全 文 ：第 9 1卷 第 5期
19 9 1年 9月
东 北 林 业 大 学 学 报
O JU R NA F O LNORTH EAS TS T R R F E O YU N】 VS I T R E Y
VOI
.
19
S e pt
.
N
OS
19 9 1
长白松自然群体同功酶遗传
多样性的研究 ` )
杨一平 尹瑞雪 张军丽
( 中国科学院沈阳应用生态研究所
[摘 要 1
本文以 酶水平 , 研究 了两个 自然群体的遗传 多样性 。 采用聚丙烯酸胺凝
胶电泳技术 , 检测 了长白松雌配子体的谷氛酸草耽 乙酸转氛酶 ( G D )T , 苹果
酸脱 氢酶 ( M D )T , 酸性磷酸酶 ( A C )P , 谷氛酸脱氢酶 ( G D H ) 和葡萄糖
脱氮酶 ( G L U D H ) 的同功酶型 . 根据多态基因位点标准 , 笔者发现检浏基
因位点 的 63 % 是 多 态的 。 8 个基 因位 点 所有样 品 的 杂合性的平 均值是
0
.
3 1 57
。 每个基因位点的平均等位基因数是 2 . 1 9。 两个 自然群体间的 同功酶多
样性分化 , 对 8 个基 因位点的基 因多样性测量表明 , 群体间基因多样性的分
化明显效果是 9% , 总的基因多样性的 91 % 在群体内 。 两个群体间的遗传距
离是 0 . 0 6 19 。
主题词 : 长白松 ; 选传多样性 ; 同功酶
长 白松 (尸 zn u : : y zv e s t r if o rm is T . w a n g 。 x e h e n g ) 为异交 , 行有效繁班 , 并以群
体为基本单位 , 在世代间传递遗传信息 . 群体在长期进化中 , 形成一定遗传结构 . 本研
究以酶水平 , 结合凝胶板式电泳技术 , 分析研究长 白松 自然群体遗传变异及多样性 , 为
合理保存和利用长白松基因资源提供基础资料和科学依据 .
1 材料和方法
L l 材料
长白松自然分布于北纬 4 2 0 0 6 产 , 东经 12 8 0 2 0 ` , 海拨 65 0 m一一 1 6 00 m 的长
白山北坡较狭的范围内 , 其大部分是零星散生在阔叶红松林 、 红松云冷杉林和长白落叶
松林中。 成片集中分布为两处 : ①胡枝子一长白松林 (海拔 690 m ) , 38 年生的幼龄林 ,
1) 国家自然科学基金资助项目 .
收稿 日期 : 19 90 年 9 月 2 7 日 .
本篇责任编辑 : 刘慧荣 .
1 8东 北 林 业 大 学 学 报 第 1 9卷
还有少量母树 ;②越桔一长白松林 (海拔 1 1 0 5m )为成熟异龄林 。 研究材料主要取自
上述两个林型 . 1 9 8 7年从胡枝子一长白松幼林中 , 单株分别采集 10 多株树的球果 .
1 9 8 8 年从越桔一长白松林的成林中 , 单株分别采集 37 株树的球果 , 均按株分别保存种
子 , 并把种子贮藏在冰箱中待用 。
1 .2 样品制备
采用单个雌配子体匀浆的粗蛋白为电泳样品 。 种子在湿润滤纸上 , 在室温条件下培
养 24 一 48 h , 侮个雌配子体用 .0 4 m l rT i s 一甘氨酸电极缓冲液 , p H .8 3 , 匀浆后
+ 0
.
1 m z 5 0% 糖电极缓冲液混匀 . 以 10 0 0 0 r p m 离心 10 m i n , 取上清液为 G O T 和
A C P 的样品液 ; 取 0 . 2 m l 上清液 十 .0 2 m 1 20 % 糖电极缓冲液混匀后为 M D H 样品液 。
L 3 凝胶和电泳
采用聚丙烯酞胺凝胶不连续垂直板式电泳 。 凝胶板为 18 0 m m x 10 m m x 1 m m ,
每个板有 20 个宽 5 m m 的样品槽 。 凝胶系统为 .7 5% , 浓缩胶浓度为 3% . 电极缓冲液
为 T ir s 一甘氨酸 , p H 8 . 3 , 电泳在 4一 8℃冰箱中进行的 , 采用稳流电泳 , 开始每块胶
板用 12 m A , 60 m in 后增至 16 m A , 待浪酚兰前沿指示剂移至起点 70 m m 时停止 .
