全 文 ：中国农业科技导报 , 2009, 11(6):102-110
JournalofAgriculturalScienceandTechnology
　收稿日期:2009-03-24;修回日期:2009-10-10
　基金项目:内蒙古自然科学基金项目(20080404MS0501;20080404Zd07)资助。
　作者简介:蔡 萍 ,副教授,从事草原学和分子生物技术研究。 通讯作者:宛 涛 , 教授 , 从事植物孢粉学和遗传学研究。 Tel:0471-
4307379;E-mail:wantao425@ sohu.com
沙地云杉与近缘种红皮云杉和白扦遗传多样性的 RAPD分析
蔡　萍 1 , 　宛　涛2 , 　张洪波 2 , 　伊卫东 2 , 　李方祯2 , 　孟显国 2 , 　石小俊2
(1.锡林郭勒职业学院 , 内蒙古 锡林浩特 026000;2.内蒙古农业大学生态环境学院 , 呼和浩特 010018)
摘　要:应用随机扩增多态性 DNA(RAPD)技术对内蒙古沙地云杉 8个居群及其近缘种红皮云杉 10个居群 、
白扦 10个居群的遗传多样性进行了研究 , 所用的 16个随机引物在 28个居群中共检测到 172个位点 ,平均每
个引物扩增带数为 10.75条 , 其中多态位点 119个 ,占 69.19%, 表现出丰富的 RAPD多态性。运用 Neis多样
性指数(h)和 Shannons多样性指数(i)估算出 28个居群的遗传多样性水平 , 且反映出遗传变异主要存在于居
群内。根据遗传距离和聚类分析 , 3种云杉聚为三大类 , 沙地云杉与白扦的亲缘关系较与红皮云杉近 ,表明经
过漫长的进化 ,沙地云杉产生了较大的遗传变异 ,因此支持将沙地云杉划分为独立种。
关键词:沙地云杉;RAPD;遗传多样性
中图分类号:Q949.66+6　　　文献标识码:A　　　文章编号:1008-0864(2009)06-0102-09
RAPDAnalysisonGeneticDiversityofPiceamongolica
(H.Q.Wu.)W.D.XuanditsCloseRelativeSpecies
P.koraiensisNakaiandP.meyeriRehd.etWils
CAIPing1 , WANTao2 , ZHANGHong-bo2 , YIWei-dong2 ,
LIFang-zhen2 , MENGXian-guo2 , SHIXiao-jun2
(1.XilinguoleVocationalColege, InnerMongoliaXilinhaote026000;
2.SchoolofEcologyandEnvironment, InnerMongoliaAgriculturalUniversity, Hohhot010018, China)
Abstract:Thegeneticdiversitiesof8 populationsofPiceamongolica(H.Q.Wu.)W.D.Xu, 10 populationsofP.
koraiensisNakai, and10 populationsofP.meyeriRehd.etWilsinInnerMongoliawerestudiedbyrandomamplified
polymorphicDNA(RAPD)method.Using16 randomprimersfrom 28 populations, 172 reproduciblelociwere
yielded, ofwhich119werepolymorphic.Theaverageis10.75perexpandprimerandthepercentageofpolymorphic
lociequaled69.19.TheresultsshowedarichpolymorphismofrandomamplifiedpolymorphicDNA.TheNeisgene
diversity(h)andtheShannonsdiversityindex(i)werechosentoestimatethegeneticdiversityofthis28 popula-
tions, whichindicatedthatgeneticvariabilitymainlyexistsinintra-populations.Accordingtogeneticdistanceand
clusteranalysis, thethreespeciescanbedividedintothreecategories.ThegeneticrelationofPiceamongolica(H.
Q.Wu.)W.D.XuwithP.meyeriRehd.etWilsarenearerthanthatwithP.koraiensisNakai, whichindicatesthat
thereisabiggeneticvariationwithinPiceamongolica(H.Q.Wu.)W.D.Xuthroughevolutionoflongperiodtime.
Therefor, Piceamongolica(H.Q.Wu.)W.D.Xucouldprobablybeclassifiedasaseparatespecies.
Keywords:Piceamongolica(H.Q.Wu.)W.D.Xu;randomamplifiedpolymorphicDNA(RAPD);genetic
diversity
　　遗传多样性(geneticdiversity)作为生物多样
性的重要组成部分 ,是生态系统多样性和物种多
样性的基础。遗传多样性是指种内不同居群之间
或一个居群内不同个体的遗传变异总和[ 1] 。云
杉属(PiceaDietr.)植物是隶属于松科的常绿乔
木[ 2] ,全世界约 40种 ,主要分布在北纬 50°～ 60°
的寒温带或冻原地带 ,少数分布在温带和亚热带
的湿冷亚高山带上;我国共有 16种 9变种 ,引种
栽培 2种 ,主要分布在西南 、西北 、华北 、东北及台
湾等省区 [ 3] 。
沙地云杉 [ Piceamongolica(H.Q.Wu.)W.
