全 文 ：拱生物工程 口品职字 20 . 7V oL 2 8, oN . 04 1夕9
微量稀释法筛选金钱松内生真菌
抗菌活性的研究
何 佳 ’ ,2 , 陈 钧 ’ ,* , 赵启美 ` .2 , 祁红兵 ’
l(
.江苏大学生物与环境工程学院 , 江苏 镇江 21 2 0 13 ;
.2 河南科技大学食品与生物工程学院 , 河南 洛阳 4 71 0 3)
摘 要 : 首次对金钱松内生真菌进行了分离 , 采用改良氛化三苯四氮哇显色 (T T c) 微量稀释法 , 对其活性菌株进
行筛选 ; 以 1 种常见导致食品腐败的细菌 、 酵母菌 、 霉菌为指示菌 , 研究了活性菌株的抗菌能力 。 结果表明 :
金钱松内存在着广泛的具有抗菌活性的内生真菌 , 占内生真菌总数的 28 . 5% , 高活性菌株占 15 . 2 % , 其中 JJ 18 菌
株发酵粗提物具有强烈的抗细菌 、 酵母菌和丝状真菌的广谱抗菌能力 , J ” 14 抗细菌、 醉母菌活性强 。 金钱松内
生真菌抗菌活性是潜在的食品防腐抗菌资源 . 筛选方法准确可靠 。
关健词 : 金钱松 ; 内生真菌 : 抗菌活性
S tU dy on cS er in gn 冉刀 ilt ul c or b i ia cA it vi yt of E n d o Ph y et s F nU gu s for m sP e u d匕勿瓜加 emP fe 汀 oG dr
iw ht h五e m曲u it o n M e ht do
H E Ji a ,
,
2 , C HE N Ju n ,
·
* , Z HA O Qi
一
m e i ,
·
2 ,
Ql H o n g
一
b i n g ,
( 1
.
S e ho l of B ic
卜 e n v u D nJ 旧e n因 E n g in er 访 g , J ian g s u U ul v饥 iyt ,劝 e闰俪 9 2 120 13 . C ih an :
2
.
S e h o l o f E沉吐 an d B IOe n g川。 日n n g , eH n an U ul v esr i yt of S e l e n c e an d T eC bn o l o g y
,
L u o y an g 4 7 1X() 3
,
C hin a)
A加 t抽 e t : nE d o Ph y比 5 fu n g u s s tr ia n s w眼 翻口 t 忠 n ed if rS Uy fr o m 乃 e姚勿白瓜彻曰哪介万 C O r d . , an d ht e ac it v e s画n s w眼
s c n ” n de iw ht l lr lP or v de T TC .(3 5一itr Ph e n y lte tr 山泊 il uln
c ih o ir d e )而 c m曲 u it on m州bL诚 MI c( rI 山吐 r n u m in ih bi t。 甲 c o n c e n atr it o n)
收稿日期: 2仪巧一 0 3一31 * 通讯作者
基金项目 : 江苏省 2X() 4 年度博士研究生创新计划项目x( m 04 一5 7)
作者简介 : 何佳 ( 19 6 4 一 ) , 男 , 副教授 , 博士研究生 , 研究方向为微生物来源的活性物质 。
异较大 ; 不同的蔬菜由于其营养成分的差别 , 各 自适应
不同种类的乳酸菌的生长 , 其中白菜中以短乳杆菌和链
球菌为主 , 辣椒中短乳杆菌和片球菌更容易繁殖 , 萝
卜中以短乳杆菌为主 ; 由于蔬菜的营养成分复杂 , 单碳
源菌种不能充分利用其营养成分 , 风味代谢产物也不如
多菌种丰富 , 提示我们在制备乳酸菌剂时宜采用复合菌
种 。 从三种供试泡菜中均分离到产亚硝酸盐的乳酸菌 ,
有的含量还很高 , 证实传统蔬菜加工方法生产的发酵蔬
菜存在亚硝酸盐安全隐患 。 现已证实 , 亚硝酸盐是严
重致癌化学物质 , 在国际社会对食品安全日益重视的今
天 , 应引起广大发醉蔬菜生产企业 、 商家 、 政府主管
部门 、 食品科技工作者 , 尤其是广大消费者的高度重
视 , 严加防范 , 加以规避 , 采用不产亚硝酸盐的乳酸
菌剂进行蔬菜纯种发酵应在广大蔬菜加工企业中推广 。
参考文献 :
张岩 , 肖更生 , 陈卫东 , 等 . 发醉蕊菜的研究进展 ! J] . 现代食品科技 ,
2X() 5
.