L 4 染色方法
参照 e h e L i a k a n d P i t e d ( 4 〕并经过修改的具体方法如下 :
o o T ( E
.
e
.
2
.
6一 1 . ) , n L一天冬氨酸 2 0 0 m g , 加蒸馏水至 10 0 m L , 3 7℃染色
2 0 m i n
。
M n H ( E
.
C
.
1
.
1
.
1
.
3 7 )
,
N A D 1 5 m g
,
l m o l / L苹 果 酸 ( pH 7 . 0 ) 10 m l ,
0
.
5 m o 一/ I T r i s 一H e l ( pH 8 . 5 ) 一0 m l , N a T 2 0 m g , p M S 10 m g 加蒸馏水至 1 0 0 m L ,
3 7℃染色 一6 h 。
A e P ( E
.
e
.
3
.
1
.
3
.
2 )
,
o
.
Zm o l / L醋酸钠 ( p H 5 . 0 ) 10 0 m l , : 一茶脂磷酸钠 5 0 m g ,
坚牢紫酱 G B C 盐 5 0 m g , 3 7℃染色 5 h .
G D H ( E
.
e
.
1
.
4
.
1
.
3 )
,
o
.
sm o 一/ L T r i s 一 H e l ( p H 8 . 5 ) 9 4 m l , L一 谷 氨 酸
80 0 m g
,
N A n 2 0 m g
,
N B T 2 0 m g
,
p M S 10 m g
,
3 7℃染色 s h 。
G L U n H ( E
.
C
.
1
.
1
.
1
.
4 7 )
,
0
.
s m o l / L T r i s一 H e l ( p H s . 5 ) 9 0 m l , 葡 萄 糖
1 0 0 0 m g
,
N B T 2 0 m g
,
PM s l o m g
,
37℃染色 5 , h 。
等位基因分离的观察值与理论期望值比例的适合度 , ,用经过矫正的 护 进行检验 。 ` ’ 2 ,
本文采用的多态位点的标准是指大多数等位基因的频率 簇 0 . 9 。
2 试验结果与分析
.2 1 五种酶系统的遗传分析
以单倍体的雌配子体为酶源材料 , 每株检测 6 一 12 个雌配子体 ,
的雌配子体 . 推测长白松的基因型 〔.3 ’ 2, ’ 们 . 从长白松自然群体 5
得知 :
共分析 70 个单株
种酶带型 (见图 l)
第 5期 杨一平等 :长 白松自然群体同功酶遗传多样性的研究
. . . . . . 留旨 . 亩 . ` 刁石刁`刁〕 一 . . . . . . . . . . . .