D.Xu]是我国的珍稀濒危植物 ,它的原始林在世
界上仅分布于内蒙古森林草原西线南端与浑善达
克沙地东缘之间的白音敖包和白音锡勒 ,分布范
围较为狭窄(43°30′～ 43°36′N, 117°06′～ 117°16′
E),形成了我国十分罕见的沙地森林草原 [ 4] 。由
于沙地云杉所处干旱草原沙地的特殊地理位置和
生态环境 ,使其形成了独立的特性:耐荫 、耐寒 、耐
高温 、耐干旱;主根不发达 ,但根系交织蔓延 ,盘根
错节 ,形成发达的网络状 ,根长超过树高的 3倍以
上 ,根幅为冠幅的 4倍 ,紧紧地吸附在沙地上 ,控
制着根下大片的沙地。所以沙地云杉是防风固
沙 ,防沙治沙的优势树种 ,是抗旱树种基因筛选的
重要资源 ,现在已经并将继续在我国 “三北 ”防护
林建设上起到很好的作用 ,近年来得到了国内外
学者的广泛关注 。保护好这片云杉 ,对研究和防
治我国北方土地荒漠化 ,保护京津地区的周边生
态环境具有重要意义。许多学者曾针对云杉属植
物在植物区系 、生物生态学特性 、种群生态 、遗传
多样性 、生理生化 、染色体核型 、分子生物学及孢
粉学等诸多方面开展了大量研究工作 ,取得了丰
硕的研究成果 [ 5 ～ 10] ,其中也不乏沙地云杉的相关
研究成果 。但是对于沙地云杉的分类学地位以及
与其近缘种之间的分类关系观点不一 ,说法各异 。
本试验应用 RAPD技术对沙地云杉种群的遗
传多样性进行测定 , 同时以其近缘种白扦 (P.
meyeriRehd.etWils)、红皮云杉(P.koraiensisNa-
kai)为对照材料 ,讨论三者之间的遗传多样性水
平的差异 ,探讨沙地云杉与其近缘种红皮云杉和
白扦之间的演化历史和亲缘关系 ,为进一步确定
沙地云杉的系统学地位提供遗传学方面的依据 ,
以期为今后种质资源的保护和合理利用 、种群的
恢复与重建提供科学的理论依据。
1　材料与方法
1.1　样品采集与处理
2008年 5 ～ 7月 ,在各采样地点随机选取 30
株生长正常 、无病虫害的健康植株 ,同时相邻植株
间的距离保持在 50 ～ 100 m。采集植株当年萌发
的嫩叶 ,放在保鲜袋中标记分装 ,用硅胶干燥 ,带
回实验室后置 -70℃冰箱冷冻保存以供提取
DNA。供试材料的具体信息见表 1。
表 1　采样信息
Table1　Samplinginformation.
居群号
Population
number
采集地Colectionsite 地理位置Geography 海拔(m)Altitude(m)
采集时间
Collection
time
Pop1 内蒙古克什克腾旗白音敖包Keshiketengqibaiyinaobao, InnerMongolia
43°51′23″N
117 °13′40″E 1 803.5 2008-5-21
Pop2 内蒙古额尔古Ergunazuoqi, InnerMongolia
51°26′19″N
121°35′22″E 1 508.1 2008-5-25
Pop3 黑龙江省穆梭镇Musuotown, Heilongjiangprovince
44°12′50″N
130°12′20″E 708.8 2008-5-27
Pop4 黑龙江省林海新兴林场Linhaixinxingforestfarm, Heilongjiangprovince
44°25′22″N
128°32′34″E 864.2 2008-5-27
Pop5 吉林省长白山天桥岭Tianqiaoling, Changbaimountain, Jilinprovince 43°21′18″N129°21′56″E 242.7 2008-5-28
Pop6 吉林省汪清县地阴沟DiyingouWangqingcountry, Jilinprovince 43°19′41″N130°12′57″E 486.3 2008-5-29
Pop7 吉林省汪清县金沟岭JingoulingWangqingcountry, Jilinprovince 43°12′21″N130°6′5″E 467.1 2008-5-29
Pop8 吉林省汪清县金沟岭林场Jingoulingforestfarm, wangqingcountry, Jilinprovince
43°3′50″N
130°12′2″E 463.0 2008-5-29
Pop9 吉林省土们岭镇Tumenlingtown, Jilinprovince
44°31′37″N
126°6′43″E 248.4 2008-5-31
1036期 蔡 萍等:沙地云杉与近缘种红皮云杉和白扦遗传多样性的 RAPD分析
续表
居群号
Populationnumber
采集地
Colectionsite
地理位置
Geography
海拔(m)
Altitude(m)
采集时间
Collectiontime
Pop10 吉林省土们岭铁路林场Tumenrailwayforestfarm, Jilinprovince
44°27′50″N
126°12′29″E 252.9 2008-5-31
Pop11 内蒙古呼和浩特大青山Hohhotdaqingmountain, InnerMongolia
41°6′41″N
111°47′26″E 1 702.2 2008-5-20
Pop12 河北省雾灵山森林公园Wulingmountainforestpark, Hebeiprovince
40°22′55″N
117°18′6″E 1 831.4 2008-6-7
Pop13 河北省赛罕坝三道河Saihanbasandaohe, Hebeiprovince
42°25′21″N
116°59′35″E 1 215.0 2008-6-6
Pop14 河北省赛罕坝机械林场Saihanbamachineryforestpark, Hebeiprovince
43°38′34″N
116°45′47″E 1 375.4 2008-6-6
Pop15 内蒙古克什克腾旗乌兰布统Keshiketengqiwulanbutong, InnerMongolia
43°13′56″N
116°18′4″E 1 283.0 2008-6-5
Pop16 内蒙古多伦县蔡木山Caimumountainduoluncountry, InnerMongolia
42°48′48″N
116°51′86″E 1 363.1 2008-6-12
