPNI － PCＲ 产物特异性，
增加条带清晰度，降低非特异性条带的干扰，对 FPNI － PCＲ反应体系中第 1 轮的模板 DNA浓度进行对比，优化了第 3
轮反应中引物浓度、Taq DNA 聚合酶浓度、缓冲液用量，筛选了第 3 轮特异性引物的退火温度，进一步完善了 FPNI －
PCＲ反应体系。各因素优化比对试验表明:FPNI － PCＲ第 1 轮反应体系应以稀释后的 DNA为模板，20 μL体系中，用
量在 4． 5 ～ 10 ng。第 3 轮最优反应体系为:20 μL 反应体系中，特异性引物浓度 0． 2 μmol /L，引物 SP2 浓度
0． 75 μmol /L，Taq DNA酶用量 1． 0 U，dNTP用量 2 μL，10 × buffer(20 mmol /L，Mg2 + plus)用量 2 μL，模板 1 μL(第 2 轮
反应稀释 100 倍后取 1 μL为模板)，ddH2O补足。第 3 轮反应中，退火温度为 64 ℃或 66 ℃时条带最为清晰。
关键词:大花三色堇;FPNI － PCＲ;体系优化
中图分类号:Q785 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2016)05 － 0072 － 04
收稿日期:2015 － 09 － 04
基金项目:国家自然科学基金(编号:31060265、31260488);海南大学
中西部计划学科建设项目(编号:ZXBJH － XK008)。
作者简介:李 婧(1990—)，女，山东青岛人，硕士研究生，研究方向
为园林植物分子育种。E － mail:1434835679@ qq． com。
通信作者:王 健，教授，主要从事植物遗传与种质资源研究工作。
Tel:(0898)66276096;E － mail:wjhnau@ 163． com。
融合引物与巢式聚合酶链式反应(fusion primer and nes-
ted integrated PCＲ，FPNI － PCＲ)是一种基于热不对称交错
PCＲ (thermal asymmetric interlaced PCＲ，TAIL － PCＲ)技术原
理的 PCＲ方法［1］，主要是利用目标序列旁的已知序列设计 3
个嵌套特异性引物，与给出的 9 个特殊设计的随机简并引物
(arbitrary degenerate prime，AD)相结合，进行 1 次巢式反应，
并在简并引物的基础上设计 2 个嵌套的特殊引物替换第 1 轮
PCＲ所用随机引物用于第 2、3 轮的扩增。FPNI － PCＲ 中融
合引物(fusion primer)，即特殊设计的随机简并引物，由 3端
的随机寡核苷酸(arbitrary degenerate oligonucleotides)和 5端
可设计特异引物的一段序列组成，该序列用以替换初次 PCＲ
所用简并引物。经过热不对称循环后的产物含有特异引物结
合位点，能有效降低产物稀释后非特异性扩增的影响［2］。
FPNI － PCＲ具有高效灵敏、产物特异性高、重复性好、能够在
较短的时间内获得目标片段等优点，是扩增基因侧翼序列特
别是启动子的有效方法［3］。
FPNI － PCＲ与 TAIL － PCＲ技术类似，其反应产物的稳定
性、可重复性明显受到反应体系模板、引物、Taq DNA聚合酶、
Buffer 以及 3 轮退火温度等因素的影响［4］。在进行
FPNI － PCＲ 反应获取未知序列时，有必要根据上述因素，对
不同因素进行优化组合，以获得最优的反应结果。
大花三色堇(Viola × wittrockiana Gams．)是重要的冬春季
花卉，有着十分丰富的花色和花斑类型，是研究植物花斑形成
的理想植物［5］。笔者所在实验室先前的研究表明，二氢黄酮
醇还原酶(dihydroflavonol reductase，DFＲ)和花青素合成酶
(anthocyanidin synthase，ANS)基因是三色堇花斑由无色转向
着色的关键性基因［6］。关于 DFＲ 和 ANS 的相关研究发现，