. . 日 . . 洲 ~. . 岁 , G L U D H G D H
.口 . . . . 豁罢霎. 日 . 曰 . . . B 一 B , B , D I D ,妇 . . . . . . ~ B D- 一一 M D H
人一 B 1 B . B口 C I C ,
A B C
G O T
图 1 . 长白松自然群体与种酶带型
.2 L I 基因型分析
① G O T 酶谱 、 位点和等位基因 无论分析基因型或者检测等位基因频率 , ’ 长白
松的雌配子体 G O T 的酶谱均十分清楚 。 每个雌配子体的酶谱有四条带 , 并由六种醒i普
组成总的酶谱 . 在总酶谱 中共有三个基因位点 : G O T一 A 位点 , 只有一条染色较深 ,
而整齐的带未发现变异 ; G O T一 B 位点 , 有迁移不同位置的三个等位基因 , 每个基因
是一条浅色 的带 ; G O T一 C 位点 , 有迁移不同位置的两个等位基因 , 每个基因由染色
较深的双带组成 。
② M D H 的酶谱 、 位点和等位基因 M D H 的酶谱共有四个基因位点 . 其中重复
性较高 , 能比较清楚识别 , M D H一B 位点 , 有迁移不 同位置的三个等位基因 , 每个基
因由双带组成 ; M D H一D 位点 , 有迁移不同位置的两个等位基因 , 每个基因有一条
引李。
③ A C P 的酶谱 、 位点和等位基因 A C P 的酶谱只有 A C P一 A 位点重复性高 、
清楚易辩别 ` . 有五个等位基因 : A C D一 A : 由上下连接两个宽的带组成 , 下面的带色深
浓而扩散 , 有时似两条带 , 上而的带色浅而 比较整齐 ; A C P一 A : 也是由上下连接两个
宽带组成 , 下面的带宽 、 颜色 、 扩散程度和迁移距离同 A c P一 A ; 下面的带一样 , 有时
也呈现似两条带 , 但上而带的颜色和 A C P一 A I 相同 , 只是比 A c P一 A : . 宽 , 有时似两
条带 ; A C P一A 3是一条宽颜色深而扩散的带 , 它同 A C P一 A ; 和 A C P一 A : 下而的带迁
移距离一样 ; A C P一A ; 同样由上下连接两条带组成 , 其中下而的带宽 、 色深 、 稍有些
扩散 , 有时也似两条带 , 上边 的带浅 , 两带间有清楚间隔 , 迁移距离比前三个基因短 ;
A C P一 A S有一条色较深的带 , 其迁移距离与 A C P一 A ; 下面的带同 。
④ G L U D H 和 G D H 各检测 80 多个雌配子体 , 均只有一条带 , 都未发现变异
从 10 个位点编码的五种酶系统等位基因酶型分析中, 有 8 个位点能清楚识别 . G D T一
A
、
G L U D H 和 G D H 为单态位点 , 其同功酶表型 没有分离 ; G O T一 B 、 G O T一 C 、
M D H一 B 、 M D H一D 和 A C P一 A 位点为多态 , 其同功酶表型分离比例为 1 :l 或接近
1 : l 比例 (见表 1 )
东 北 林 业 大 学 学 报 第 1 9卷
表 1单株树雌配子体各位点不同等位基因分离表型和卡方检验
分离表型 树 号 样 品 数 分离比例
B一 : B z
B一 : B 3
B Z: B,
8 7 一 8 3
8 7 一 3 8
G O T一B 位点
5 : 7
4 : 2
3 : 3
0 0 8
0
.
17
0
一
7 一 0 . 8
0
.
5 一 0 . 7
8 7 一 4 5
C 一 : C Z 8 7 一 2 3
B 一 : B Z
B 一 : B 3
B Z : B 3
8 7 一 8 3
G O T一 C 位点
3 : 3
M D H一B 位点
4 : 2
3 : 3
0
.
5 一 0 7
8 7 一 3 0
8 7 一 48
0
.
17
0
.
0 0
D 一 : D Z 8 7 一 3 0
M D H一D 位点
6 2 : 4 0
.
5 一 0 7
A 一 : A Z
A 一 : A 3
8 8 一 2 1
8 8 一 5 2
! 2
l 0
8 8 一 7 6
8 7 一 8 3
8 7 一 4 1
8 7 一 3 7
8 8 一 7 3
8 8一 80
8 8 一 4 1
A C P一 A 位点
6 : 6
5 : 5
3 : 3
1 : 3
3 : 3
4 : 4
3 : 3
3 : 3
6 : 6
0
.
5 一 0 . 7
0
.
0 0
0 0 0
0
.
0 0 1
.
0
4f J,14心`t曰A
..…O:,12ō`,ùJ,JA
.2 1
.
