全 文 ：生　物　技　术 2010年 20(2)　
蝴蝶兰叶片外植体在离体培养过程中发生的褐变 , 说明外施
柠檬酸和抗坏血酸能抑制褐变。
图 3　不同波长下褐变抑制剂柠檬酸(A)和抗坏血酸(B)对儿茶酚和
醌类物质积累的比较
Figure3　Comparisonofcatecholandquinineformationaccumulationby
theinfluencesof2mmol/Lcitricacid(A)and0.5mmol/Lascorbicacid
(B)at295nm, 525nmand325nmrespectively
100mg/L柠檬酸和 50mg/L抗坏血酸处理蝴蝶兰叶片外
植体 , 能降低 PPO的酶活性。柠檬酸是属于金属螯合剂 , 有时
候也在组织培养过程中作为抗氧化剂使用 [ 5 , 6] , 理论上可以抑
制 PPO的酶活 ,本实验也证明了柠檬酸在抑制 PPO酶活上起
到一定的作用。而抗坏血酸是强还原剂 , 在对抗 PPO酶促反
应中的氧化过程效果显著 , 因此酶活抑制效果较好。在张艳
等的白头蒜褐变研究中 , 他们也使用了柠檬酸与抗坏血酸等
PPO氧化抑制剂 , 我们的实验结果与他们的基本一致 [ 11] 。
分光光度法分析方法在实验过程中发现灵敏性好 、重复
性高 , 用在柠檬酸 、抗坏血酸的抗褐变机理分析 , 配合凝胶过
滤色谱可更深入地研究。根据(图 3A、B)结果 ,推测柠檬酸是
通过阻止儿茶酚向醌类物质转变 , 有可能直接与酶蛋白作用
抑制 PPO活性。
Arias等指出抗坏血酸可以通过两种机制影响梨片褐变发
生:没有酶底物时 , 抗坏血酸与 PPO活性位点结合起抑制作
用;在底物存在下 , 抗坏血酸还原被 PPO氧化的产物 [ 12] 。本
实验的底物为儿茶酚 , 抗坏血酸可能通过与新生醌类物质结
合抑制酶活性 , 从而抑制褐变。
参考文献:
[ 1]付影 ,荣俊东 , 陈礼光 , 等.植物组织培养中褐变问题研究进展
[ J] .亚热带农业研究 , 2007, 3(3):190-195.
[ 2]许传俊 ,李玲.蝴蝶兰外植体褐变发生与总酚含量 、PPO、POD和
PAL的关系 [ J] .园艺学报 , 2006, 33(3):671-674.
[ 3]刘金光 ,黄寿先 ,刘芳 ,等.大叶栎组织培养中外植体褐变的初步研
究 [ J] .安徽农业科学 , 2009, 37(16):7343-7344.
[ 4]田佶 ,付塽 ,杨爱珍 ,等.果桑侧芽生长点组织快繁初探 [ J] .中国
农学通报 , 2008, 24(7):231-234.
[ 5]周音 ,张智奇 , 张建军 , 等.3种抗氧化剂对茶条槭(Acerginnala
Maxim.)组织培养污染及褐化的影响 [ J] .上海农业学报 , 2007, 23
(1):5-7.
[ 6]张智 ,邵菊芳 ,滕婷婷 ,等.抗氧化剂对银杏愈伤组织褐变的影响
[ J] .安徽农业科学 , 2008, 36(30):13051 - 13052 , 13082.
[ 7]陈冬茵 ,赖艳艳 ,许传俊 , 等.多酚氧化酶抑制剂对蝴蝶兰叶外植
体褐变的影响 [ J].亚热带植物科学 , 2009, 38(2):15-18.
[ 8]梁丽雅 ,闫师杰 ,陈计峦 , 等.鸭梨采后果实褐变的主要因素研究
[ J] .食品与机械 , 2008, 24(3):48-51.
[ 9]罗晓芳 , 田砚亭 , 姚洪军.组织培养过程中 PPO活性和总酚含量
的研究 [ J].北京林业大学学报 , 1999, 21(1):92-95.
[ 10]孔维宝 ,陆健 ,赵海锋 ,等.L-半胱氨酸抑制多酚氧化酶的机制
研究 [ J].食品科学 , 2007, 28(11):66-70.