其启动子中含有的众多调控元件，与花色素调控密切相
关［7 － 9］。因而这 2 个基因的启动子结构特点，可能是花斑位
置形成的一个关键性因素，其启动子的克隆，对于进一步研究
三色堇色斑的形成具有十分重要的意义。FPNI － PCＲ 技术
是克隆启动子序列的有效方法，而目前关于三色堇 FPNI －
PCＲ技术研究尚无相关报道，本研究以三色堇为材料，对其
FPNI － PCＲ 反应体系进行优化，为三色堇 VwDFＲ 和 VwANS
基因启动子的克隆提供技术基础。
1 材料与方法
1． 1 材料与试剂
大花三色堇品种“宾哥”，花色为黄底黑斑，栽培于海南
大学园艺园林学院基地。
1． 2 方法
1． 2． 1 模板 DNA的提取 提取三色堇幼叶 DNA，步骤参考
尚啸等的改良 CTAB 法［10］，仅核酸分离时改用加 1 /10 体积
的 5 mol /L NaAc。提取的 DNA用 0． 8%的琼脂糖凝胶电泳检
测 DNA质量，电泳结果通过凝胶成像仪(Dolophin － Doc，美
国)拍照，利用紫外分光光度计测浓度。小管分装 － 20 ℃
保存。
1． 2． 2 试验中用到的引物 包括 FPNI － PCＲ 反应体系中的
第 1 轮、第 2 轮、第 3 轮的简并引物、特殊引物(表 1)［1］以及
根据 VwANS基因设计的特异引物(表 2)。
1． 2． 3 FPNI － PCＲ 体系的优化 (1)模板 DNA 浓度筛选。
将提取的 DNA稀释 100、200 倍，然后将未稀释的 DNA 和稀
释不同倍数的 DNA 作为第 1 轮 PCＲ 反应的模板，反应采用
表 1 中的 FP5、FP6、FP7、FP9 这 4 条简并引物，反应程序见表
3，反应体系为 20 μL，具体组分见参考文献［1］。
—27— 江苏农业科学 2016 年第 44 卷第 5 期
表 1 VwANS基因启动子 FPNI － PCＲ扩增的随机简并引物
引物名称 引物序列(5→3) 引物用途
FP1 GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTNTCGASTWTSGWGTT 1st PCＲ primer
FP2 GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTNGTCGASWGANAWGAA 1st PCＲ primer
FP3 GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTWGTGNAGWANCANAGA 1st PCＲ primer
FP4 GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTAGWGNAGWANCAWAGG 1st PCＲ primer
FP5 GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTNGTAWAASGTNTSCAA 1st PCＲ primer
FP6 GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTNGACGASWGANAWGAC 1st PCＲ primer
FP7 GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTNGACGASWGANAWGAA 1st PCＲ primer
FP8 GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTGTNCGASWCANAWGTT 1st PCＲ primer
FP9 GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTNCAGCTWSCTNTSCTT 1st PCＲ primer
SP1 GTAATACGACTCACTATAGGGC 2nd PCＲ primer