Pop17 内蒙古大板白塔子Dabanbaitazi, InnerMongolia
44°12′10″N
118°30′33″E 923.2 2008-7-14
Pop18 内蒙古大板赛罕自然保护区Dabansaihannaturereserve, InnerMongolia
44°11′54″N
118°43′9″E 1 224.7 2008-7-14
Pop19 内蒙古阿尔山三岔沟Aermountainsanchagou, InnerMongolia 46°39′8″N120°5′37″E 1191.6 2008-7-16
Pop20 内蒙古鄂温克旗伊敏河镇Ewenkeqiyiminhetown, InnerMongolia 48°24′52″N119°16′10″E 696.1 2008-7-18
Pop21 内蒙古正蓝旗扎格斯台Zhenglanqizhagesitai, InnerMongolia 43°51′03′″N116°30′26′″E 1 326.0 2008-5-22
Pop22 内蒙古正蓝旗扎格斯台Zhenglanqizhagesitai, InnerMongolia 43°34′40″N116°32′7″E 1 324.4 2008-5-22
Pop23 内蒙古正蓝旗白音锡勒Zhenglanqibaiyinxile, InnerMongolia
43°42′9 ″N
116°54′38″E 1 213.0 2008-5-22
Pop24 内蒙古克什克腾旗白音敖包Keshiketengqibaiyin-aobao, InnerMongolia
43°51′23″N
117°13′40″E 1 328.4 2008-5-22
Pop25 内蒙古克什克腾旗白音敖包Keshiketengqibaiyin-aobao, InnerMongolia
43°19′8″N
117°7′41″E 1 316.4 2008-5-22
Pop26 内蒙古克什克腾旗白音敖包Keshiketengqibaiyin-aobao, InnerMongolia
43°19′41″N
117°9′14″E 1 325.8 2008-5-22
Pop27 内蒙古克什克腾旗白音敖包林场Keshiketengqibaiyin-aobaoforestfarm, InnerMongolia
43°18′36″N
117°26′34″E 1 233.9 2008-5-22
Pop28 内蒙古克什克腾旗白音敖包林场Keshiketengqibaiyin-aobaoforestfarm, InnerMongolia
43°20′18″N
117°12′21″E 1 296.3 2008-5-22
　注:居群 1～ 10为红皮云杉居群 ,居群 11～ 20为白扦居群 ,居群 21～ 28为沙地云杉居群。
Notes:Pop1～ Pop10arepopulationsofP.koraiensisNakai;Pop11 ～ Pop20arepopulationsofP.meyeriRehd.etWils;Pop21～ Pop28are
populationsofP.mongolica(H.Q.Wu.)W.D.Xu.
1.2　基因组 DNA的提取
在结合前人的实验研究基础上 ,参考 CTAB
法探索出一种快速高效的从叶片中提取本实验材
料基因组 DNA的方法:将约 0.8 g叶片置于干净
的研钵中 ,加入 8%PVP(W/V),再加入液氮 ,快
速在研钵中研磨成粉末 , 将粉末移至灭菌后的
7mL的离心管中;每管加入 2.5 mL65℃预热的
CTAB抽提缓冲液 (2%CTAB, 1.4 mol/LNaCl,
104 中 国 农 业 科 技 导 报 11卷
0.2 mol/LEDTA, 0.1 mol/LTrisHCl, pH8.0),
再加入 4%巯基乙醇 ,充分混匀 ,于 65℃水浴保温
30 min;加入等体积的 Tris饱和酚 /氯仿 /异戊醇
(25∶24∶1, V/V)液 ,充分混匀 ,于 4℃ 8 000 rpm离
心 10 min;将上清液 1 000 μL移至另一洁净的 5
mL离心管中 , 加入等体积的预冷的异戊醇 ,于
-20℃放置 10min;4℃ 2 000 rpm离心 1 min,收
集沉淀 ,置于另一洁净的 7 mL离心管中 , 加入
500 μL65℃的 CTAB溶液 ,轻微震荡使沉淀溶
解 ,于 65℃水浴 30 min;加入等体积的氯仿 /异戊
醇(24∶1, V/V)液 ,充分混匀 ,于 4℃ 6 000rpm离
心 8min;将上清液约 500 μL置于 1.5 mL离心
管中 ,加入等体积的预冷的异丙醇 ,于 -20℃放置
10 min, 4℃ 2 000 rpm离心 1 min,收集沉淀;用
70%乙醇漂洗沉淀两次 ,室温下自然风干 ,加入
100 μLTE(含 RNA降解酶)缓冲液溶解沉淀 ,取
少量用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 ,其余放 -20℃
保存备用 。
1.3　RAPD反应体系及引物的筛选
根据 Wiliams[ 13]等给出的框架 ,在保持基本
成分不变的基础上 ,逐一对其 RAPD反应成分进
行调整 ,最终得到云杉的 RAPD反应体系 (总体
积 25 μL):模板 DNA 2.0 μL;随机引物 (50
μmol/L)0.3 μL;10 ×PCRReactionBufer(含
Mg2+)2.5 μL;dNTP(10 mmol/L)0.5 μL;Taq
DNA聚合酶(2.5 U/μL)0.6 μL,加去离子水至
25 μL。混匀后 ,用石蜡油覆盖 ,放入 PCR仪中进
行扩增。
PCR扩增程序为:93℃预变性 5min;93℃变
性 1min, 41℃退火 1 min, 72℃延伸 2 min,共 40
个循环;总延伸 72℃ 6 min, 4℃保存。设 1个对
照 ,重复 3次。
利用已优化的反应体系和反应程序 ,从 28个
居群中选取地理相距较远的 5个居群做为 DNA
模板 ,对 75条随机引物进行筛选 ,从中选出带型
清晰 ,重复性好 、稳定性高的 16个引物用于沙地
云杉和近缘种红皮云杉 、白扦的 RAPD分析 。所
选 16个有效引物名称及其序列号见表 2。
表 2　16个有效引物及其序列
Table2　Sequencesof16 efectedprimers.