[ 11]张艳 , 韩天龙.白头蒜氧化褐变主酶(PPO)的特性及氧化抑制剂
分析 [ J].农产品加工·学刊 , 2009, (2):85-87.
[ 12] Arias, E.Gonzalez, J.Peiro, J.M.Oria, R, etal.Browningpreven-
tionbyascorbicacidand4-hexylresorcinol:diferentmechanismsofaction
onpolyphenoloxidaseinthepresenceandintheabsenceofsubstrates[ J] .
JFoodSci., 2007, 72(9):C464-70.
草麻黄植株再生体系的建立
张红梅 1 ,蔡宝宏 2 ,王明艳 1(1.华北煤炭医学院 生物科学系 河北唐山 063000;2.唐山市第一中学生物组 , 河北 唐山 063000)
摘要:目的:以草麻黄的子叶为材料 ,建立草麻黄植株再生体系。方法:采用组织培养的方法进行了愈伤组织诱导 、愈伤组织
分化和不定芽生根研究。结果:MS+2, 4-D2.0mg/l+6-BA1.0mg/l为诱导子叶形成具有分化能力愈伤组织的理想培养基;
MS+2, 4-D1.5mg/l+6-BA1.5mg/l是愈伤组织的最佳继代培养基;MS+IAA0.2mg/l+TDZ2.0mg/l是愈伤组织不定芽分化
的最佳培养基 , 分化率为 75%;试管苗生根培养基为 MS+2, 4-D1.0mg/l。结论:建立了草麻黄子叶再生系统 , 为开发和保护麻
黄野生资源提供一定的材料来源和技术方法。
关键词:草麻黄;组织培养;愈伤组织;植株再生
中图分类号:Q949　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2010)02-0072-03EstablishmentofRegenerationSystemofEphedraesinicaStapf
ZHANGHong-mei1 , CAIBao-hong2 , WANGMing-yan1
(1.DepartmentofBiologicalScience, NorthChinaCoalMedicalColege, Tangshan, Hebei063000, China;
2.TheFirstMiddleSchoolofTangshan, Tangshan063000, China)Abstract:Objective:ToestablishtheregenerationsystemofEphedraesinicaStapfcotyledon.Method:Theconditionsneededincalus
induction, differentiationandadventitiousbudrootingofEphedraesinicaStapfcotyledonhavebeenstudied.Result:TheresultsshowedthatthebestmediumforcalusinductionwasMS+2, 4-D2.0mg/l+6-BA1.0mg/lwithabilityofdifferentiation.ThebestmediaofcallusgenerationwasMS+2, 4-D 1.5mg/l+6-BA1.5mg/l.ThebestmediaofdifferentiationwasMS+IAA 0.2mg/l+TDZ2.0
mg/l, differentiationrateis75%;ThemediaofrootgenerationwasMS+2, 4-D1.0mg/l.Conclusion:TheregenerationsystemofEphedraesinicaStapfcotyledonwasestablished.ThistestprovidedmaterialsourceandtechniquemethodforprotectingofnaturalresourcesofHerbaEphedrae.