2 1: 184
~
1 86
.
栗金水 . 乳酸菌的研究应用进展【月. 江苏调味副食品 , 2朋叫 :1) 8一 10 .
M叭lJ 邓 tF 洲 I M , M A R] N[ O M , C O N TE L . lac it e ac id 犯rme
n ta it o n o f
B月“ s应c口 护. p 口 : e he 面 cal an d而 e ro bi al e v al u a ito n o f a t yP i阔 I囚 lan
沐目 u c必m v “ 加)【刀. E u r F以川 R es T eC hn of . 2X( 抖 . 21 :8 46 9礴 73 .
陈仲翔 . 重英. 泡菜丁业化生产的研究进展 IJ] . 食品科技 . 2 1洲〕4 . 3
(4 ) : 3 3
一
3 5
.
赵斌 . 何绍江 . 徽生物学实验 [M ] . 北京 : 科学出版社 , 2以抖 .
赵玲艳 . 邓放明 , 杨抚林 . 等 . 自然发醉辣椒中优良乳酸菌的分离与
鉴定 IJ ] . 食品研究与开发 . 2侧” . 乃 ( 3) : 10 5一 1的 .
杨洁彬 , 郭兴华 . 乳酸菌一生物学基础及应用【M】. 北京: 中国轻工
业出版社 , 19 9 9 .
周德庆 . 徽生物学教程 [M ] . 北京: 高等教育出版社 , 20 0 2 .
凌代文 , 东秀珠 . 乳酸菌分类鉴定及试验方法「M I . 北京: 中国轻工
业出版社 . 1 9 9 .
l3l2][
l4]阎l6阴
8I]91[
2 02卯7 , 论 L Z民川 d . 04 . 吕皿李 城生物工程
如 d M B c( 而 in m uj m lb` 让 ir c i d目 co enC n加山 o n )~ 山胆。团 明曲城山
v . 允团卿 U呼 劝 . 加 5 . 1扯 璐川肠公幻 w记 出以 28 .5%
e dn o Pb yt se s切曲朋 加 v 。 姐山川 C拍 b过 ` d vi yt w h a咭 .15 2% e硒神外。 恤 v e场沙眨幼山川切比 i目` 石访钾 . . 叨 9 w ih c h J 18
吻曲阴 恤代加侧目口 日州戈加 m an ilt 川叨由因留 d访 yt ot 加口幼 . 氏 y. 以 . 日 m yeC ial fo gn 朋 . W知】. J 31 4 asb st双泊 9 . 山拍。心肠川
留石vi yt ot 肠` 忱幻 lun an d yase t
.八刀山川以创肠目 ` d ve e回叩 h yt se s加曲朋角扣 1只肥脚勿如心 灿娜示对 C侧 dr 月 aer xl 力 , hal n , 幻 u n洲留
ofr of 团习助 d鸽 p石c . 涌。 , 山l u d o n me ht do is “ ” 以创 e 越日比山阎 . .
K ey . On如 : sP e l`面 al 心 如 e ”砚 f七材 G o川 . ; e n d o Ph y协 fu gn u s ; an it而 e or b iia ac t iv i ty
中图分类号 9Q 39 .卯 文献标识码 : A 文章编号 : 10 2肠狱 Zo 7X阵刁 l卯扔
金钱松 ( p s o u ` o la r ix ak e州只 fe r i G o川 . )是我国特有的
单属种植物 , 是著名的孑遗植物 , 目前 , 处于濒危状
态 , 被列为国家二级保护植物 。 土懂皮是金钱松的干
澡根皮或近根树皮 , 是我国传统中药 , 有止痒杀虫的
功能 , 用于治疗癣症 。 现代研究表明土懂皮含有二菇
类 、 三菇类 、 三菇内酩及幽醇类等成分 , 具有抗菌 、
抗生育 、 抗癌等重要生理活性作用 l ’ 一 , l , 应用前景广阔 ,
但有限的植物资源是开发其活性产物的巨大障碍 。
植物内生真菌是指那些寄生在植物体中 , 度过全部
或部分生活史而对植物组织没有引起明显病害症状的真
菌 。 由于内生菌长期生活在植物体内微环境中 , 与之
协同进化 , 在演化过程中二 者形成了互惠关系 , 内生
真菌不仅能够参与植物次生成分的合成 , 或对植物次生
代谢产物进行转化 , 而且还能够独立产生丰富的次生代
谢产物 , 是天然产物新的重要来源 , 最新研究表明 :
某些植物内生真菌能产生与宿主植物相同或相近的代谢
产物和其它新的天然产物 , 近来发现的天然产物 1 1% 来
自植物和动物 , 3 8 % 来自土坡微生物 , 而来自植物内
生真菌的则占 5 1% 之多 “` 1. 我国的植物多样性居亚洲第
一 、 世界第三 , 拥有的 1 1 0 0 0 种传统药用植物 , 其中
许多具有抗菌功能 , 是研究抗菌成分的巨大宝库 。
本研究根据金钱松及内生真菌的特点 , 采用改良
T T C 徽量稀释法 , 对金钱松内生真菌进行抗菌活性筛
选 , 对抗菌能力及抗菌谱进行研究 , 旨在为开发新的
天然食品防腐剂莫定基础 , 目前 , 有关金钱松内生真
菌的研究尚未见文献报道 .