引物
Primer
序列
Sequence
位点数
Reproducible
loci
多态位点数
Polymorphic
loci
引物
Primer
序列
Sequence
位点数
Reproducible
loci
多态位点数
Polymorphic
loci
S8 5′-GTCCACACGG-3′ 12 9 S11 5′-GTAGACCCGT-3′ 13 10
S25 5′-AGGGGTCTTG-3′ 9 6 S26 5′-GGTCCCTGAC-3′ 10 7
S28 5′-GTGACGTAGG-3′ 14 10 S31 5′-CAATCGCCGT-3′ 15 11
S37 5′-GACCGCTTGT-3′ 10 7 S45 5′-TGAGCGGACA-3′ 9 6
S60 5′-ACCCGGTCAC-3′ 9 4 S67 5′-GTCCCGACGA-3′ 14 9
S72 5′-TGTCATCCCC-3′ 8 6 S83 5′-GAGCCCTCCA-3′ 9 5
S427 5′-CAGCCCAGAG-3′ 12 8 S466 5′-GTGGGCTGAC-3′ 11 9
S502 5′-CACAGCTGCC-3′ 9 7 S1077 5′-CAGCGGTCAC-3′ 8 5
1.4　数据分析
将 PCR扩增产物用 1.8%的琼脂糖凝胶进行
电泳 ,并在凝胶中加入定量的核酸染料 ,利用
UPV凝胶成像系统观察照相 ,根据电泳图谱对反
应产物进行统计 ,在电泳图谱上同一个位点 ,有扩
增条带出现计为 1,无扩增带计为 0。将 0 /1矩阵
输入计算机 ,采用 Pop-gen32 Version.l31程序计
算出沙地云杉 、红皮云杉及白扦的种群的 Neis多
样性指数(h)、Shannons多样性指数(i)、遗传一
致度(I)和遗传距离 (D),并进行 UPGMA(un-
weightedpair-groupmethodwitharithmeticmean)聚
类分析 、构建亲缘关系的聚类图。
2　结果与分析
2.1　居群的遗传多样性分析
由表 2数据可知 , 16个随机引物在沙地云
杉 、红皮云杉及白扦的 28个居群中共检测到 172
个位点 ,平均每个引物扩增带数为 10.75条 ,其中
多态位点 119个 ,占 69.19%(部分引物的扩增结
1056期 蔡 萍等:沙地云杉与近缘种红皮云杉和白扦遗传多样性的 RAPD分析
果见图 1、图 2)。在衡量植物居群遗传多样性的
参数中 ,基于 Hardy-Weinberg平衡假设的 Neis多
样性指数(h)和 Shannons多样性指数(i)在衡量
植物遗传多样性中 ,是更为可信的指标 ,在许多研
究中得到了完全一致的变化趋势 [ 14, 15] 。用 Pop-
Gen32软件计算出各居群的 Neis多样性指数和
Shannons多样性指数 ,由表 3可以看出居群 10
的 Neis多样性指数和 Shannons多样性指数最
高 ,分别为 0.179 1和 0.264 2,居群 3的 Neis多
样性指数和 Shannons多样性指数最低 , 分别为
0.093 6和 0.139 4,但不同引物在不同种群及同
种不同居群中检测出的不同 Neis多样性指数和
Shannons多样性指数具有相同的变化趋势 (见
表 3),并且沙地云杉居群较红皮云杉及白扦居群
的遗传多样性水平高 。已有研究表明 ,当植物生
活在自然环境极其恶劣的条件下时 ,为了适应复
杂恶劣的环境 ,往往具有相对较高的遗传多样性
水平 [ 16, 17] ,沙地云杉保持有较高的遗传多样性水
平可能是受其所处生态环境的影响 。
由 Neis多样性指数估算出的基因多样性表明:在
总的遗传变异中 ,有 47.58%的遗传变异存在于
种群间 ,有 52.42%的遗传变异存在于种群内部 ,
这可能是由于云杉寿命长 ,风媒异花授粉 ,基因交
流频繁等导致了种群间较高水平的遗传变异 。
表 3　沙地云杉和红皮云杉及白扦居群的遗传多样性
Table3　GeneticdiversityofPicea.mongolica
(H.Q.Wu.)W.D.XuandP.koraiensisNakaiand
P.meyeriRehd.etWilspopulations.