Keywords:EphedraesinicaStapf;tissueculture;callus;plantletgenetration
收稿日期:2009-10-16;修回日期:2009-11-04
资助项目:河北省教育厅项目(2008141);河北省唐山市科技项目
(09130202A-3-1)资助
作者简介:张红梅(1977-),女 ,唐山人 ,硕士 , 讲师 , 从事植物基因工
程与分子生物学研究 ,发表论文 10余篇。
　　麻黄(HerbaEphedrae)作为一种传统中药材 , 至今已有
4000多年的应用历史 , 性温 、味辛 、微苦 , 具发汗解表 、宣肺平
喘 、利水消肿的功效。目前已从麻黄植物体中分离提取出多
种成分。多年来由于市场需求的原因 , 对麻黄碱的提取一直
72
DOI :10.16519/j.cnki.1004-311x.2010.02.023
　2010年 20(2) 生　物　技　术　
以野生资源为原料 ,导致野生资源的滥采滥挖严重 , 生态环境
受到严重破坏 , 致使天然麻黄资源受到严重破坏。为了保护
野生麻黄资源 , 在麻黄野生资源限制采挖后 , 鼓励人工种植麻
黄 , 而人工种植麻黄的种源主要依靠采集野生种子育苗 , 野生
种源是一混杂的群体 ,致使麻黄的栽培品种在形态 、生长发育
及其有效成分上都存在差异 , 影响麻黄的产量和质量 [ 1] 。因此
利用组织培养更加方便 、快捷 、大量的得到麻黄有效成分具有
广泛的应用前景。有关麻黄的组织再生培养报道较少 , 本文以
草麻黄无菌苗子叶为外植体 , 建立了草麻黄植株再生体系。
1　材料与方法
1.1　材料
挑取饱满的草麻黄种子 ,剥去种子的外壳 , 在 70%酒精中
浸泡 10min、0.1%升汞消毒 8min、而后用无菌水冲洗干净 , 无
菌滤纸吸干 , 接种到不含任何激素的 MS培养基上萌发。待无
菌幼苗长到 5cm左右时 ,取子叶为外植体 ,进行愈伤组织诱导
培养。
1.2　培养条件
以 MS为基本培养基 , 附加不同种类和质量浓度的细胞分
裂素和生长素 , 固体培养基为 0.8%的琼脂粉 , 蔗糖 30mg/l,
pH5.8 ～ 6.0。光照 12h/d, 温度 25℃左右。
2　结果与分析
2.1　草麻黄种子的处理
最初将草麻黄种子直接在 70%酒精中浸泡 20min、 0.1%
升汞消毒 10min,然后接种在不含任何激素的 MS培养基中 ,
结果在萌发的过程中 , 总是有部分存在于种壳内的种子自身
的菌没有杀死 , 导致培养基感染。为此实验时将草麻黄种子
的外壳去掉 , 同样采用上述消毒方法 , 便可以进行彻底地消
毒 , 防止种子萌发期间感染。
2.2　不同激素组合对愈伤组织诱导的影响
把草麻黄无菌苗子叶切成 0.5cm的外植体 , 分别接种在
不同激素配比的培养基中 ,每种激素组合接种 5平皿 , 每平皿
接种 8个外植体 ,接种的总个数均为 40个 , 愈伤组织诱导率见
表 1。
表 1　不同激素组合(mg/l)及其配比的草麻黄愈伤组织诱导率
Tab.1　InductionrateofdiferentvarietiesofEphedraesinicaStapfcalus
atdiferenthormonecombinations
序号 激素组合 接种个数 愈伤组织数 诱导率(%)
1 2, 4-D1.0 + 6-BA0.5 40 13 32.5
2 2, 4-D2.0 + 6-BA0.5 40 26 65
3 2, 4-D2.0 + 6-BA1.0 40 31 77.5
4 2, 4-D1.0 +KT0.2 40 4 10
5 2, 4-D1.5 +KT0.2 40 9 22.5
6 2, 4-D2.0 +KT0.2 40 6 15
7 NAA2.0+6-BA0.5 40 15 37.5
8 NAA2.0+6-BA1.0 40 24 60
9 NAA3.0+6-BA0.5 40 16 40
10 NAA2.0+6-BA0.2 40 17 42.5
　　从表 1可知 , 2, 4-D与 KT组合 , 愈伤组织的诱导率均不
高;2, 4-D与 6-BA组合 , 是激素组合中愈伤组织诱导率最
高的 , 但当 2, 4-D浓度为 2.0mg/l时 , 所诱导的愈伤组织质
地疏松 , 适宜进行分化研究。 NAA与 6 -BA组合 , 愈伤组织