1 材料与方法
1
.
1 材料
1
.
1
.
1 金钱松 (P se “ do al r众 ak e 用例份ir G o dr . )枝和叶 。
采摘于江苏大学校 内 。
L L Z 指示菌
铜绿假单胞菌尸 . a ( p : 。 u d o m o n a s a e r u g i n o ` )
^ T C C 2 7 8 5 3
、 大肠杆菌云 。 (凡 e h e r i c h i a 。 0 11) 、 金黄色
葡萄球菌 s . a ( s t即人y lo e e u s a u r e u s ) 、 枯草芽抱杆菌丑. 5
(a
a c i zl u : : u b r i l i s )
、 普通变形杆菌 .P v ( P or et u : v u gl a isr ) 、
产气杆菌 B . a ( B a c i l l u s a e r o 窟e n e s ) 、 蜡状芽抱杆菌 B . c
( B a e i l l u s c 。 r e u s )
、 热带假丝醉母 C . t ( C a n d i d a
t r o p i c a l i s )
、 酿酒酵母 s . c ( as c c h a or 哪 e e s e e r e v is ia e ) 、
黑曲霉人 . n ( A s p e r 忍 i l l u s n i g e r ) 、 康宁木霉 T . k
(irT ch
口de ~ ko
n in ig )等 1 种指示菌均由江苏大学生环
学院制药工程系提供 .
L L 3 培养基
马铃薯葡萄糖液体培养基配方为马铃薯 2 0% 、 葡萄
糖 2 % , 其中加入 1 . 5% 琼脂为固体培养基 ( P D A ) , 加入
15 0 o gl ml 青霉素钾和 1 2 0 , 创m l硫酸链霉素为双抗培养
基 ; 水琼脂双抗固体培养基为琼脂 1 . 5% 、 1 5 0 p g /m l青
霉素钾和 120 。岁回硫酸链霉素 : 牛肉膏蛋白膝培养基为
蛋白陈 1% , 氯化钠 0 . 5% , 牛肉膏 .0 4% ; 沙保氏培养
基为市售 。
L I A 试剂与药品
氛化三苯四氮哇 (T C ) 上海试剂三厂 : 次氛酸钠
(活性氛含量 .5 2% ) ; 吐温 8 0 国药集团化学试剂有限公
司 ; 青霉素钾 、 硫酸链霉素 、 硫酸阿米卡星 ( A k) 华
北制药有限公司 ; 两性霉素 B ( A m B ) S u n s h i n e 。
1
.
1
.
