全 文 ：草麻黄补体抑制成分在大鼠急性脊髓损伤中的作用
李良满1，李静波2，朱悦1
（中国医科大学附属第一医院 1.骨科；2.感染科，沈阳 110001）
摘要 目的 探讨草麻黄补体抑制成分在大鼠急性脊髓损伤中的作用。方法 应用多步沉淀和薄层层析方法进行草麻黄补体
抑制成分的提纯并进行活性鉴定；参照改良的 Allen’s重物打击法制备大鼠脊髓损伤模型；应用 CH50法测定血清总补体溶血
活性；应用实时 PCR技术检测细胞间黏附分子 1（ICAM-1）mRNA的表达；采用运动诱发电检测评定脊髓损伤后的神经功能。结
果 在伤后 12 h、1 d、3 d、7 d、14 d各个时间点，实验组 CH50比值和 ICAM-1 mRNA表达均低于对照组（P < 0.01）。伤后 7 d
和 14 d，实验组脊髓运动诱发电位潜伏期和波幅显著优于对照组（P < 0.01）。结论 草麻黄补体抑制成分能够显著减轻脊髓损
伤后的免疫炎性反应，在继发性脊髓损伤中起到重要的保护作用。
关键词 草麻黄；脊髓损伤；炎症；诱发电位
中图分类号 R338 文献标志码 A 文章编号 0258-4646（2011）05-0405-03
doi CNKI：21-1227/R.20110523.1816.029
网络出版地址 http://www.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20110523.1816.029.html
Effect of Inhibiting Component of Complement in Ephedra Sinica on Acute Spinal Cord Injury in Rats
脊髓损伤继发性损伤机制复杂，目前临床上还
缺乏有效的治疗药物，免疫炎性反应是重要损伤机
制之一，脊髓损伤后存在补体系统的激活，并且补体
系统激活后产生的活性片断及最终产物均可引起和
加重损伤组织的免疫炎性反应，通过抑制补体系统
激活而减轻免疫炎性反应有望成为脊髓损伤新的治
疗策略［1，2］。本研究探讨中药草麻黄（Ephedra sini－
ca，ES）提纯的补体抑制成分对大鼠急性脊髓损伤后
免疫炎性反应及神经功能的影响，为急性脊髓损伤
的抗补体治疗提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 草麻黄补体抑制剂的提纯
应用多步沉淀及薄层层析方法进行草麻黄补体
抑制成分的提纯并进行活性鉴定。 1 kg草麻黄加
入 pH4.0的蒸馏水 10 L，煮沸 1 h，过滤除渣，加入 1
mol/L NaOH调整 pH值至 9.0，室温搅拌孵育 1 h，离
心，洗涤沉淀 3次，室温烘干得到棕褐色粗品共 18.5
g。取 3 g粗品溶于 pH4.0的蒸馏水 50 mL中，煮沸
1 h，离心弃上清，溶于 pH 9.0的蒸馏水中，调整 pH
值至 4.0，进行薄层层析，分离提取抗补体成分。
1.2 实验动物分组及脊髓损伤模型制备
健康 SD大鼠 50只，SPF级，雌雄不拘，体质量
250~300 g。采用改良的 Allen’s重物打击法［3］方法
制备大鼠脊髓急性损伤模型，损伤部位为 T10节段。
随机分为 2组，每组 25只。实验组：分脊髓损伤后
LI Liang-man1，LI Jing-bo2，ZHU Yue1
（1. Department of Orthopedics；2. Department of Infectious Disease，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）
Abstract Objective To investigate the effect of complement inhibiting component of Ephedra sinica on acute spinal cord injury in rats.
Methods The inhibiting component of complement in Ephedra sinica was isolated and purified by multiple precipitative steps and thin lay－
er chromatography，the activity was evaluated. Induction of spinal cord injury was performed following a modified Allen’s weight-drop method.
CH50 method was used for Measurement of complement hemolytic activity. ICAM-1 mRNA level was evaluated by real time PCR technique.
Results CH50 and ICAM-1 mRNA levels were significantly reduced in the Ephedra sinica group compared with the Control group at 12h，
1，3，7，14d after spinal cord injury. On the 7th and 14th day，the levels of latency and amplitude in Ephedra sinica group were significantly
better than those of Control group （P < 0.01）. Conclusion The inhibiting component of complement in Ephedra sinica significantly re－
duced immunological inflammation after spinal cord injury，and played an important protective function in secondary spinal cord injury.