诱导率也较 2, 4-D与 6-BA组合低 , 而且愈伤组织发生较
慢 , 因此确定最适合草麻黄愈伤组织诱导的培养基为 MS+2,
4-D2.0mg/l+6-BA1.0mg/l。此外 ,在实验过程中还发现 ,
6-BA对于保持愈伤组织的活力起到关键作用 , 缺乏 6-BA
的培养基中 , 接种上的子叶虽然也可诱导出愈伤组织 , 但随着
培养时间延长 , 有的子叶枯死 , 有的愈伤组织颜色发白 , 质地
特别软 , 不适宜进行继代培养。
2.3　愈伤组织的继代培养
将 3号培养基中的愈伤组织接种到含不同质量浓度激素
的 MS培养基上 ,进行继代培养 , 24d后根据愈伤组织的生长
倍数确定最佳激素配比条件。愈伤组织生长倍数 =(生长后
重量 -接种量)/接种量。结果如表 2所示。
表 2　不同激素组合(mg/l)及其配比对草麻黄愈伤组织继代的影响
Tab.2　Efectsofdiferenthormonecombinationsoncalusgenerationof
EphedraesinicaStapf
序号 激素组合(mg/l) 生长倍数
1 MS+2, 4-D1.0 + 6-BA0.5 12.1
2 MS+2, 4-D1.0 + 6-BA1.0 12.4
3 MS+2, 4-D1.5 + 6-BA1.5 14.2
4 MS+2, 4-D2.0 + 6-BA1.0 10.3
5 MS+2, 4-D2.0 + 6-BA2.0 11.6
　　由表 2可知 ,在 1 ～ 5号培养基上生长的愈伤组织生长倍
数 ,经过 X2检验(p>0.05)无显著性差异 ,但综合来看 , 3号培
养基中生长的愈伤组织生长倍数较其它培养基中的愈伤组织
高 ,且生长状态较好 , 利于进行愈伤组织的分化研究 , 因此认
为 3号培养基为草麻黄愈伤组织最佳继代培养基。
2.4　愈伤组织的分化培养
将表 2中 3号培养基上诱导的颗粒状愈伤组织接种到附
加不同质量浓度 TDZ、6-BA、IAA和 NAA的 MS培养基上 ,进
行愈伤组织的分化培养 , 18d时可见形成分化的芽点 , 50d后
可见形成丛生不定芽。由表 3可知 , 在不含任何激素 、只含一
种浓度激素 、含不同质量浓度的 2, 4-D与质量浓度的 6-BA
和 KT配合使用的培养基 、以及 0.1mg/lIAA或 0.1mg/lNAA
和 2.0mg/l6-BA、NAA与 TDZ配合使用的培养基 , 愈伤组织
不能分化。而在含不同质量浓度 IAA(0.1mg/l和 0.2mg/l)、
NAA(0.1mg/l)与 6-BA(3.0mg/l)组合 , 以及 TDZ与 IAA的
组合培养基中 , 愈伤组织具有不同程度的分化 , 但分化率及分
化不定芽的长势有别。在 15号培养上进行分化培养的愈伤
组织 , 不仅分化率为 75%, 而且分化不定芽的长势好。在 15
号培养基上分化培养的愈伤组织 , 培养 30d时 50%均分化出
不定芽 , 50d后分化培养的不定芽可成丛生状。因此 ,把 MS+
IAA0.2mg/l+TDZ2.0mg/l作为草麻黄愈伤组织不定芽最佳
分化培养基。
表 3　不同质量浓度的激素对草麻黄愈伤组织分化的影响
Tab.3　Effectofdiferentconcentrationhormoneoncalusdiferentiationof
EphedraesinicaStapf
编号 培养基激素组合(mg/l) 接种颗粒(个) 分化率(%) 长势
1 MS 100 0 -
2 MS+6-BA0.5 100 0 -
3 MS+6-BA1.0 100 0 -
4 MS+6-BA1.5 100 0 -
5 MS+6-BA2.0 100 0 -
6 MS+2, 4-D0.1 +6-BA2.0 100 0 -
7 MS+2, 4-D0.1 +6-BA3.0 100 0 -
8 MS+2, 4-D0.1 +KT2.0 100 0 -
9 MS+2, 4-D0.1 +KT3.0 100 0 -
10 MS+IAA0.1 +6-BA2.0 100 0 -
11 MS+IAA0.1 +6-BA3.0 100 21 +
12 MS+IAA0.2 +6-BA3.0 100 33 ++
13 MS+NAA0.1 +6-BA2.0 100 0 -
14 MS+NAA0.1 +6-BA3.0 100 17 +