SP2 ACTATAGGGCACGCGTGGT 3rd PCＲ primer
表 2 VwANS基因启动子 FPNI － PCＲ扩增巢式引物
引物名称 引物序列(5→3) 引物用途
GSP1 GCTTGCTTCCATAGCCTTGAAT 1st PCＲ primer
GSP2 GCGTGAATCTCTTTCTCCTCG 2nd PCＲ primer
GSP3 CAAAGATGTCCCCAATGCTCGT 3rd PCＲ primer
(2)FPNI － PCＲ反应退火温度的梯度筛选。根据设计的
特异性引物 GSP3 的 TM 值，对第 3 轮退火温度进行梯度筛
选，筛选温度分别是 62、64、66 ℃。
(3)引物、10 × buffer(20 mmol /L，Mg2 + plus)、Taq DNA
酶用量的对比。PCＲ反应采用 20 μL 反应体系，分别对影响
第 3 轮反应体系中的主要参数:引物、10 × buffer(Mg2 + plus)、
Taq DNA酶，设置不同的浓度梯度，具体参数值见表 3。此
外，每 20 μL反应体系中均含有 dNTP(2． 5 mmol /L)2 μL、特
异性引物 0． 2 μmol /L，模板为第 2 轮反应产物稀释 100 倍取
1 μL，加 ddH2O补足至 20 μL。逐一优化每个参数值，优化
时，其他参数值均采用表 3 所列反应参数的第一水平值，引物
采用参考文献［1］中的 FP5、FP6、FP7、FP9 这 4 条简并引物
(表 1)，反应程序见表 4。
表 3 FPNI － PCＲ反应体系各因素与水平
FPNI － PCＲ反应参数
梯度
1 2 3 4
Taq酶(U) 0． 5 1． 0 1． 5
10 × Taq buffer(Mg2 + plus)(μL) 1． 50 1． 75 2． 00
特异引物(μmol /L) 0． 25 0． 50 0． 75 1． 00
表 4 FPNI － PCＲ反应程序
PCＲ反应 循环数 温度状况
第 1 轮 PCＲ 1 95 ℃ 90s
2 94 ℃ 10 s;62 ℃ 30 s;72 ℃ 2 min
1 94 ℃ 10 s;25 ℃ 2 min;* ;72 ℃ 2 min
94 ℃ 10 s;62 ℃ 30 s;72 ℃ 2 min
94 ℃ 10 s;62 ℃ 30 s;72 ℃ 2 min
94 ℃ 10 s;44 ℃ 30 s;72 ℃ 2 min
1 72 ℃ 5 min
第 2 轮 PCＲ 1 95 ℃ 90 s
30 94 ℃ 10 s;62 ℃ 30 s;72 ℃ 2 min
1 72 ℃ 5 min
第 3 轮 PCＲ 1 95 ℃ 90 s
12 94 ℃ 10 s;62 ℃ 30 s;72 ℃ 2 min
1 72 ℃ 5 min
注:* 表示 25 ℃保持 120 s后以 0． 2 ℃ /s升温至 72 ℃。
2 结果与分析
2． 1 DNA的提取结果
以三色堇嫩叶为材料提取 DNA，经紫外分光光度计检
测，浓度为(0． 901 ± 0． 019)μg /L，D260 nm /D280 nm介于 1． 8 ～ 2． 0
之间，说明样品 DNA中杂质较少。0． 8%琼脂糖凝胶电泳结
果如图 1 所示，点样孔无滞留，条带清晰明亮，无明显拖尾现
象，说明 ＲNA 等杂质去除较干净。结果表明，采用改良
CTAB法可以有效地提取三色堇幼叶的 DNA［10］，对于后续
PCＲ反应有利。
2． 2 DNA的浓度对 FPNI － PCＲ的影响
模板 DNA的用量对 FPNI － PCＲ反应有着非常直观的影
响，过多或者过少都会造成产物的不稳定或者无法产生条带。
普通方法提取的 DNA 通常含有杂质，而杂质对 PCＲ 产物的
影响是非常显著的。为了获得清晰条带，降低非特异性扩增，
本试验以 3 个浓度的 DNA为模板，利用 FP5、FP7、FP9 这 3 种
简并引物分别扩增，其他条件相同，结果如图 2 所示。
以未稀释 DNA为模板，3 轮扩增后均无清晰条带(图 2)。