2 基因频率的分布
基因频率的测定 , 按两种方式进行的 . 越桔一长白松林 , 根据单株基因型分析资
料 , 每株取两个等位基因 , 具有多态位点的取不一样的两个等位基因 , 具有单态位点取
两个相同的基因 ; 胡枝子一长白松林 , 根据检测群体资料直接计数的 。 五种酶系统 8 个
基因位点的 18 个等位基因频率在两个林型的分布 (见表 2) 。
.2 2 群体内的遗传多样性
群体内的遗传多样性 , 它既是长期进化的产物 , 又是反映该种群进化的潜力 。 分析
长白松自然群体内的遗传多样性 , 采用四个通用的遗传变异量 : ( l) 群体多态基因位点
比例 (尸 ) ; ( 2) 每个位点的杂合性 ( h e) ; ( 3) 所有位点的平均杂合性 (eH ) ; ( 4) 每
第 5期 杨一平等 :长白松自然群体同功酶遗传多样性的研究 l 2
个位点发现等位基因的平均数 ( A/L )。 并将分析的资料 , 按上述项目列于表 3 .
表 2 长白松群体不同基因位点等位基因频率
等位基因 胡枝子一长白松林 样品数 越桔 一长白松林 样品数
64752G O T e A
G O T 一 B -
G O T 一 B Z
G O T 一 B ,
G O T e C
-
G O T一 C:
A C P一 A -
A C P一 A Z
A C -P A
3
A C P e A -
A C P一 A ,
G L U D H
G D H
M D H一 B -
M D H一 B Z
M D H一 B 3
M D H e D
-
M D H一 D Z
1
.
0 0
0 0 3 4
0
.
77 3
0
.
1 9 3
0
.
22 7
0
.
77 3
0
.
0 9 4
0
.
29 9
0
.
34 2
0
.
20 0
0
.
14 5
1
.
00 0
1
.
00 0
0
.
30 0
0
.
11 7
0
.
58 3
0
.
84 1
0
.
1 5 9
1
.
0 0 0
0
.
0 94
0
.
5 94
0
.
3 1 2
0
.
34 4
0
.
6 5 6
0
.
1 2 0
0
.
10 6
0
.
4 2 7
0
.
1 4 7
0
.
20 0
1
.
0 0 0
1
.
0 0 0
0
.
22 6
0
.
5 0 0
0
.
2 74
0 6 5 2
0
.
34 8
ǎ石。0n6西.口门矛,.了矛,.ùUn0200几乙O八工R一口-,`Rù00
口..,. .
右,里
表 了 群体遗传变异和基因多样性各度最值
每个位点的杂合性
林 型
G O T es A G O T e B G O T 一 C A C P一 A C L U D H G D H M D H 一 B M D H 一D
所有位 多态位 点的平点平均 点比例 均等位杂合性 尸 括 因数
刀七 诬 / L
胡枝子一
长白松林
越桔一长
白 松 林
平 均
标 准 误
0
.
0 0 0 0 0
.
54 1 1 0
.
3 5 1 0 0 7 2 3 8 0
.
0 0 0 0 0
.
0 0 0 0
.
5 5 6 4 0
.
2 6 7 4 0
.
30 5 0 0
.
6 3 2
.
1 3
0
.
0() 0 0 0
.
3 6 4 1 0
.
4 5 1 4 0
.
7 44 8 0
.
0 0 0 0 0 0() 0 0 0
.
6 2 3 8 0
.
4 2 6 8 0
.
3 2 6 4 0
.
6 3 2
.
2 5
0
.
0() 0 0 0 4 5 2 6 0
.
4 0 1 2 0
.
7 34 3 0
.
0 0 0 0 0
.
X() 0 0 0
.
5 90 1 0
.
34 7 1 0
.
3 1 5 7 0
.
6 3 2
.
1 9
土 0 . 0() 0 0 土 0
.
0 1 1 0 士 0 . 0 0 1 8 士 0 .0 0 1 8 士 0 . 0 0 0 0 土 0 . X() 0 0 土 0
.
0 0 1 6 土 0 0 09 8 士 0 . 0 0 0 1· 土 0 . 0() 土 0 . 0 0
从表 3 看出 ,长 白松 自然群体多态位点比例 ( p ) 为 0 . 63 。 所有位点的平均杂合性
(万七 ) 为 .0 31 5 7 。 每个位点的平均等位基因数 ( 月 / L ) 为 2 . 19 .
