全 文 ：植物资源与环境　1999 , 8(4):59 ～ 60　　　　　　
Journal of Plant Resources and Env ironment　
　　　
白豆杉细胞培养
康强胜　卢大炎　李　俊　李洪林　吴玉兰
(中国科学院武汉植物研究所 ,武汉 430074)
Cell culture of Pseudotaxus chinenii (Cheng)Cheng 　Kang Qiangsheng , Lu Dayan , Li Jun , Li
Honglin , Wu Yulan(Wuhan Institute of Botany , Chinese Academy o f Sciences , Wuhan 430074), J.
Plant Resour.& Environ .1999 , 8(4):59 ～ 60
Callus cultures of Pseudotaxus chienii (Cheng)Cheng were induced using different tissue explants
including young stems and needles.The effecs of different concentrations and ratios of auxin and
cy tokinin on callus grow th were analyzed.Cell suspensions of stem callus were g rown for 30 day s in
shake flasks containing MS medium supplemented with 5 mg/ L NAA , 1 mg/L BA and 3% sucrose.
Through the grow th cycle , fresh and dry w eight accumulation , pH variation in the medium , and the
uptake of sucrose w as examined.The dry weight of the cell cultures approached its maximum value on
the 25th day or so.A biomass y ield of 16.67 g/ L was obtained.Total carbohydrate uptake w as closely
associa ted with the increase in dry biomass.The average sucrose consumption rate was 0.83 g/ L·d.The
amounts of taxol in the cell were determined by reversephase high perfo rmance liquid chromatography.
The average amount of taxol in the dry biomass w as 9×10-8 g/ g.
关键词　白豆杉;细胞培养;紫杉醇
Key words　Pseudotaxus chienii(Cheng)Cheng;cell culture;tax ol
紫杉醇是从短叶红豆杉〔Taxus brevifolia (Cheng)Cheng〕树皮中分离出来的二萜类生物碱[ 1] , 现已成为
知名抗癌药物。紫杉醇主要来源于红豆杉属植物。白豆杉〔Pseudotaxus chienii (Cheng)Cheng〕属红豆杉科
白豆杉属 ,为我国特有植物[ 2] 。白豆杉中是否含有紫杉醇 ,目前结论不一[ 3 , 4] 。开展白豆杉细胞培养研究 , 可
证明白豆杉细胞是否具有合成紫杉醇的能力 , 进而有可能扩大紫杉醇的来源并为白豆杉分类地位的确定提
供依据。有关白豆杉细胞培养还未见报道。
1　材 料 与 方 法
1.1　愈伤组织诱导及培养　白豆杉幼苗采自庐山植物园。用嫩茎及幼叶作外植体 , 常规方法消毒后接于不
同培养基上 ,于 22～ 25℃黑暗培养 , 每 4 周转代 1 次。
1.2　悬浮培养　选择生长旺盛 , 白色透明的茎来源愈伤组织接种到含有 90 mL 培养基的 250 m L锥瓶中。
接种量(鲜重)5 g/瓶。培养基 MS+1 mg/ L BA+5 mg/ L NAA+3%蔗糖 , pH 5.8。摇床转速 120 r/min , 温度
22 ～ 25℃, 黑暗培养 , 每 3周转代 1次。
1.3　培养物的产量 、可溶性糖及 pH的测量　愈伤组织直接测鲜质量。悬浮培养每 3 d 左右取样 1 次 , 用滤
纸滤去培养基后立即测鲜质量 ,然后于 60℃烘 24 h , 称干质量。用数显酸度计测滤液中 pH 值。滤液中可溶
性总糖用蒽酮法测定 ,设培养基中可溶性总糖初始浓度为 100%。
1.4　紫杉醇的检测　悬浮培养物于 60℃烘干至恒重 ,粉碎后过 60目筛。用 95%乙醇热回流提取 ,回收乙醇
本文曾在第二届亚太植物组织与细胞培养会议上宣读。
　　　本研究得到杨仁洲先生的指导与帮助 ,特此致谢!