将 DNA模板分别稀释 100、200 倍，随着 DNA 稀释倍数的增
加，简并引物 FP5扩增出的条带数量明显增加，且条带清晰度
明显提升;简并引物 FP9扩增的结果，100倍稀释比200倍稀释
扩增条带数量更多、条带更加清晰(图 2)。同时，7号引物在多
个模板浓度下皆无明显条带，说明利用 FPNI － PCＲ 进行扩增
时，模板的稀释倍数应配合不同的简并引物进行筛选，以期降
低杂质等对反应的影响，才能获得更为清晰的条带。
2． 3 退火温度对扩增产物的影响
通过对 5、7、9 号引物扩增反应的第 3 轮扩增的退火温度
进行筛选，筛选温度为 62、64、66、68 ℃，结果见图 3。总体来
—37—江苏农业科学 2016 年第 44 卷第 5 期
看，64、66 ℃反应效果更好，但是不同引物反应的最佳退火温
度不同，如 FP5 引物 64 ℃下扩增效果较好，FP9 号中超过
700 bp 的条带，在 66 ℃下更清晰。
2． 4 Taq酶的用量对 FPNI － PCＲ的影响
Taq酶在 PCＲ反应体系中用量少，却极为重要，Taq 酶的
类型、用量，甚至是生产商，都会对 PCＲ 产物造成明显的影
响。在本研究中，分别对以 FP6 和 FP7 简并引物扩增获得的
PCＲ产物进行 Taq酶的优化，其他条件全部相同，结果如图 4
所示。试验发现，Taq 酶的用量对反应条带的数量和清晰度
都有一定影响，随着 Taq 酶用量的增加，FP6 和 FP7 扩增的
PCＲ产物的量均有所提高，但 FP6 更为明显，能获得较为清
晰的条带，而 FP7 无明显的清晰条带。以简并引物 FP6 扩
增，Taq酶用量 1． 5 U时比 1． 0 U 时条带亮度只略有提升，且
非特异性扩增也更为明显，表明 Taq酶用量 1． 0 U更为合适。
2． 5 10 × Taq buffer(Mg2 + plus)用量对 FPNI － PCＲ的影响
分别以简并引物 FP6 和 FP7 进行扩增，通过改变 10 ×
Taq buffer(Mg2 + plus)用量，其他条件均相同，结果见图 5。结
果显示，以简并引物 FP6 扩增，3 种缓冲液用量均获得条带，
但用量为 2 μL时，目的条带更为清晰;以简并引物 FP7 扩增，
缓冲液为 1． 5 μL时无条带，由 1． 75 μL增至 2 μL时，条带数
量增加，清晰度略有增加。
2． 6 引物浓度对 FPNI － PCＲ的影响
以 FP6 和 FP7 这 2 种简并引物扩增，对第 3 轮引物 SP2
浓度进行筛选。结果(图 6)显示，引物浓度为 0． 25 μmol /L
时，均无条带，随着引物浓度的上升，条带数量、亮度明显增
加，非特异性扩增同样增加，条带出现模糊现象。由图 6 可
知，以 FP6 和 FP7 为简并引物扩增，第 3 轮引物 SP2 浓度为
0． 75 ～ 1． 0 μmol /L 时，均有较好结果。但从节约成本、提高
条带清晰度、减少非特异性扩增角度考虑，0． 75 μmol /L 时
更佳。
3 结论与讨论
3． 1 结论
从试验结果来看，FPNI － PCＲ 适合以低浓度 DNA 为模
板，第 1 轮反应以稀释后的 DNA为模板，20 μL体系中，用量
在 4． 5 ～ 10 ng。对三色堇 FPNI － PCＲ第 3 轮体系进行优化，
最优反应体系是:20 μL 反应体系中，特异性引物浓度
0． 2 μmol /L，引物 SP2 浓度 0． 75 μmol /L，Taq DNA 酶用量
1. 0 U，dNTP用量 2 μL，10 × buffer(20 mmol /L，Mg2 + plus)用量
2 μL，模板为第 2 轮反应稀释 100 倍后取 1 μL，ddH2O 补足。
第 3轮反应经温度筛选，退火温度 64 ℃或 66 ℃时条带最佳。
3． 2 讨论
FPNI － PCＲ是基于热不对称 PCＲ 技术原理的 PCＲ 方
法，共包括 3 轮 PCＲ反应。其中，第 1 轮反应中，含 3 次高严
谨反应，目的是使高退火温度的特异性引物 SP1 与模板序列