名称及居群
Population
Neis
多样性指数(h)
Neis
diversityindexch(h)
Shannons
多样性指数(i)
Shannons
diversityindex(i)
Pop1 0.139 5 0.209 2
Pop2 0.098 2 0.146 9
Pop3 0.093 6 0.139 4
Pop4 0.138 1 0.204 3
Pop5 0.126 5 0.186 2
Pop6 0.098 9 0.151 5
Pop7 0.128 5 0.192 3
Pop8 0.115 3 0.174 1
Pop9 0.119 4 0.178 6
Pop10 0.126 3 0.185 5
Pop11 0.149 4 0.220 8
Pop12 0.148 2 0.217 7
Pop13 0.137 6 0.215 8
Pop14 0.136 0 0.200 8
Pop15 0.143 0 0.214 1
Pop16 0.146 2 0.220 7
Pop17 0.152 3 0.239 3
Pop18 0.154 2 0.243 6
Pop19 0.166 8 0.248 0
Pop20 0.154 7 0.237 8
Pop21 0.166 9 0.255 7
Pop22 0.176 2 0.256 7
Pop23 0.179 1 0.264 2
Pop24 0.163 3 0.276 3
Pop25 0.175 2 0.261 3
Pop26 0.158 2 0.237 6
Pop27 0.174 2 0.265 7
Pop28 0.167 9 0.257 5
平均
Average 0.144 1 0.217 9
　注:居群 1 ～ 10为红皮云杉居群 ,居群 11～ 20为白扦居群 ,居
群 21～ 28为沙地云杉居群
Notes:Pop1 ～ Pop10 arepopulationsofP.koraiensisNakai;
Pop11 ～ Pop20arepopulationsofP.MeyeriRehd.etWils;Pop21
～ Pop28arepopulationsofP.mongolica(H.Q.Wu.)W.D.Xu.
106 中 国 农 业 科 技 导 报 11卷
2.2　居群的聚类分析
遗传一致度(geneticidentity, I)和遗传距离
(geneticdistance, D)是评价居群内和居群间遗传
变异水平的重要指标 ,遗传距离越小 ,亲缘关系越
近 ,遗传距离越大 ,亲缘关系越远。根据 16个有
效引物 PCR扩增产物的电泳结果 ,用 PopGen32
软件分析 RAPD扩增结果 ,得到沙地云杉 8个居
群及其近缘种红皮云杉 10个居群 、白扦 10个居
群的遗传一致度和遗传距离(表 4)。 28个居群
的遗传距离介于 0.331 5 ～ 0.325 5之间;沙地云杉
的 8个居群与白扦 10个居群的平均遗传距离为
0.257 0,沙地云杉 8个居群与红皮云杉 10个居
群的平均遗传距离为 0.278 6,沙地云杉各居群间
的平均遗传距离为 0.052 4,白扦各居群间的平均
遗传距离为 0.194 8,红皮云杉各居群间的平均遗
传距离为 0.123 0。 Thorp[ 18]通过统计分析研究
认为:遗传相似度 I<0.85,遗传距离 D>0.16的
两个居群 , 不可能是同一物种;同科属间 I是
0.1 ～ 0.5(D为 0.5 ～ 0.9),不同物种间 I=0.2 ～
0.8, D为 0.2 ～ 0.8, 而同种居群间 I=0.8 ～
0.97, D=0.03 ～ 0.22。由以上数据分析 , 8个沙
地云杉居群与 10个红皮云杉居群 、10个白扦居
群的遗传距离明显大于白扦 、红皮云杉各居群间
的遗传距离 ,遗传距离的聚类结果显示(图 3)。
28个居群可明显聚为三大类 ,沙地云杉各居群最
先聚为一类 ,白扦 、红皮云杉各居群各自聚为一
类 ,沙地云杉与红皮云杉 、白扦居群间保持着较大
的遗传距离 ,表明沙地云杉与红皮云杉 、白扦有较
远的亲缘关系 ,因此本研究认为应将沙地云杉划
分为一个独立种。
沙地云杉各居群间个体水平上的遗传距离存
在一定差异(见表 4),最大是居群 24和居群 23,
为 0.061 7,最小是居群 21和居群 22,为 0.035 2,
由遗传距离的聚类结果可以看出(见图 3),居群
21、居群 22和居群 23先聚为 1支 ,其他 5个居群
聚为 1支 ,最后 2个居群聚为一支 。白扦 10个居
群中 ,居群 13和居群 14的所处的生境及地理分
布距离最接近 ,故 2个居群最先聚为一类;居群
12、居群 16、居群 15和居群 13、居群 14的地理分
布距离较近 ,故前三者先于其他居群与居群 13和
居群 14聚为一类 ,居群 11与其他居群地理分布
距离相对都较远 ,因此聚在了最外缘。红皮云杉
的 10个居群中 ,居群 9和居群 10先聚为 1支 ,所
处生境及地理距离较近的居群 5居群 、居群 6、居
群 7、居群 8聚为 1支 ,居群 1和居群 2与其他居
群分布相距较远 ,聚在最外缘。各居群的地理分
布与其聚类结果存在着极大的相关性。沙地云杉
的 8个居群先与白扦的 10个居群聚为一类 ,二者
再与红皮云杉的 10个居群聚为一大类 ,说明沙地
云杉与白扦较与红皮云杉的亲缘关系近 。
图 3　沙地云杉和红皮云杉 、白扦居群的聚类图
Fig.3　DendrogramofP.mongolica(H.Q.Wu.)W.D.Xu., P.koraiensisNakaiand
P.meyeriRehd.etWilspopulations.
1076期 蔡 萍等:沙地云杉与近缘种红皮云杉和白扦遗传多样性的 RAPD分析
表 4　沙地云杉与红皮云杉及白扦居群遗传一致度和遗传距离
Table4　GeneticidentilyandgeneticdistanceamongP.mongolica(H.Q.Wu.)W.D.Xu.,
P.koraiensisNakai, andP.meyeriRehd.etWilspopulations.