5 仪器
T S IX() 倒置显微镜 N i k o n 公司 ; S P X 一2 5 0B 生化培
养箱 上海跃进集团 : QY C一 2 1 摇床 上海福玛试验设
备有限公司 : SW一CJ 一 ZFD 超净工作台 苏净集团 ; Com -
i n g 9 6 孔微 t 板 。
12 方法
1.2 1 内生真菌的分离纯化
用自来水将无病害金钱松的茎 、 叶冲洗干净 , 将
茎剪成 sc m 长小段 , 再用 7 5% 乙醉浸泡 Zm iu , 次氛酸
钠溶液浸泡 2 ~ 2 0 m in , 无菌水冲洗 4 次 , 无菌纱布蔽
干 。 按无菌操作方法将茎剪成 0 . s c m 小段 , 去除木质
部 , 保留韧皮部 ; 将叶剪成 0 . s c m 小片 。 把处理过的
韧皮部和叶片种植于马铃 , 蔗糖双抗固体培养基 、 水琼
脂双抗固体培养基平板中 。 2 8℃培养 , 待茎 、 叶切面
处长出菌丝后 , 挑取其尖端部分移至新的 P D A 培养基
上 , 经几次纯化后 , 即得到金钱松的内生真菌 , 编号 ,
备用 。 为检验表面灭菌的效果 , 将 P O A 平板与上述表
面灭菌的完整茎段和叶片接触 s m in , 2 8 ℃培养 s d , 若
嵌生物工程 目品科字 2 07 , Vo L 28, 川 d . 04 2 0 1
平板上无菌落出现 , 证明材料表面灭菌彻底 , 否则 ,
分离结果不能使用 。
L .2 2 内生真菌代谢产物粗提物制备
于 25 0耐 的三角瓶中加入 5 0m】马铃薯葡萄糖培养液 ,
分别将内生真菌接种在培养液中 , 28 ℃摇床 ( 12 0 lr m in) 振
荡培养 6 ~ 7 d 。 将内生真菌发酵液在一 7 0 ~ 20℃条件下冻
融 3 次 19 , 以释放胞 内产物 , 过滤去菌丝体 , 滤液冻
干 , 甲醇浸提 。 挥干提取液中的甲醇 , 衡重 , 称重 ,
将提取物溶于 3 m l 甲醉 , 即为甲醇粗提液供试样品 。
1.2 3 菌悬液制备
各种细菌在牛肉膏蛋白陈培养基中增菌至 10S C IF田lnI
( C F U
, 菌落形成单位 ) , 然后用牛肉膏蛋白陈培养基稀
释至含菌量 10 5C F U lm l .
用沙保氏斜面活化酵母菌菌株 , 以液体培养基稀释
至菌含量为 (0 . 2 ~ l ) X 10刁C F U lm l O
丝状真菌在 P D A 斜面上培养 7 ~ 1 0 d , 产生抱子 ,
加入含有 0 . 1% 吐温 so 的沙保氏液体培养基制备悬液 , 悬
液静置 3 ~ s m in 后 , 大颗粒沉于底部 , 取上层均质液体
(含抱子以及菌丝片段 )至无菌试管 , 振荡 s5 , 镜检 , 用
沙保氏液体培养基调整菌悬液浓度至 10’ C FU /m l 。
1
.
2 .4 抗菌活性菌株初筛
以金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌筛选菌株 、 大肠
杆菌为革兰氏阴性菌筛选菌株 , 对内生真菌进行初筛 。
将 10 时 各甲醇粗提液样品分别加入 9 6 孔微量板中 , 挥
干甲醇后 , 每孔加无菌水 10 时 : 以甲醇为阴性对照 , 阴
性对照孔每孔加甲醉 1 0 p l , 挥干后 , 加无菌水 1 0 “ l ;
以 10 4 。 以iln 硫酸阿米卡星 (kA )为阳性对照 , 阳性对照孔
每孔加药液 1 0 p l : 空白对照孔每孔加 10 p l 无菌水 。 所
有孔加大肠杆菌或金黄色葡萄球菌菌悬液 4 0时 , 每孔总
体积 5 0 “ l 。 4 ℃低温放置 Z h , 3 6 ℃培养 2 0 h , 每孔加
入 0 . 2 5% T T C 5 p l , 继续培养 Z h 。 重复 5 次 。 用肉眼
和倒置显微镜观察培养孔 , 呈现红色为有细菌生长 , 在
阴性对照和空白对照呈现红色的前提下 , 判断样品是否
具抗菌活性 。
1.2 5 抗菌实验
根据初筛结果 , 采用改良微量稀释法进行抗细菌 、
抗真菌实验 。
9 6 孔微量板每列 l一 7 孔分别加入 2 0 、 1 5 、 1 0 、 8 、
6
、
4
、
2 林 l 各 甲醇粗提物样品 , 挥干甲醇后 , 每孔加
无菌水 I O p l ; 以二倍系列稀释的 A K 为抗细菌阳性对照
药品 , 每孔 10 时 , 使阳性对照 1一 8孔终浓度范围为 104 一
0
.