退火延伸;1 次低严谨反应，目的是使简并引物结合到较多的
目的序列上;5 次热不对称的高低特异性循环交替反应，使目
—47— 江苏农业科学 2016 年第 44 卷第 5 期
的片段得以指数性扩增。第 2、3 轮为普通 PCＲ 反应，通过特
异性嵌套引物进一步扩增目的条带。它与普通 TAIL － PCＲ
的主要区别在于给出了经过优化后的一系列简并引物，并在
简并引物的基础上设计了嵌套的特殊引物 FSP1、FSP2 用于
第 2、3 轮的扩增［2］。特异性嵌套引物的存在，使非目的条带
得不到大量扩增，而非目标序列中的发卡结构也能抑制其扩
增，从而提高了目的片段扩增的准确性［11］。
由于 FPNI － PCＲ反应步骤较多，因此影响扩增结果的因
素也较多。首先，第 1 轮的高低严谨热不对称反应是目标片
段扩增的最初环节，而本试验证明，模板浓度是影响第 1 轮反
应结果的关键因素。在研究中发现，低浓度的 DNA模板更容
易获得扩增结果，且模板 DNA的稀释倍数对不同简并引物扩
增的影响不同。在其他 PCＲ 反应的研究中同样发现，植物
DNA模板的浓度对于目的片段的扩增具有很大的影响［12］。
在 TAIL － PCＲ中，通常需要对模板进行稀释，才能获得较为
清晰的条带［4，13］。原因可能是 DNA中所含杂质的影响，未稀
释的高浓度 DNA中所含杂质更多，影响条带扩增，另外，不同
简并引物对模板的浓度要求也可能不同，所适应的模板浓度
存在差异。
在 FPNI － PCＲ 反应中，第 1 轮扩增产物因条带杂、浓度
低，往往无法通过凝胶成像显示，需要通过第 2 轮对目标条带
的进一步扩增获得初步结果。通过第 2 轮产物凝胶成像，以
有条带的第 2 轮稀释产物为模板，通过第 3 轮反应进一步扩
增，以期获得较第 2 轮更为清晰的条带。因此，第 3 轮反应体
系的优化对最终结果的获得具有重要作用。
本研究中，针对第 3 轮 PCＲ 反应中部分因素进行了优
化，结果发现，与 buffer(Mg2 + plus)、Taq DNA酶用量相比，引
物的浓度影响最为显著，随着引物浓度的上升，条带数量、亮
度明显增加。需要注意的是，较高的引物浓度虽有利于扩增，
但会造成条带模糊、非特异性条带增加，这与其他 PCＲ 反应
类似［14］，不利于与第 2 轮条带比对推测目的条带。虽然
FPNI － PCＲ中融合引物特殊且相对较短，有利于与 DNA 模
板结合扩增目的条带，但经过 3 轮反应虽然在一定程度上降
低了非特异条带的干扰，但杂条带的影响仍是影响试验结果
的重要原因［15］。因此，在第 3 轮反应中选出最适当的引物浓
度，具有十分重要的作用。含 Mg2 +的 buffer 缓冲液主要对引
物和模板的退火、Taq DNA酶的稳定起作用，当缓冲液低于一
定限度不能产生条带，但用量过多也会使 dNTP过量结合，非
特异性条带增加，不利于反应［16 － 17］。与缓冲液相对应，Taq
DNA酶用量的多少，同样对 PCＲ 反应存在直接影响，不同的
Taq酶需要配合相应的缓冲液使用，过少无法产生条带，过多
也会造成非特异性扩增［18 － 19］。在本试验中，较高的 buffer 浓
度和 Taq DNA酶均有利于扩增。
PCＲ反应中除各因素外，退火温度对目的条带的获取同
样具有重要作用。相关研究发现，对热不对称 PCＲ 第 3 轮反
应退火温度的优化，能有效地促进目的片段的富集［20］。本试
验第 3 轮 PCＲ反应中，特异性引物的 Tm 值为 65 ℃，通过温
度筛选得出，退火温度为 64 ℃或 66 ℃时，条带更为清晰。
综上所述，本研究发现，在 FPNI － PCＲ 中通过优化反应
体系中各因素的浓度或用量，筛选 3 轮 PCＲ 的退火温度，均
能有效地增加目的条带的清晰度，减少非特异性扩增，为后续
研究打下良好基础，为其他物种基因启动子的研究提供一定
的借鉴作用。
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