2 .3 群体间的遗传多样性分化
东 北 林 业 大 学 学 报 第 、 9 1卷
群体间的遗传多样性分化是研究群体间遗传多样性趋异程度的 。 本文采用遗传距离
和平均基因多样性 , 分析有关多基因位点的平均分化程度 。
.2 .3 1 采用遗传距离 , 对特定群体间分化程度进行分析 。 根据 N ic ( 1 9 72) 计算 x 、 y
两个群体林准化遗传相似性 (刀 , 得出两个群体的遗传距离 ( D ) 。 胡枝子一长白松林
和越桔一长白松林两个 自然群体的遗传距离 ( D ) 为 0 . 06 1 9 。
2
.
1 2 采用平均基因多样性 , 分析有关基因位点的平均分化程度 。
总的基因多样性 (
基因多样性 ( D , , )
H : ) 划分为下列组成部分 , 即群体内基因多样性
根据 N e i ( 1 9 7 3 )把
(凡 ) 和群体间
( G
, ,
) 公式 : G : ` -
位 ( 见表 4 ) .
来研究长白松 自然群休的遗传分化程度 。 群体间遗传分化的相对量
D对。 长白松两个 白然群体的基甲多样性水平及其分化程度的度量
表 4 长白松群体基因多样性参数
位 点
总的基因
多样性
群体内荃因
多样性
群体间基因
多样性
群体间基因
分化比率
价 凡 D, , G, ,
G O T e A 0
.
0 0 0 0 0
.
0 0() 0 0
.
0 0 0 0 0
.
0 0 0 0
G O T es B 0
.
4 6 4 9 0鸿 5 2 6 0 . 0 12 3 0 . 0 2 6 5
G O T 一 C 0 . 4 0 8 0 0 . 4 0 1 2 0 0 0 6 8 0刀 16 7
M D H 一 B 0 6 5 2 0 0 . 5 9 0 1 0
.
0 6 1 9 0
.
0 9 4 9
M D H 一 D 0 . 3 7 8 4 0 3 4 7 1 0 0 3 1 3 0
.
0 8 2 7
A C P一A O沼 5 8 5 0 . 7 3 4 3 0 . 12 4 2 0 . 14 4 7
G L U D H O加 0 0 0 0 0 0 0 . 0 0 0 0 0刀 0 0 0
G D H 0
.
0 0 0 0 0
.
0 0() 0 0 0 0 0 0 0
.
0 0 0 0
未加权平均数 0 . 3 4 5 2 0 3 15 7 0刃2 9 6 0 . 0 8 5 7
标 准 误 士 0 . 0 8 2 0 0 . 0 70 4 0 . 0 14 1 0 . 0 14 7
从表 4 看 出 , 长 白松 自然群体 的遗传变异 型为 凡 “ 0 .3 15 7 和 D , , = 0 .0 29 ;5
价 = 0 . 34 52 和 玩: 二 .0 085 5 。 即群体内平均多样性 几 = 0 . 3 1 5 7 比群体间的基因多样性
分化系数 乓 , = .0 085 7。 换言之 , 大约总基因多样性的 9%属于群体间的差异 , 而总 的
基因多样性的 91 % 在群体内 .
3 结论和讨论
1 1 长白松 自然群体内的多态位点比例 (川 为 0 . 63 。 平均杂合度 ( eH ) 为 .0 31 6,
第 5期 杨一平等 :长白松 自然群体同功酶遗传多样性的研究
每个位点平均等位基因数 ( A /功 为 2 .1 9.这些数位表明长白松 自然群体内多样性水
平是比较高的 .它抵得上表 5中列举的一些种 .
表 5群体内基因变异和基因多样性各度呈值比较
基因多样性各度盘值
资 料 来 源
月 /L
位点群 数休数
Pln suo l月 ge a v a
Pr韶扭 o s a
P
.
sy l ve s zr臼
P
·
n lg r a
尸 .ko ra切肚臼
P
.
sy le v st r l f
o r m臼
54 1
5 9
3 02 7
. 0 0 0
0
.