8 ,岁而 ; 以二倍系列稀释的两性霉素 (B A m丑 )为抗真菌
阳性对照药品 , 每孔 10 时 , 使阳性对照 l ~ 8 孔终浓度
范围为 2 0 ~ 0 . 1 5 , gl m l 。 阴性对照 、 空白对照处理同前 。
每孔分别加菌悬液 4 0时 , 总体积 5 0 时 。 4 ℃低温放置
Z h
。 细菌培养显色方法同前 。 醉母 2 8 ℃培养 3 6 h , 耸
状真菌 2 8℃培养 7 2 h , 酵母菌显色方法同细菌 。 观察结
果 。 以培养孔不呈现红色的最低样品浓度为细菌和酵母
的最小抑菌浓度 (M I C ) 。 取未见细菌生长孔的培养液划
线于肉汤平板上 , 3 6 ℃培养 2 0 h , 仍无菌生长的最低样
品浓度为最小杀菌浓度 (M B C ) 。 以未见生长的最低样品
浓度为丝状真菌 M I C . 重复 3 次 。
2 结果与分析
.2 1 内生真菌分离结果
金钱松属落叶松 , 5 月发芽 , 1 月落叶 . 根据菌
落培养特征 , 先后 4 次共从金钱松茎和叶中分离出内生
真菌 10 5 株 , 分离结果见表 1 。 结果表明金钱松体内存
在 内生真菌且种类繁多 、 十分丰富 , 菌株数量随气温
的升高而增加 , 茎 、 叶中均有分布 , 叶中的内生真菌
数量明显少于茎中 。
飞 b !8 1
衰 1 金钱松内生真. 的分离结 .
150 刚训 er s u肋 of e fl dOP h yt eS fo n g四 at ar .n f ra m
尸勺. O d匕18血 加 . 栩p 抽汀 G o ld
分离时间 (月份 ) 来派于苹 (株) 来源于叶(株) 合计
5 7 1 8
50426304176810
注 : 一 未分离出 。
.2 2 抗菌活性菌株初筛选
经反复筛选 , 从 10 5株内生真菌中筛选出了 3 0株对
大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都具抗菌活性的菌株 , 占总
分离菌株的 2 8 . 5% , 结果见表 2 , 其中 16 株具强抗菌能
衰 2 30 株内生真. 的杭 . 活性
sT b l
e 2 A n t im ic ro b ia l ac t份云yt o f 30 a ot 份e e n d o Ph yt e s fU n g u s
的咧朋
菌株号 抗菌活性 曲株号 抗菌活性
J 18 + + + r丫4 7 + + +
J 2 8 + + + J J 17 + +
J J2 9 + + + IJ 3 16 + +
J 2 10 十+ + J 3 25 十 +
J J2 2 2 + + + J l l + +
J 24 2
+ + + J 2 7 + +
” 24 3 + + + J 2 6 + +
J J3 14 + + + J 3 19 + +
” 3 18 + + + J J 14 +
J 3 2 3 + + + 刀沙沁 +
J 3 2 4 十+ + J 3 2 +
” 3 26 + + + J J 3 3 +
】J4 + + + J4J 5 +
】J肠 + + + J J 4 16 +
J 4 10 + + + IY
+
注 : + 十+ 表示强抗苗活性 , 培养孔无细菌生长 : + + 表示较强抗菌活性 :
+ 表示弱抗菌活性 。
2 02 2 07, Vo L 28, 八or
. 例 目目成李 嵌生物工程
1抽b l8 3
衰 3 内生真蔺甲醉粗握物产 t
价 e ld s o f m e t h an o ! c nj d e eXt ar ot jo n for m e nd o Ph yt e s fu n g u s
内生真菌
粗提物干重 (叱 )
粗提物浓度 (口创园 )
23 8
.
14
79
.
3 8
】J28
19 8
.
6
肠 .2 2
” 24 3
17 9
.
5 5
5 9
.
8 5
J 3 14
120
.
7 5
40
.
25
” 3 23
5 80
.
4
19 3
.
48
J 3 24
194
.
6 7
64
.
8 9
” 3 26
1肠 . 26
35 4 2
1抽 b I8 4
衰 4 活性 , 株对指示 , 的 MI C
M IC s o f a d Vl e e n d o Ph yt e s a g a in s t d晚 ot r
指示菌
.08犯26以5
J 18
3
.
17
6
.
3 5
3
.
17
6
.
35
6
.
35
6
.
35
6
.
3 5
” 2 8
.2 64
7
.
%
.2 64
10
.
5 9
10
.
5 9
10
.
5 9
10
.
5 9
J Z10
.4 08
8
.
17
4
.
0 8
15
.
33
15
.
33
15
.
33
10
.
22
J 24 3
4
.
7 8
1 1
.
9 7
9
.
5 7
X
X
17
.
9 5
17
.
9 5
J 3 14
1
.
6 1
.6 4
3
.
2 2
4
.
8 3
3
.
2 2
4
.
8 3
4
.