15 MS+IAA0.2 +TDZ2.0 100 75 +++
16 MS+IAA0.1 +TDZ3.0 100 16 +
17 MS+IAA0.2 +TDZ3.0 100 54 ++
18 MS+NAA0.1 +TDZ2.0 100 0 -
19 MS+NAA0.1 +TDZ3.0 100 0 -
　　TDZ作为一种新型的植物生长调节剂 , 由于其有利于诱
导不定芽的分化 , 已广泛应用于各种植物的组织培养过程
中 [ 2-5] 。草麻黄的再生频率与 TDZ和生长素的配合使用有
关 ,也与 TDZ的浓度有关 , 在草麻黄的组织培养过程中 , TDZ
浓度过高 , 易出现不定芽褐化现象 , 且成苗率低。这与郭敬丽
等的研究结果一致 [ 5] 。所以在不过于降低再生率的前提下应
尽量减少 TDZ的使用。
73
生　物　技　术 2010年 20(2)　
2.5　不定芽的分化继代培养
将在 15号培养基上分化培养的不定芽从基部切下 , 接种
到相同的培养基上 ,进行不定芽的分化继代培养 , 经过 3次重
复实验 , 每次继代 3代的结果表明 , 不定芽继代培养的周期为
30 ～ 35d, 每个培养周期每个不定芽平均可分化出 3.6个长势
较旺盛的不定芽 。
2.6　不定芽的生根培养
将在 15号培养基上分化继代培养的 、高约 0.6cm以上的
不定芽从基部切下 , 接种到附加不同质量浓度 IBA、2 , 4-D、
和 IAA的 MS培养基上 ,进行生根培养。 15d后在 2号培养基
上(见表 4)可见不定芽基部产生不定根 , 但生长状态不好 , 根
较细长。 20d后 7号培养基上也见不定芽基部有不定根 , 但长
势更弱。 30d后统计不定芽的生根率 , 2号培养基中为 12%, 7
号培养基中为 5%。在其它的培养基上均难以诱导不定芽生
根。尽管在 2号培养基中有不定芽生根形成了试管苗 , 但生
根率很低 , 而且长势不好 , 无法进行试管苗的移栽。
3　讨论
本研究以草麻黄的子叶为外植体 , 成功地诱导了愈伤组
织 , 高效分化的愈伤组织为该植物转基因研究提供了理想材
料。利用愈伤组织进行基因水平的研究 , 建立草麻黄资源信
息库 , 对筛选优良性状 、改善品质起到影响。此外 , 以愈伤组
织为材料 , 建立愈伤组织悬浮培养体系 ,通过液体悬浮培养提
取得到更高的次生代谢药用产物 , 因此麻黄愈伤组织培养成
为麻黄离体培养能否应用到实际生产中的关键。
实验建立了草麻黄植株再生体系 , 草麻黄子叶诱导产生
的颗粒状愈伤组织 , 在 MS+IAA0.2mg/l+TDZ2.0mg/l培养
基上分化率达 75%。对由愈伤组织分化的不定芽在相同培养
基上进行分化继代培养 , 培养 30d时 50%均分化出不定芽 ,
50d后分化培养的不定芽可成丛生状。 通过这种人工方法可
以繁殖出大量的草麻黄无性系 , 可为草麻黄栽培提供优质种
苗。此外 , 还有必要进一步探索使用 TDZ直接诱导产生草麻
黄不定芽 , 从而缩短再生植株的产生时间。
组织培养过程中得到的草麻黄不定芽 , 生根较难 , 生根率
仅为 12%。木本植物在组织培养过程中一般生根较难 , 因此 ,
还需要作深入的研究找到麻黄的最佳生根培养条件 , 提高生
根率 ,从而进行试管苗的移栽及工厂化繁殖。
表 4　不同质量浓度的激素对草麻黄生根的影响
Tab.4　Efectofdiferentconcentrationhormoneonrootgenerationof
EphedraesinicaStapf
序号 培养基和激素组合(mg/l) 接种不定芽数 生根率(%)
1 MS+2, 4-D0.5 100 0
2 MS+2, 4-D1.0 100 12
3 MS+2, 4-D1.5 100 0
4 MS+2, 4-D2.0 100 0
5 MS+IBA 0.5 100 0
6 MS+IBA 1.0 100 0
7 MS+IBA 1.5 100 0
8 MS+IBA 2.0 100 0
5 MS+IAA0.1 100 0
6 MS+IAA0.5 100 0
7 MS+IAA1.0 100 5
8 MS+IAA1.5 100 0
9 MS+IAA2.0 100 0
参考文献:
[ 1]吴海 ,易伦朝 ,高敬铭.野生与人工栽培麻黄不同部位成分的比较
研究 [ J].中草药 , 2007, 38(9):1298-1301.