3 1 8
02 72
3 7 04
3 01 6
0
.
2 7 83 5
0
.
0 01
.
0 0
1
.
0 04
.
8 0
0
.
6 63
.
02
0
.
7 6
·
2
.
25
0
.
3 62
.
1 9
Ha而 ie k, 1 9 7 9
F o w le r a n d M o币 s , 1 9 7 7
H
a m r ie k
,
1 9 7 9
N ik o lie a
n d T u e ie
,
19 8 3
杨一平等 . 1 98 9
本文的研究资料
4,
了n石,且凡乙
长白松 自然群体遗传变异型为 ( H : ) = o , 345 和 ( G, , ) = 0 . 0 86 . 即总的基因多样性
91 % 在群体内 , 只有 9% 在群体间 。 这种变异型与其他针叶树的通常型类似 . (见
表 ` 群体间基因分化程度和基因多样性分析比较
基因多样性参数
叨习 了 r 二I二 嘴口 二生二 一 - 一一 夕蔺冲 Jf刁屯以叭
H T 凡 ` , 料来
极长寿 , 异交 0 . 4 6 5
极长寿 , 异交
异交
异交
异交
异交
异交
0
.
4 8 4
0
.
3 8 4
0 3 2 6
0
.
2 8 9
0
.
3 0 7
0
.
3 4 5
0
.
3 7 4
0
.
2 7 0
0
.
2 8 5
0
.
3 0 2
0鸿5 1
0 3 1 8
0
.
0 3 8
0
.
0 10
0
.
1 3 5
0
.
0 15
0 0 17
0
.
0 8 6
H a m
r ie k
,
19 8 6
杨一平等 , 19 8 9
N i k o li
e a n d T o e ie
,
1 9 8 3
H a m r ick
,
1 9 8 6
G u l b e r g
, e t a l
.
19 8 5
Y az d a n i
, e t a l
.
1 9 8 5
H a m r ie k
, e t a l
.
19 7 9
本文的研究资料
寿
寿 , 异交 0 3 1 6
长
P i n u s lo n g a e v a
尸 . 尤口r a 扭肚臼
尸 . 月才盆r a
P
.
P o 摊 de r o s a
P
. 砂 Iv e s t r 臼
P
.
yS lv e s r r 七
P
.
yS lv e s t r 臼
P
.
yS lv e s t r if
o
rm 臼
3 .3 长白松 自然群体遗传分化 , 从表 6 中看出 , 其群体间遗传分化只低于 尸 . m gr a ,
高于其他几个种 , 特别高于近缘种的 尸 . sy vl es tr is 和生长在同一地区的 尸 . k or a ie 二认
长白松两个群体遗传距离 D = .0 06 也高于 尸 . k or a 记ns is 的 D = 0 . 2 . 造成上述情况 , 除
自然选择起作用外 , 也有轻微的基因频率随机漂移的作用 . 因胡枝子一长白松林是经火
烧后残存母树天然更新的幼林 。 它完整的基因综合体内部机制较弱二如 G o T 一 B : 等位
基因频率为 0 . 0 34 , 它只是越桔一长白松林的 G O T 一B ;等位基因频率 0 . 0 94 的 1 / 3 .
3 A 从引用的资料和笔者的研究资料分析比较看 , 虽然采用的酶类 、 酶的数量 、 群
休数 、 位点数和等位基因不同 , 但大体上看出 , 长白松自然群体多样性的丰富度是比较
高的 , 并有一定程度分化 。 这就为异地保存长白松基因资源的规模 、 布局 、 取样策略和
对策 , 以及扩大栽培长白松提供基础资料和科学依据 。
24 东 北 林 业 大 学 学 报 第 9 1卷
参 考 文 献
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第 5 期 杨一平等 : 长白松自然群体同功酶遗传多样性的研究 2 5
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PO PUL A T I O N S O F P石V US S Y L V ES Z ,R I F O R五了不S
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