8 3
J 3 18
1
.
8 8
4
.
7 1
2
.
8 2
4
.
7
3
.
7 6
7
.
0 5
4
.
7
J 3 23
7
.
7 4
30
.
9 5
15
.
4 7
2 3
.
2 1
2 3
.
2 1
3 8
.
6 9
3 0
.
9 5
J J3 24
5
.
19
7
.
7 8
5
.
19
12
.
9 7
10
.
3 8
10
.
3 8
10
.
3 8
J J3 26
1
.
4 1
5
.
6
2
.
8 3
14
.
16
10
.
6 2
.7 08
5
.肠
I Y 47
0
.
7 9
3
.
9 7
1
.
1 3
X
5
.
%
3
.
9 7
X
人 K
呱 C〕 创回 )
.oP.cBsaEv
注 : x 表示未测出 .
飞 b I6 5
衰 5 活性 , 株对指示蔺的 M B C
M BC s ot a tC卜 e e n dO Ph yt e s a ga in s t d lc a to r
指示菌 各菌株 M B c( 叭
O口
X.1
门j
J 18
1 2
.
7 0
1 5 8 7
1 2
.
7 0
1 2
.
7 0
2 3
.
8 1
” 28
.7%
! .9 86
10
.
5 9
19 8 6
】】2 10
6
.
13
20
.
4
10
.
2 2
20
.
4
” 24 3
9
.
5 7
X
! 1
.
9 7
X
X
J J 3 14
4
.
8 3
12
.
07
.8 05
8
.
0 5
16
.
10
” 3 1 8
2
.
8 2
X
4
.
70
9
.
40
9
.
40
1 3 23
2 3
.
2 1
5.8以
30
.
9 5
3 8
.
6 9
7 7
.
39
J 324
7 7 8
1.9 46
1.9 46
25 .9 5
25 .9 5
” 3 2 6
.4乃
10
.
6 2
10 6 2
X
14
.
16
型 2
2
.
3 8aC5.PaB三
注 : x 表示未测出 。
力 , 培养孔无细菌生长 , 占 1 5 . 2% : 7 株抗菌活性较强 ,
占 6 . 6% : 7 株抗菌活性较弱 , 占 6 . 6% , 结果见表 2 。
这表明金钱松内生真菌中存在广泛的抗菌资源 。 结合各
菌株的生长特点和抗菌稳定性 , 从具强抗菌能力的 16 株
菌株中选出 J J 1 8 、 J J 2 8 、 J J 2 10 、 J J 2 4 3 、 J J 3 14 、 J J 3 1 8 、
J J 3 2 3
、
J J 3 2 4
、
J J 3 2 6
、
JY 4 7等 10 株内生真菌进行进一
步研 究 。
内生真菌发酵培养后 , 发酵液反复冻融 , 以释放
胞 内产物 , 所得甲醉粗提物包括 了胞内 、 胞外代谢产
物 , 避免了对胞内产物的漏筛 。 从表 3 可以看出 , 经
SOm l 培养液发酵 , 各菌株的甲醉粗提物产量差距较大 ,
最大差距达 10 倍左右 , 所以 , 在筛选抗菌活性过程中 ,
不仅要考虑 M I C , 也应适当考虑活性成分产量 , 尽量
使单位体积发酵液总抗菌能力最大 。
.2 3 活性菌株的抗菌能力
结果不易准确判断是抑菌试验经常出现的问题 ,
T T C 能被活菌还原为红色物质 , 使菌落呈现红色 l ’ 01 , 结
果容易判 断 ; 在抗细菌 、 抗酵母菌的预研中 , 发现
加样完毕后立即培养 , 会产生阳性对照孔和一些处理
孔虽然产生大量菌体 , 但菌体不能被 T T C 染成红色现
象 , 研究表明 : 这是由于样品中含大量的脂溶性抗菌
成分 , 扩散较慢 , 而指示菌在样品完全扩散之前己开
始生长 , 样品完成扩散后 , 将菌体杀死 , 造成假阴
性现象 。 天然产物脂溶性成分较多 , 无论采用微量稀
释法还是纸片琼脂扩散法进行抗菌活性实验 , 现行加
样完毕后立即培养的做法 , 都易产生这类问题 , 造成
抑菌效果低于真实值或假阴性结果 。 采用 9 6 孔微量板
培养前低温扩散的措施 , 确保样品扩散完全 , 从而解
决了天然产物抗菌实验中 , 尤其是脂溶性抗菌成分较
多的样品 , 出现假阴性率高的问题 : 参考 N C C L S 方
案 l川 , 以铜绿假单胞菌 A T C C 2 7 8 5 3 为质控菌 , 结果
显示阳性药物 ^ K ( a m i k a e i n s u l at t e )对其 M l e 在 N e e L S
(N a t i o n a l C o m m i t t e r fo r C l i n i e a l L a b o r a t o r y S at n d a r d s )
方案规定范围之内 , 表明抗细菌实验结果可靠 。 本研
究从以上三方面在方法学上完善了天然产物抗菌实验的
准确性和可靠性 。
1 .3 1 抗细菌活性
10 株内生真菌对 7 株指示细菌的卜n C 见表 4 , 在设定
浓度条件下 , 除 J J 2 34 对 B . a 、 .E c , J Y 4 7对 B . a 、 P . v 没
有测出 M I C 以外 , 各样品对指示菌株均具有不同程度的
抑菌活性 。 各菌株对 尸. a 、 B . : M I C 较小 , 而对 B . : 、
B
·
a 、 E
·
c 、 s
.