居群
Board
group
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
1 ＊＊＊＊ 0.831 4 0.863 9 0.852 7 0.847 7 0.849 2 0.851 7 0.877 8 0.851 6 0.842 6 0.782 3 0.772 9 0.764 6 0.752 8
2 0.184 6 ＊＊＊＊ 0.855 9 0.848 6 0.836 2 0.843 1 0.864 6 0.842 0 0.857 6 0.845 2 0.762 9 0.732 7 0.746 2 0.774 7
3 0.146 3 0.155 6 ＊＊＊＊ 0.920 4 0.879 1 0.879 2 0.872 1 0.887 4 0.876 3 0.891 5 0.743 2 0.752 5 0.756 9 0.771 3
4 0.159 3 0.164 2 0.082 9 ＊＊＊＊ 0.882 6 0.874 3 0.864 5 0.900 2 0.879 2 0.885 2 0.763 2 0.732 6 0.791 4 0.752 3
5 0.165 2 0.178 9 0.128 9 0.124 9 ＊＊＊＊ 0.921 8 0.927 6 0.920 9 0.891 6 0.896 7 0.758 9 0.741 8 0.774 2 0.736 1
6 0.163 5 0.170 7 0.128 7 0.134 3 0.081 4 ＊＊＊＊ 0.950 6 0.948 7 0.865 0 0.871 5 0.754 2 0.724 1 0.768 2 0.745 3
7 0.160 5 0.145 5 0.136 9 0.145 6 0.075 2 0.050 7 ＊＊＊＊ 0.946 9 0.869 3 0.873 9 0.745 2 0.772 1 0.738 7 0.753 7
8 0.130 3 0.172 0 0.119 5 0.105 1 0.082 4 0.052 7 0.054 6 ＊＊＊＊ 0.852 4 0.868 2 0.762 5 0.751 8 0.743 7 0.775 9
9 0.160 6 0.153 6 0.132 0 0.128 7 0.114 7 0.145 0 0.140 1 0.159 7 ＊＊＊＊ 0.960 9 0.751 6 0.732 9 0.764 5 0.737 4
10 0.171 3 0.168 2 0.114 8 0.121 9 0.109 0 0.137 5 0.134 8 0.141 3 0.039 9 ＊＊＊＊ 0.759 2 0.764 8 0.758 1 0.757 9
11 0.245 5 0.270 6 0.296 8 0.270 2 0.275 9 0.282 1 0.294 1 0.271 2 0.285 6 0.275 5 ＊＊＊＊ 0.827 9 0.831 1 0.842 5
12 0.257 6 0.311 0 0.284 4 0.311 2 0.298 7 0.322 8 0.258 6 0.285 3 0.310 7 0.268 1 0.188 9 ＊＊＊＊ 0.886 5 0.942 1
13 0.268 4 0.292 8 0.278 5 0.234 0 0.255 9 0.263 7 0.302 9 0.296 1 0.268 5 0.276 9 0.185 0 0.120 5 ＊＊＊＊ 0.961 3
14 0.284 0 0.255 3 0.259 7 0.284 6 0.306 4 0.294 0 0.282 8 0.253 7 0.304 6 0.277 2 0.171 4 0.059 6 0.039 5 ＊＊＊＊
15 0.272 5 0.244 0 0.307 7 0.265 0 0.255 2 0.277 2 0.269 1 0.246 4 0.312 2 0.290 1 0.171 0 0.060 8 0.104 9 0.105 6
16 0.288 6 0.270 8 0.257 6 0.311 4 0.282 0 0.297 2 0.306 4 0.280 8 0.246 8 0.288 2 0.171 6 0.070 3 0.074 9 0.074 4
17 0.271 2 0.243 9 0.292 6 0.322 1 0.293 4 0.294 6 0.242 7 0.244 4 0.283 3 0.257 2 0.176 6 0.125 1 0.159 2 0.150 5
18 0.259 7 0.291 0 0.282 5 0.298 3 0.272 3 0.281 4 0.292 9 0.289 8 0.317 3 0.284 2 0.159 9 0.129 4 0.146 5 0.143 1
19 0.278 0 0.271 4 0.246 8 0.279 6 0.241 6 0.269 6 0.276 5 0.296 5 0.254 1 0.257 3 0.197 2 0.172 3 0.175 3 0.184 5
20 0.271 8 0.293 6 0.279 2 0.255 4 0.283 6 0.276 9 0.256 4 0.295 3 0.266 8 0.262 4 0.194 7 0.176 9 0.189 2 0.174 0
21 0.244 2 0.232 7 0.269 4 0.297 5 0.270 0 0.323 4 0.297 3 0.312 7 0.305 0 0.292 8 0.257 6 0.279 4 0.262 4 0.258 6
22 0.275 5 0.269 4 0.291 4 0.255 0 0.275 4 0.237 6 0.304 1 0.271 2 0.331 6 0.272 2 0.283 2 0.301 9 0.253 9 0.243 7
23 0.297 2 0.255 0 0.256 1 0.231 7 0.302 9 0.299 2 0.276 8 0.327 0 0.285 3 0.290 6 0.278 0 0.264 1 0.262 3 0.255 5