Key words Ephedra sinica；Spinal cord injury；Inflammation；Evoked potential
基金项目：辽宁省科学技术计划项目（2010225034）
作者简介：李良满（1971 -），男，副教授，博士.
通讯作者：朱悦，E-mail：yuezhudr@163.com
收稿日期：2011-01-17
网络出版时间：2011-05-18 15: 25
中国医科大学学报 第 40卷 第 5期 2011年 5月
Journal of China Medical University Vol.40 No.5 May 2011 405· ·
12 h、1 d、3 d、7 d、14 d五个时间点，每个时间点 5
只，伤后 1 h给予提纯的补体抑制成分（15 mg/kg）溶
于 5 mL生理盐水，强制灌胃，每日 1次。对照组：时
间点及动物数量同前，以同样方法给予等量生理盐
水灌胃。
1.3 血清总补体溶血活性测定
应用 CH50法进行血清总补体溶血活性测定。
在大鼠脊髓损伤前 1 h、伤后 12 h及伤后 1~14 d，尾
静脉抽血 0.3 mL，离心，取上清，-20℃保存备用。制
备 2%绵羊红细胞悬液，溶血素效价测定，制备 50%
溶血标准管，然后将各浓度梯度反应体系置于微量
板孔中，反应完毕后在 541 nm波长处测吸光度，计
算待测血清的 CH50值并与损伤前血清样品的基础
值比较，计算百分比值。
1.4 细胞间黏附分子 1 （intercellular adhesive
molecule-1，ICAM-1）mRNA的检测
应用实时 PCR 方法检测损伤组织中 ICAM-1
mRNA的表达。2组动物于伤后每个时间点各取 5
只再次麻醉，以伤处 T10为中心取约 100 mg脊髓损
伤组织，应用 Trizol法提取总 RNA，并进行 RNA纯
度及浓度检测，逆转录 cDNA合成，应用 Premier 5.0
设计引物序列。以管家基因 GAPDH作为内参。操作
严格按照说明书进行。ICAM-1正义引物：5′-TGCC
TACCCTCCCACAACAG-3′，反义引物 5′-ATACTATG
TGGACGAGCATGT-3′，320 bp；GAPDH正义引物：
5′-AGTTCAACGGCACAGTCAAGG - 3 ′，反义引物
5′-AGACTCCACGACATACTCAGC-3′，283 bp。应用
LightCyclerⅡ PCR检测仪进行检测，绘制融解曲线，
PCR专用分析软件根据标准品的 Ct值制作标准曲
线，计算每个样本原始拷贝数，然后计算样品基因校
正后的相对含量。
1.5 运动诱发电位检测
参照 Lee［4］的方法检测脊髓运动诱发电位（mo－
tor evoked potential，MEP），各组大鼠分别于脊髓损
伤前 0.5 h及伤后 12 h、1 d、3 d、7 d、14 d行 MEP检
测，检测在铜网屏蔽下进行。大鼠麻醉后，将刺激电
极阴极刺于 T5~6间隙、阳极刺于 T7~8间隙，刺激类型
为方波脉冲电流，波宽 0.1 ms，强度 100~150 mV，滤
波带通过 2 Hz~10 kHz。电位记录仪采集信号并贮
存，专用软件分析和测量其潜伏期（latency，LT）和波
幅（amplitude，AM）。将损伤前 MEP的测量值作为基
础值，以百分比表示损伤前后的电位变化。
1.6 统计学分析
所有数据均用 x ± s表示，应用 SPSS 13.0统计
分析软件，各时间点组间首先行方差齐性检验，然后
行 t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 血清 CH50测定结果
实验组和对照组伤后早期血清 CH50比值迅速
下降，约在伤后 1 d 达到最低值，分别 29.05%±
2.08%和 24.08%±2.31%；伤后 3~7 d快速上升，以后
缓慢回升，伤后 14 d 对照组 CH50 接近伤前水平
（98.21% ± 1.12%），而实验组仅达到伤前的 75%左
右。伤后 12 h及伤后 1~14 d各个时间点实验组的
CH50比值均低于对照组，有统计学差异（P < 0.05）。
2.2 ICAM-1 mRNA检测结果
脊髓损伤后，实验组及对照组 ICAM-1 mRNA
相对含量开始升高，约在伤后 3 d达到高峰，之后开
始逐渐下降，存在一个动态变化过程。伤后各个时
间点实验组 ICAM-1 mRNA 相对含量均低于对照
组，差异有统计学意义（P < 0.01）。见图 1。
2.3 MEP检测结果
实验组及对照组在伤后早期 AM值快速下降，
仅达伤前正常值的 15%左右，而且 LT值明显延长，
较伤前正常值延长约 30%。随着时间的延长，AM值
开始快速回升，LT值亦逐渐缩短。伤后 14 d，对照组
AM值回升到伤前正常值的 73%，实验组 AM值回
升到了 80%，2组的 LT值亦逐渐缩短。伤后 12 h~3
d，2组的电生理检测指标无明显差别；伤后 7 d和
14 d，实验组电生理检测指标显著优于对照组（P <
0.01）。见图 2。
* P < 0.01 vs control group.