　　　康强胜:男 , 1965年 1月生 ,大学 ,助研 ,主要研究植物细胞大量培养与次生代谢。
　　　收稿日期:1999-07-18
后脱脂 ,再用 CHCl3萃取。参照文献[ 5] 进行 HPLC 检测 ,检测前用普通柱层析进行初步分离。
2　结 果 与 讨 论
2.1　愈伤组织诱导　应用不同培养基及不同激素配比 ,发现 MS 培养基并单独添加 NAA诱导效果较好 , 且
在一定的范围内(0.1 ～ 10 mg/ L), 高浓度的 NAA 有利于愈伤组织的形成。用嫩茎及幼叶作外植体均诱导出
愈伤组织 ,诱导率较低(低于 10%), 时间约需 40 d 左右。
2.2　愈伤组织培养　使用 MS 及减半的 MS 培养
基 ,添加不同激素及其组合 , 结果见表 1。可以看出 ,
较高浓度的生长素对愈伤组织生长有利 , 但高浓度
的 2 , 4-D易引起愈伤组织褐化并促进棕红色物质分
泌 ,不利于继代培养。 添加水解酪蛋白对白豆杉愈
伤组织有较小幅度的促进作用。
2.3　悬浮培养　白豆杉细胞悬浮培养过程中 , 培养
物大多为颗粒状聚合物。随着培养时间的延长 , 这
些颗粒状聚合物逐步褐化 , 且不断向培养基中分泌
棕红色物质。在接种前用消毒过的蒸馏水或培养基
反复冲洗以去除大部分颜色变深的细胞及聚合体 ,
同时缩短培养时间 ,可在很大程度上减缓褐化现象。
细胞悬浮培养表明培养物的生物量在 25 d 左右达到
最大值 , 最大生物产量(以干质量计)为 16.67 g/ L 。
可溶性总糖浓度随生物量的增加而下降 , pH 则在不
同生长阶段有小幅变化。整个培养过程中 , 平均生
物产率(以干质量计)为 0.47 g/ g , 平均蔗糖消耗速
率为 0.83 g/ L·d。
表 1　不同培养基中白豆杉愈伤组织的增长倍数
Tab 1　Callus increased-times in di fferent medium
培养条件1)
Culture condtion
增长倍数2)
Increased
times
A MS+2 mg/ L BA+10 mg/ L 2 , 4-D 3.82
B MS+1 mg/ L BA+5 mg/ L NAA 4.72
C MS+2 mg/ L KT +1 mg/ L 2 , 4-D 2.57
D MS+2 mg/ L BA+1 mg/ L 2 , 4-D 2.47
E MS+2 mg/ L BA+1 mg/ L 2 , 4-D+
1 g/ L CH
2.74
F 1/ 2 MS+2 mg/ L BA+1 mg/ L 2 , 4-D+
1 g/ L CH
3.35
G 1/ 2 MS+0.05 m g/ L KT+0.5 mg/ L 2 , 4-D 3.65
H MS+5 mg/ L NAA 1.55
I MS+10 mg/ L NAA 1.95
　1)H 和 I 为诱导培养基。 CH 为水解酪蛋白。培养时间
28 d。 　 H , I:media for callus induction;　 CH:
caseinhydrolysat;cultured 28 days.　2)4次实验的平均
值。Average value of 4 experiments
2.4　培养物中紫杉醇的检测　HPLC 分析结果表明 , 在白豆杉培养物中可检测到紫杉醇 ,含量为 0.09μg/ g。
由于含量极微 ,检测样品又少 , 未对培养物中紫杉醇作进一步鉴定。白豆杉是否具有合成紫杉醇的能力 , 尚不
能下结论 , 有待继续探讨。
参　考　文　献
1　Wani M C , Taylor H L , Wall M E , et al.Plan t ant itumor agents , Ⅵ .T he isolation and structure of taxol , a novel
antileukemic and antitumor agents f rom Taxus brevi fol ia.J Am Soc.1971 , 93(9):2325～ 2327.
2　中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志　第七卷.北京:科学出版社 , 1987.448～ 450.
3　周荣汉 ,朱丹妮 ,高山林.紫杉醇及短叶醇在白豆杉中的存在.中国药科大学学报 , 1994 , 25(5):259～ 261.
4　张君增 ,方起程 ,梁晓天.中国特有植物白豆杉的化学成分研究.植物学报 , 1996 , 38(5):399～ 405.
5　Lu L X , Liu A R.Determination of taxol in Taxus ch inensis by HPLC method.Acta Pharmaceutica Sinica , 1991 , 26(7):537
～ 540.
(责任编辑:许定发)
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