24 0.274 8 0.271 7 0.288 7 0.279 1 0.272 7 0.291 4 0.236 7 0.254 6 0.322 0 0.245 4 0.245 8 0.275 9 0.243 2 0.246 9
25 0.263 6 0.313 2 0.281 4 0.245 4 0.283 8 0.323 2 0.330 9 0.282 8 0.313 3 0.279 3 0.249 2 0.245 8 0.249 1 0.303 5
26 0.275 5 0.276 7 0.256 8 0.296 0 0.284 0 0.231 8 0.289 0 0.293 2 0.290 9 0.255 5 0.241 6 0.257 3 0.243 7 0.266 7
27 0.256 7 0.273 3 0.287 9 0.269 4 0.329 3 0.292 9 0.281 8 0.245 0 0.307 6 0.286 1 0.249 4 0.253 3 0.250 8 0.256 6
28 0.241 8 0.244 4 0.279 4 0.255 4 0.284 5 0.267 7 0.263 6 0.234 0 0.275 5 0.256 3 0.301 4 0.262 1 0.286 0 0.275 5
居群
Board
group
15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
1 0.761 5 0.749 3 0.762 5 0.771 3 0.757 3 0.762 0 0.783 3 0.759 2 0.742 9 0.759 7 0.768 3 0.759 2 0.773 6 0.785 2
2 0.783 5 0.762 8 0.783 6 0.747 5 0.762 3 0.745 6 0.792 4 0.763 8 0.774 9 0.762 1 0.731 1 0.758 3 0.760 9 0.783 2
3 0.735 1 0.772 9 0.746 3 0.753 9 0.781 3 0.756 4 0.763 8 0.747 2 0.774 1 0.749 2 0.754 7 0.773 5 0.749 8 0.756 2
4 0.767 2 0.732 4 0.724 6 0.742 1 0.756 1 0.774 6 0.742 7 0.774 9 0.793 2 0.756 5 0.782 4 0.743 8 0.763 8 0.774 6
5 0.774 8 0.754 3 0.745 7 0.761 6 0.785 4 0.753 1 0.763 4 0.759 3 0.738 7 0.761 3 0.752 9 0.752 8 0.719 4 0.752 4
6 0.757 9 0.742 9 0.744 8 0.754 7 0.763 7 0.758 1 0.723 7 0.788 5 0.741 4 0.747 2 0.723 8 0.793 1 0.746 1 0.765 1
7 0.764 1 0.736 1 0.784 5 0.746 1 0.758 4 0.773 8 0.742 8 0.737 8 0.758 2 0.789 2 0.718 3 0.749 0 0.754 4 0.768 3
8 0.781 6 0.755 2 0.783 2 0.748 4 0.743 4 0.744 3 0.731 5 0.762 5 0.721 1 0.775 2 0.753 7 0.745 9 0.782 7 0.791 4
9 0.731 8 0.781 3 0.753 3 0.728 1 0.775 6 0.765 8 0.737 1 0.717 8 0.751 8 0.724 7 0.731 0 0.747 6 0.735 2 0.759 2
10 0.748 2 0.749 6 0.773 2 0.752 6 0.773 1 0.769 2 0.746 2 0.761 7 0.747 8 0.782 4 0.756 3 0.774 5 0.751 2 0.773 9
11 0.842 8 0.842 3 0.838 1 0.852 2 0.821 0 0.823 1 0.772 9 0.753 4 0.757 3 0.782 1 0.779 4 0.785 4 0.779 3 0.739 8
12 0.941 0 0.932 1 0.882 4 0.878 6 0.841 7 0.837 9 0.756 2 0.739 4 0.767 9 0.758 9 0.782 1 0.773 1 0.776 2 0.769 4
13 0.900 4 0.927 8 0.852 8 0.863 7 0.839 2 0.827 6 0.769 2 0.775 8 0.769 3 0.784 1 0.779 5 0.783 7 0.778 2 0.751 3
108 中 国 农 业 科 技 导 报 11卷
续表
居群
Board
group
15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
14 0.899 8 0.928 3 0.860 3 0.866 7 0.831 5 0.840 3 0.772 1 0.783 7 0.774 5 0.781 2 0.738 2 0.765 9 0.773 7 0.759 2
15 ＊＊＊＊ 0.921 6 0.884 5 0.880 2 0.856 2 0.849 6 0.787 5 0.787 0 0.790 7 0.782 8 0.776 9 0.781 9 0.786 3 0.779 8
16 0.081 6 ＊＊＊＊ 0.859 2 0.867 3 0.852 8 0.83 1 0.773 9 0.784 9 0.786 1 0.742 6 0.779 3 0.780 9 0.776 1 0.767 8
17 0.122 7 0.151 8 ＊＊＊＊ 0.960 2 0.858 4 0.860 6 0.792 1 0.796 1 0.799 2 0.797 3 0.789 6 0.794 4 0.796 8 0.793 6