图1 实验组及对照组脊髓损伤后各个时间点ICAM-1m RNA 相对
含量
Fig.1 Relative value ofICAM-1m RNA in ES group and control
groupatalltim epointsafterinjury
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
IC
AM
-1
m
RN
A
ES group
Control group
0.5 1 3 7 14
Days after spinal cord injury
中国医科大学学报 第 40卷406· ·
*P < 0.01 vs control group.
图2 脊髓损实验组和对照组伤后各个时间点M EP 检测结果
Fig.2 Results ofM EP in ES group and controlgroup atalltim e
pointsafterinjury
3 讨论
脊髓损伤作为一种严重的创伤，可以激发机体
引起损伤组织强烈的免疫炎性反应。从严格意义上
来讲，脊髓损伤后免疫炎性反应是一把双刃剑。一
方面该过程可以清除坏死组织，促进组织细胞增生
和创面修复。另一方面，严重的创伤时存在炎性反
应的过度激活，这将导致脊髓组织进一步的损伤，妨
碍脊髓组织的修复和神经元的再生，导致神经元、神
经胶质细胞等继发性的坏死和凋亡，从而阻碍损伤
后神经功能的恢复［5］。
脊髓损伤后免疫炎性细胞的聚集受多种蛋白质
的调控，ICAM-1又名 CD54，是淋巴细胞功能相关抗
原 l的细胞表面配基。ICAM-1可促进中性粒细胞对
组织的浸润而增强免疫应答，促进中性粒细胞和内
皮细胞相互作用，这些因素共同导致中性粒细胞浸
润和活化。本研究应用实时 PCR技术检测了脊髓损
伤后脊髓组织 ICAM-1 mRNA的表达，结果表明，实
验组在各个时间点 ICAM-1 mRNA相对含量均低于
对照组，提示该补体抑制剂对脊髓损伤组织中
ICAM-1 mRNA表达具有的显著抑制作用，证明了其
对免疫炎性反应的抑制作用。
近几年来，通过抑制补体激活机制抑制脊髓损
伤后的免疫炎性反应已经成为脊髓损伤实验性治疗
的一个重要策略和热点方向。Reynolds等［6］发现痘
病毒补体调控蛋白能够显著抑制大鼠脊髓损伤后的
补体表达，减轻脊髓损伤。Qiao等［7］的研究表明，补
体经典途径与旁路途径在脊髓损伤中起到重要作
用，抑制补体激活可减轻损伤组织炎性反应，保护脊
髓功能。Tei等［8］研究发现，补体 C1酯酶抑制剂能
够显著抑制补体系统激活，保护神经功能。作者在
前期的研究中亦发现，重组可溶性补体受体 I型可
显著抑制大鼠脊髓损伤后的补体激活，抑制免疫炎
性反应，对神经功能发挥显著的保护作用［9］。
本研究采用 MEP评价脊髓损伤损伤后的运动
功能，使研究结果更加客观可靠。结果表明，实验组
在伤后 7 d和 14 d电生理检测指标显著优于对照
组，提示该补体抑制成分通过抑制脊髓损伤后的免
疫炎性反应对神经功能发挥显著的保护作用。该研
究为急性脊髓损伤的抗补体治疗提供了理论依据。
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（编辑 陈 姜，英文编辑 刘宝林）
100
80
60
40
20
0
AM
/%
0.5 1 3 7 14
Days after spinal cord injury
ES group
Control group
0.5 1 3 7 14
Days after spinal cord injury
150
100
50
LT
/%
李良满等. 草麻黄补体抑制成分在大鼠急性脊髓损伤中的作用第 5期
ES group
Control group
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