[ 2]胡钠梅 , 韩素英,梁国鲁.TDZ诱导中间锦鸡儿植株再生 [ J].北方
园艺 , 2009, (8):204-205.
[ 3]王静华 , 侯建生 , 刘桂林.两种不同种源地白榆的组织培养与叶片
再生研究 [ J].中国农学通报 , 2009, 25(5):110-115.
[ 4]张璐璐 ,高庆玉.草莓主栽品种高效再生体系的建立 [ J].陕西农
业科学 , 2009, 55(4):44-46.
[ 5]郭敬丽 , 王玖瑞 , 刘孟军.枣子叶再生植株研究 [ J] .河北农业大
学学报 , 2009, 32(4):26-27, 52.
向日葵花盘水溶性多糖提取工艺及抗氧化研究
索金玲 ,彭秧＊ ,朱然(新疆大学化学化工学院 ,新疆 乌鲁木齐 830046)
摘要:目的:研究了向日葵花盘中水溶性粗多糖的提取工艺及抗氧化性能。方法:采用单因素试验和 L9(34)正交试验设计 ,对多糖提取工艺进行优化 ,并采用 Fenton体系和邻苯三酚自氧化法评价了该提取物的体外抗氧化能力。结果:优化工艺条件为:
提取温度 95℃、料液比 1:20、提取时间 4h, 向日葵水溶性粗多糖得率为 9.73%, 其中温度是影响粗多糖提取的重要因素。结论:
结果表明向日葵水溶性粗多糖有较好的抗氧化活性。
关键词:向日葵花盘;多糖;提取;抗氧化活性
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2010)02-0074-04StudyonExtractionandAntioxidantActivityofPolysaccharidesfromtheDiscofSunflower
SUOJin-ling, PENGYang＊ , ZHURan(ColegeofChemistryandChemicalEngineering, XinjiangUniversity, Urumqi830046, China)
Abstract:Objective:Tostudytheoptimumextractionandatioxidativeactivityofpolysaccharidesfromthediscofsunflower.Method:The
extractionofthepolysaccharideswerepreparedbyL9(34)orthogonaltestplan.Andantioxidativeactivityoftheextractwasevaluatedbytwosystems, hydroxylradicalsystemandpyrogalolautooxidationmethods.Result:Itwasfoundthattheoptimumextractionconditionswere
asfollows:extractiontemperature95℃, material-waterratio1∶20, andextractiontime4h, therateofextractionwas9.73%, andtemper-aturewasanimportantfactorfortheextractionrateofthepolysaccharides.Conclusion:Thepolysaccharidesfromthediscofsunflower
werefoundhavestrongantioxidantactivity.Keywords:thediscofsunflower;polysaccharides;extraction;antioxidantactivity
收稿日期:2009-09-10;修回日期:2009-11-02
作者简介:索金玲(1984-),女 ,硕士生 ,研究方向:植物中有效成分提
取 、检测及应用;＊通讯作者:彭秧(1954-), 女 ,教授 , 硕士生 , 导师 ,
从事分析化学研究。
　　菊科植物向日葵因耐土地瘠薄和气候干旱 , 在中国西北
五省及内蒙 、山西等地大量种植 , 成为重要的油料作物。 然
而 ,人们仅收获向日葵种子 ,大量干缩的脱去种子后的花盘成
为垃圾被丢弃。在民间验方中 , 多有记载向日葵具有治疗疾
病的功效 , 其根 、茎 、叶 、盘均可入药 。其药性平淡味淡甘 , 无
毒 ,有驱气 ,平肝 ,清温热 ,散滞气 , 益气补肾之功 ,特别有明显
的降压作用 [ 1] 。花盘有清热化痰 、凉血止血之功 , 对头痛 、头
晕等有很好的效果 , 在民间被广泛用于治疗高血压 、哮喘等疾
74