18 0.127 6 0.142 4 0.040 6 ＊＊＊＊ 0.852 3 0.859 7 0.789 4 0.790 3 0.794 7 0.785 9 0.793 8 0.794 1 0.796 2 0.787 9
19 0.155 3 0.159 2 0.152 7 0.159 8 ＊＊＊＊ 0.910 7 0.742 8 0.769 3 0.751 9 0.763 8 0.740 7 0.759 8 0.748 3 0.768 9
20 0.163 0 0.185 1 0.150 1 0.151 2 0.093 5 ＊＊＊＊ 0.742 7 0.754 7 0.776 8 0.766 2 0.758 4 0.729 7 0.779 0 0.764 7
21 0.238 9 0.256 3 0.233 1 0.235 6 0.297 3 0.297 5 ＊＊＊＊ 0.965 4 0.953 4 0.950 2 0.945 8 0.948 3 0.949 1 0.942 7
22 0.239 5 0.242 2 0.228 0 0.235 3 0.262 3 0.281 4 0.035 2 ＊＊＊＊ 0.958 7 0.942 1 0.943 5 0/946 2 0.948 5 0.945 5
23 0.234 8 0.240 7 0.224 1 0.229 8 0.285 2 0.252 6 0.047 7 0.042 2 ＊＊＊＊ 0.940 2 0.938 9 0.941 0 0.943 6 0.944 5
24 0.244 9 0.297 6 0.226 5 0.240 9 0.269 4 0.266 3 0.051 1 0.059 6 0.061 7 ＊＊＊＊ 0.953 0 0.963 2 0.947 6 0.948 3
25 0.252 4 0.249 4 0.236 2 0.230 9 0.300 2 0.276 5 0.055 7 0.058 2 0.063 0 0.048 1 ＊＊＊＊ 0.946 2 0.954 1 0.949 8
26 0.246 0 0.247 3 0.230 2 0.230 5 0.274 7 0.315 1 0.053 1 0.055 3 0.060 8 0.037 5 0.055 3 ＊＊＊＊ 0.951 3 0.948 4
27 0.240 4 0.253 5 0.227 2 0.227 9 0.290 0 0.249 7 0.052 2 0.052 9 0.058 1 0.053 8 0.04 7 0.049 9 ＊＊＊＊ 0.962 0
28 0.248 7 0.264 2 0.231 2 0.238 4 0.262 8 0.268 3 0.059 0 0.056 0 0.057 1 0.053 1 0.051 5 0.053 0 0.038 7 ＊＊＊＊
　注:上三角为遗传一致度 ,下三角为遗传距离;居群 1 ～ 10为红皮云杉居群 ,居群 11～ 20为白扦居群 ,居群 21 ～ 28为沙地云杉居群。
Notes:Neisgeneticidentity(abovediagonal)andgeneticdistance(belowdiagonal);Pop1 ～ Pop10arepopulationsofP.koraiensisNakai;
Pop11～ Pop20arepopulationsofP.meyeriRehd.etWils;Pop21～ Pop28arepopulationsofP.mongolica(H.Q.Wu.)W.D.Xu.
3　讨论
取样策略(samplingstrategy)是生物多样性有
效保护 、利用等研究所面临的最基本问题 ,如果没
有一个合理的取样策略 ,研究的结果便很难客观
揭示保护研究对象的遗传变异的规律。一些学者
对取样策略进行了理论与实验研究 ,得出结论:当
居群取样个体数为 30个左右时 ,既可以得到较为
准确的遗传参数估算值 ,又可以得到较为稳定而
合理的近缘种亲缘关系分析[ 19] 。本研究中 ,各居
群取样均为 30株 ,基本能够反映居群的整体遗传
变异水平 。RAPD的可重复性及假带现象曾使研
究者们一度对其产生怀疑态度 ,大量研究表明 ,通
过优化 RAPD试验条件及设定多次重复实验可以
增强其试验结果可重复性 ,克服假带的产生 [ 20] 。
而关于 RAPD系统学价值问题 ,目前有许多研究
已作了肯定的回答 [ 21] ,基于 RAPD的分类结果也
表现出与经典形态分类良好的一致性 [ 22] 。
关于沙地云杉的归属问题一直争论较大 。一
些学者认为沙地云杉为白扦 [ 23] ;另有学者则认为
是红皮云杉[ 3, 24, 25] 。 1986年 ,周以良等 [ 26]在黑龙
江树木志中记载为白扦;同年 ,乌弘奇 [ 27]将此种
云杉与白扦和红皮云杉的外部形态进行比较 ,认
为沙地云杉是白扦的一个变种(P.meyerivar.
mongolica);徐文铎等[ 28]根据形态解剖 、栽培试
验 、同工酶和核型分析以及生态地理分布的研究 ,
将其确定为新种沙地云杉 P.mongolica(H.Q.
Wu)W.D.Xu(P.meyerivar.mongolicaH.Q.
Wu)。而李春红等 [ 29]根据沙地云杉的外部形态
及解剖结构 ,采用多元统计的方法进行分析 ,认为
沙地云杉是白扦的一个变种 , 即蒙古云杉 (P.
meyerivar.mongolia)。本文在结合前人研究的基
础上 ,以近缘种红皮云杉和白扦为对照 ,对比研究
了沙地云杉遗传多样性 ,实验结果表明以 Neis多
样性指数和 Shannons多样性指数作为衡量指标 ,
8个沙地云杉居群和 10个红皮云杉居群 , 10个白
扦居群间具有一致的变异趋势 ,且沙地云杉较红
皮云杉 、白扦保持有较高的遗传多样性水平 。由
居群的遗传距离得知 ,沙地云杉与红皮云杉 、白扦
之间存在较高的遗传变异;而遗传距离的聚类图
显示 ,沙地云杉与红皮云杉 、白扦聚为明显的三大
类群 ,因此沙地云杉可以作为一个独立种存在 。
实验结果验证了徐文铎等 [ 28] 关于沙地云杉是一
个独立种的结论 ,同时表明 RAPD可以用于沙地
云杉系统学的研究 。
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110 中 国 农 业 科 技 导 报 11卷