a 、 P
.
v
M I C 较大 , 且与阳性对照 A K 的
M CI 呈正相关 , 表明结果准确 。 抗菌活性强弱顺序为 :
J J 3 1 4
、
J J 3 1 8
、
J J 1 8 > J J 2 8
、
J J Z 1 0
、
J J 3 2 6
、
J Y 4 7
、
嫩生物工程 砚品科学20 2V oL 28 , N d . 04 2 0了
几 b 16 6
衰 6 活性菌株对指示蔺的 MI C
M IC s o f a tC iv e e n d o Ph yt e s a g a ln s t d ie at o r
指示 各菌株 人 m B
.2501
J J 18
12 7 0
12
.
7 0
3 1 7 5
15
.
8 7
J J2 8
X
19
.
8 6
X
X
J Z10
X
15 3 3
X
X
J 3 14
16
.
10
8
.
0 5
塑J 3 18 ” 3 24
X
19
.
46
X
X
J J3 2 6
X
14
`
1 6
X
X
XXX X
.cstnAkT
汁 : x 表示未测出 。
J J 3 2 4
、
J J2 4 3 > J J 3 2 3
。
10 株内生真菌对 5株指示菌的 M B C见表 5 , 在设
定浓度条件下 , 除 J J 2 8 、 J J Z 10 、 J J 2 4 3 、 J Y 4 7 对 E . c ,
J J 2 4 3
、
J J 3 2 6
、
J Y 4 7 对 B . a , J J 2 4 3 、 J Y 4 7 J J 对 B . c 没
有测出 M B C 以外 , 各样品对各受试菌株均具不同的杀
菌活性 , 其中 J J 1 8 、 J J 3 1 4 、 J J 3 1 8 、 J J 2 3 4 、 J J 2 1 0 、
J 32 4
、 ” 32 6 杀菌能力较强 , J J 3 2 3 虽然杀菌能力较弱 ,
但杀菌谱较 J` 一 。 综合各样品对受试菌的 M I C 、 M B C 及
粗提物产率 , J J 1 8 、 J3J 1 4 两菌株表现出良好的抗细菌
性 状 。
.2 .3 2 抗真菌活性
10 株内生真菌对 4株真菌指示菌的加n C 见表 6 , J1J 8
对酵母菌和丝状真菌都有较好的抗性 , J3J 14 仅对两种酵
母菌有抗性 , J J 2 8 、 J J Z 10 、 J J 3 2 4 、 J J 3 2 6仅对酿酒酵
母菌有抗性 , 没有测出 J J 2 3 4 、 J J 3 18 、 J J 3 2 3 、 JY 4 7 对
指示菌的 M I C 。 J J 3 2 3 具有使黑曲霉 、 木霉不产抱子的
抗性 , 所有菌株均具有使黑 曲霉抱子明显减少的抗性 。
研究表明 : 各活性菌株代谢产物抗菌活性随浓度的
提高 , 抗菌活性明显加强 , 活性产物具量效关系 , 且
与阳性对照的抗菌活性呈正相关 。 5 0m l J J 18 发酵液抗质
控菌 p . a 的能力相当于 6 0 . 0 8 p g A K , 抗 c . t 、 s . c 、 A . n 、
.T k 的能力分别相当于 1 1 . 6 2 、 4 6 . 8 7 、 15 0 . 0 0 、 15 0 . 0 5 , g
A m丑 。 经鉴定 J J一8 为曲霉属 (A甲 e啥 i l l u s s P)真菌 , J J 3 2 4
为小菌核属 ( S c l e r o r i u m s p )真菌 。
菌 、 酵母菌活性强 。 关于活性菌株产生的抗菌物质基
础有待进一 步研究 。
.3 2 改进了天然产物抗菌实验的方法 , 结果表明 : 本
文方法可靠 、 准确率高 , 不易造成漏筛 、 高通量 , 与
阳性对照相关性好 , 用样量少 。
参考文献 :
3 结 论
.3 1 本文系统研究了金钱松内生真菌抗菌活性 , 分离
出内生真菌 1 0 5 株 , 其中高活性菌株 1 6 株 , 它们的抗
菌谱和抗菌能力各不相同 , 其中 ” 18 菌株具有强的抗细
菌 、 酵母菌和丝状真菌的广谱抗菌能力 , J 3 1 4 抗细
110 ]
11 1]
C HE N K, Z HA N G Y L
,
LI Z L
. e t al 名tru e tu 花 an d s te ~
h e而 s try o f
脚山面纽m五山 J 月阳v e l以知时傲讲址 】侧为叱记加m凡 `生白如心 么犯叫垂对
l刀. J N at P rod , 19 96 , 5 9 ( 12 ): 1 2X() 一 12 02 .
U X C
,
EL S O HL Y H N
.
T w o . 山闻n o肠加m sP e 的由如月认口御七“幼闭 . J
N at 竹od , 1 9 9 , 6 2 (5 ): 76 7一7 69 .
王伟成 , 陆蓉发 , 赵世权 , 等 . 土荆皮甲酸和乙酸抗早孕作用和毒性
的比较J[] . 中国药理学报 , 19 9 , 9( 5) : 4 5书民
G O N G X F, W AN G M W
.
TA S】刀 R O , et 目 . 只姆 u do l颐 c ac id B in du a ,
.训 P t o s is d廿 o u g h P 5 3 an d B a幻旧 e l一 2外 ht w a y s in h u m an m e lan o am
3A 7 5
一
5 2 ce Us【刀 . 冉代坛 v es o f 几. m山` 目 R , 翻” ℃ h, 双幻5 , 2 8 ( l ): 6 8一 7 2 .
】A R D A T M S , N 0 0 N AN D J 叭几1 B . et al . P托u do lacn ` id an al o g s as
a n e w e las s o f 件 or x i s o me Pr o l i fe ar l o r 一鱿 it v a往泪艘e p l o r ag o in s ts lJ】·
lP an at m目 i饿 2加2 . 6 8 (8 ): 6 7石7 1 .
S T IE R L E A
.
S T R O B EL G
,
A T IE K L E D
, e t ia
.
T ax o l an d axt an
e Po-r
du 比加 b y axt o m ya , 助 d 比 an a 】. an e n d叩 h iyt c fu n gU s of PaC i icf ye w
e o n” 刀 e n st lj l
.
S e ie n c e
,
19 3
,
26 0 : 2 14
一
2 16
.
S T R O BEL G
,
D IA S Y B
,
C A S T IL L O U
.
e t 目 . N a t u ar 】r od u e ts ofr m
即 d叩h iyt c 而即叩r g画 s luB IJ ] , J N at P r曰 , 2X( H . 6:7 25 7一 2 6民
邹文欣 , 谭仁祥 . 植物内生菌研究新近展闭 . 植物学报 , 2印 l , 4 :3 881 -
8 9 2
.
M人NI t JL H , P托 L[ IP P E J B , L O UI S M G , e t al . 1”力u e n c . o f in tro g e n
an d如 n il 而. d on o n il Pid Pr冈 u e it o n by e ry “ 犯oc u s c u r v a tu s g ro wn
in b a匕 h an d fe d一b atc h e u l t u r e IJ ]
.
P roc e s s B ioc he 而s tI’y . 1996 . 3 1(4 ) :
3 55
一
36 1
.
魏景超 . 真菌鉴定手册 IM ] . 上海 : L海科学技术出版社 . 19 79 .
郝士海 . 现代细菌学培养基和生化试验手册 IM ] . 北京 : 中国科学技
术出版社 , 19 :2 18 9一 190 ,
N a t io n a l C o m m i t t e e f o r C l i n i e a l L a b o r a t o r y S t a n d a r d s
O S BN 125 6 2 3 82 3 7 72 9 ) [S ]
.
U S A w a y n e : 199 9
,
瓜 题 何 阅 姚 食 晶 视 拿 黝 岛 容